КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 18-15-00061

НазваниеВыявление факторов, препятствующих успешной HER-таргетной терапии при раке молочной железы и разработка противоопухолевого препарата, связывающего HER-лиганды

РуководительБуздин Антон Александрович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2018 г. - 2020 г.

, продлен на 2021 - 2022. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№28 - Конкурс 2018 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-310 - Персонифицированная медицина

Ключевые словаРак молочной железы, онкология, рецептор эпидермального фактора роста, HER2, EGFR, тирозинкиназные рецепторы, предсказание результатов лечения, биомаркеры, химиотерапия, таргетные противоопухолевые препараты, факторы роста, таргетная терапия, транскриптомные исследования, сыворотка крови, рекомбинантные белки

Код ГРНТИ34.15.51

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Семейство трансмембранных рецепторов HER/HER состоит из четырех структурно сходных тирозинкиназ. У человека эти белки носят названия рецептор эпидермального фактора роста 1 EGFR (HER1) и рецепторы HER2 (Neu), HER3, и HER4. Известно несколько факторов роста, которые способны связываться и активировать рецепторы, названные HER-лигандами. Примерно 20% пациентов с раком молочной железы (РМЖ) имеют опухоль с повышенным содержанием HER2 или с амплификаций гена, кодирующего рецептор. Были разработаны препараты для блокирования активности как EGFR, так и HER2, HER-таргетные препараты. Для лечения РМЖ прошли клинические испытания гуманизированные антитела трастузумаб, кадсила и перьета, а также ингибитор тирозинкиназы, лапатиниб. Эти препараты принимают сотни тысяч больных, а их продажи составляют миллиарды долларов в год. При этом, при использовании в монотерапии, объективный ответ наблюдается у 20 - 35% пациентов, при комбинации с химиотерапией – у 50-65%. Объектом исследований в рамках проекта являются внутриклеточные и внеклеточные факторы, влияющие на ответ опухолевых клеток на применение НЕR-таргетных препаратов и молекулярные механизмы устойчивости к препаратам. Цель проекта – разработка способов отбора пациентов для применения HER-таргетной терапии для повышения ее эффективности и одновременного снижения затрат на лечение. 1) Лиганды HER и НЕR-таргетные препараты имеют одну и ту же мишень, но оказывают на рецепторы противоположное воздействие. Можно предположить, что чем выше концентрация лигандов, тем ниже будет эффективность терапии. Связь концентрации лигандов HER в периферической крови пациентов с результатами лечения РМЖ будет исследована нами для пациентов, проходящих курс таргетной терапии с использованием препарата трастузумаб. Такая связь анти-пролиферативного воздействия HER-таргетных препаратов с концентрацией лигандов HER показана нами ранее in vitro, а также, при раке легкого, с использованием образцов крови 25 пациентов. Другие исследователи также указывали на такую связь при применении препарата Эрбитукс. Мы намерены измерить концентрацию шести лигандов HER в образце периферической крови пациентов методом ИФА. Известно, что концентрация HER-лигандов различается у пациентов в тысячи раз. Мы предполагаем, что критерием для применения HER-таргетной терапии должно быть низкое содержание эндогенных лигандов HER в крови пациента (ниже пороговой величины). Пороговые концентрации лигандов будут определены в результате этого исследования. 2) Для пациентов с высоким содержанием HER-лигандов мы предложим лечение, направленное на снижение концентрации лигандов. После выполнения нашего исследования станет ясно, что временное снижение концентрации HER-лигандов на время проведения курса HER-таргетной терапии повысит эффективность лечения. Мы планируем создать рекомбинантный белок, специфически связывающий HER-лиганды. Мы испытаем, как сыворотка крови человека влияет на ингибирующее воздействие HER-таргетных препаратов эрлотиниб, гефитиниб и лапатиниб на рост клеток, имеющих происхождение от РМЖ и РЛ в присутствии в отсутствие рекомбинантного белка. Полученный белок предлагается использовать как противоопухолевый препарат для лечения РМЖ и РЛ в комбинации с ингибиторами тирозин киназы. Заметим, что в настоящее время HER-таргетная терапия не используется для лечения РЛ в 85% случаев из-за низкой эффективности. 3) Ответ опухоли на таргетную терапию может зависеть от множества факторов (белков или метаболитов), присутствующих в организме пациента. Если эти факторы препятствуют действию препарата на опухолевые клетки в организме пациента, то они могут препятствовать и действию препарата in vitro. Поэтому мы предполагаем, что влияние крови пациента на действие препарата можно быстро и недорого испытать еще до начала дорогостоящего курса терапии. А именно, мы планируем измерить ингибирующее воздействие противоопухолевых препаратов на рост клеток, чувствительных к препарату клеточных линий РМЖ. Это измерение будет проведено в присутствии сыворотки крови пациента. Если сыворотка оказывает значительное воздействие на ингибирование роста таргетным препаратом, то прогрессирование опухоли с большой вероятностью не будет подавляться этим препаратом. В этом случае мы рекомендуем отказаться от применения таргетной терапии для экономии средств и времени на заведомо неэффективное лечение. Наши предварительные эксперименты показали, что присутствие сыворотки ослабляет анти-пролиферативное действие HER-таргетных препаратов. При этом такое влияние сыворотки значимо различается между пациентами. Мы измерим анти-пролиферативное действие трастузумаба с использованием образцов периферической крови пациентов HER2-позитивного РМЖ, взятых до начала курса терапии, для которых результаты лечения известны. Мы установим, связаны ли результаты HER-таргетной терапии с подавлением ингибирующего воздействия препарата сывороткой крови пациента in vitro. 4) Будет проведено транскриптомное профилирование образцов опухоли. Активность сигнальных путей клетки будет рассчитана посредством разработанного нами биоинформатического метода OncoFinder и соответствующего пакета программного обеспечения (www.oncofinder.com). Измерения будут сопоставлены с клинической картиной течения болезни. Наши исследования приведут к пониманию механизмов передачи сигналов в клетках и механизмов устойчивости опухоли, что поможет при отборе пациентов для таргетной терапии и, возможно, поиску путей преодоления устойчивости.

Ожидаемые результаты
Поиск биомаркеров для предсказания результатов лечения необходим для предотвращения неэффективного использования потенциально токсичных препаратов. Объектом исследований в рамках предлагаемого проекта являются внутриклеточные и внеклеточные факторы, влияющие на ответ опухолевых клеток на применение НЕR2-таргетных препаратов. В России в 2015 году РМЖ впервые диагностирован у 67 тыс. женщин (85 случаев на 100 000) и стал причиной смерти в 23 тыс. случаев [Злокачественные новообразования в России в 2015 году, под ред. А.Д. Карпина, В.В. Старинского, Г.В. Петровой, Москва, 2017.] Примерно 20% пациентов с РМЖ имеют опухоль с повышенным содержанием HER2 или с амплификаций гена, кодирующего рецептор, то есть так называемый HER2-позитивный РМЖ. Для их лечения разработаны препараты для блокирования активности рецептора, HER2-таргетные препараты. При лечении РМЖ наиболее используемым является препарат трастузумаб, который обычно применяют в комбинации с химиотерапией. Объективный ответ на применение HER2-таргетной терапии в сочетании с химиотерапией наблюдается у 30 - 65% пациентов [Baselga J, Manikhas A, Cortes J, Llombart A, Roman L, Semiglazov VF, et al. Phase III trial of nonpegylated liposomal doxorubicin in combination with trastuzumab and paclitaxel in HER2-positive metastatic breast cancer. Annals of oncology: official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 2014;25(3):592–598]. То есть, несмотря на заявленный таргетный механизм действия, при использовании этих дорогостоящих препаратов примерно для 50% больных они используются впустую, не принося никакой пользы. При этом далеко не все пациенты HER2-позитивного РМЖ получают таргетную терапию из-за ограниченности финансирования этого дорогостоящего лечения. По нашим оценкам, трастузумаб доступен лишь 12% когорты женщин, для лечения которых он необходим. Цель предлагаемого исследования состоит в разработке объективного критерия назначения препарата. Активация сигнальных путей и каскады передачи сигналов, а также их изменения, характерные для клеток опухоли, являются объектом исследования многих лабораторий. Особенно динамично такие исследования стали развиваться с разработкой методов количественного измерения всего спектра мРНК клетки. Наши исследования протекают именно в этом главном потоке. Новизна нашего подхода заключается в обработке результатов такого измерения с помощью разработанного нами биоматематического метода OncoFinder, который позволяет автоматически количественно рассчитывать активность внутриклеточных молекулярных сигнальных путей на основе транскриптомного анализа. В рамках настоящего проекта, будет собран клинически аннотированный биоматериал (образцы крови и ткани) с данными об успешности последующего лечения с использованием препарата трастузумаб, соответствующий HER2-позитивному РМЖ. Для собранных клинических образцов на микрочипах высокой плотности платформы CustomArray, будет проведено профилирование транскриптомов (как минимум 30 образцов). Полученные данные о генной экспрессии будут проанализированы с использованием биоматематического метода OncoFinder. В результате, будет получен список внутриклеточных сигнальных и метаболических путей, активность которых характерна для каждого из исследованных пациентов. Будет проведен ассоциативный анализ профиля активности сигнальных путей в опухоли и ответа на курс терапии с применением препарата трастузумаб для выявления тех сигнальных путей, чья активность может служить значимым предиктором результатов терапии. Полученные результаты помогут также понять механизмы устойчивости опухоли к трастузумабу. Научная значимость исследований транскриптомов клеток опухоли состоит в возможности понять молекулярные механизмы каскадов передачи сигналов в клетке, запускаемых клеточными рецепторами. Мы собираемся провести поиск внеклеточных факторов в периферической крови пациентов, которые могут влиять на результаты таргетной терапии. Поиск молекулярных маркеров для предсказания прогрессирования опухоли и ее ответа на применение таргетной терапии интенсивно ведется во всем мире. Препараты HER2-таргетной терапии блокируют связывание лиганда с рецептором, или ингибируют автофосфорилирование рецепторов [Izrailita J, Bermana H, Dattid A. High throughput kinase inhibitor screens reveal TRB3 and MAPK/ERK/ TGFβ pathways as fundamental Notch regulators in breast cancer.(2013) Proc Natl Acad Sci U S A 110:1714–9]. Рецептор HER2, являющийся мишенью таргетных препаратов, не имеет выявленного «собственного» лиганда. Его роль заключается в образовании гетеродимера с другими рецепторами семейства HER/HER, которые активируется лигандами, и передачи вызванных лигандами активирующих сигналов. Лиганды HER специфически связывают рецепторы семейства HER/HER. Связывание вызывает активацию и автофосфорилирование рецепторов, что приводит к запуску внутриклеточных сигнальных каскадов [Baker, A. et al., Notch-EGFR/HER2 bidirectional crosstalk in breast cancer Front. Oncol.,(2014) 12:234-52]. Таким образом, препараты HER2-таргетной терапии играют роль прямо противоположную роли лигандов HER-рецепторов. Поэтому можно предположить, что высокая концентрация лигандов будет блокировать противоопухолевую активность HER2-таргетных препаратов. Для некоторых лигандов HER-рецепторов мы установили связь их концентрации с результатом противоопухолевой терапии рака легкого. Предварительные результаты наших исследований свидетельствуют о том, что каждый из лигандов, EGF, TGF-alpha и HB-EGF, блокирует ингибирующий эффект таргетных препаратов эрлотиниб, лапатиниб и трастузумаб. Мы собираемся исследовать образцы сыворотки крови ста больных HER2–позитивным РМЖ, для которых известен объективный ответ опухоли на применение терапии с использованием препарата трастузумаб. Будет определена зависимость частоты объективного ответа от концентрации каждого из шести HER-лигандов. Для этого мы измерим в образцах методом ИФА концентрации следующих шести лигандов: EGF, TGF-alpha, amphiregulin, HB-EGF, betacellulin и epiregulin. На основе полученных зависимостей мы определим, концентрации каких лигандов значимо связаны с исходом лечения и определим пороговые значения концентраций лигандов. Будет разработана тест-система, состоящая из измерения концентраций HER-лигандов в сыворотке периферической крови пациента методом ИФА и критерия оценки вероятности ответа опухоли на HER2-таргетную терапию. Критерий оценки основан на пороговых значениях концентраций отдельных лигандов (или комбинации концентраций нескольких лигандов). Если сыворотка пациента содержит концентрации HER-лигандов выше пороговых, то применение HER2-таргетной терапии для пациента не рекомендуется. В России имеется около 80 тысяч больных с выявленным HER2-позитивным РМЖ. Прогноз прогрессирования болезни и предсказание об эффективности HER2-таргетной терапии жизненно необходимы для этих женщин. Результаты исследования будут запатентованы, поскольку использование тест-системы имеет коммерческую значимость как для применения уже имеющихся HER-таргетных препаратов, так и для разработки новых. Мы ожидаем, что данное исследование ляжет в основу будущих внедренных в клиническую практику методик, позволяющих выбирать для индивидуального больного оптимальный вид лечения. Персонализация выбора терапии приведет к увеличению частоты ремиссии, повышению качества жизни пациентов и к повышению эффективности расходования средств на лечение. Ответ опухоли на таргетную терапию может зависеть от множества факторов (белков или метаболитов), присутствующих в организме пациента. Если факторы сыворотки крови пациента препятствуют действию препарата на клетки опухоли во время лечения, то они могут также препятствовать действию препарата на клетки in vitro. Это основная идея для создания тест-системы для предсказания результатов терапии. В присутствии образца сыворотки крови пациента мы измерим действие противоопухолевых препаратов на рост клеток линий РМЖ. Будет измеряться клоногенность для линий, имеющих происхождение от РМЖ с разным уровнем эксперссии HER2 (например, MDA-MB-453, SK-BR-3, BT-474, ZR-75 против MCF7 или T-47D). В результате исследования мы установим связь между влиянием сыворотки крови пациентов на клоногенность клеток в присутствии препарата трастузумаб и частой ответа опухоли пациентов на терапию препаратом трастузумаб. Цель исследований – предсказание эффективности таргетной терапии Таким образом, в результате предлагаемого исследования будет найдена связь между результатами HER-таргетной терапии при HER2-позитивном РМЖ и 1) активностью сигнальных и метаболических путей клеток опухоли, 2) концентрацией HER-лигандов в сыворотке крови и 3) влиянием сыворотки пациента на анти-пролиферативное действие таргетного препарата (на клоногенность клеточных линий, происходящих от РМЖ in vitro). Потенциально все три исследования позволяют создать тест-системы для предсказания результата HER2-таргетной терапии. Тест-система, основанная на ИФА-методе, может быть немедленно использована в клинике, поскольку ИФА-метод большинством российских клиник уже освоен. Тест-система, основанная на измерении клоногенности, требует доставки образцов в специализированные лаборатории, однако она проста в использовании и исследование обойдется, как и ИФА, примерно в 1500 рублей (себестоимость). Факторы, связанные с клиническими результатами лечения, называют биомаркерами для предсказания результата лечения. Биомаркеры представляют собой измеряемые признаки, которые позволяют идентифицировать тех пациентов, которым лечение принесет пользу. Исследования геномов опухолей привели к обнаружению ключевых генов, изменение которых в соматических клетках может быть причиной трансформации и прогрессирования болезни. Для рака легкого было показано, что таргетная терапия может успешно применяться только в том случае, если ген рецептора-мишени, EGFR, мутирован так, что он остается активным даже при отсутсвии HER-лигандов. Именно это открытие привело к увеличению частоты объективного ответа на таргетную терапию с 12 до 70% при HER-позитивном раке легкого. Оборотной стороной такого отбора пациентов для терапии стало сужении популяции больных, требующих таргетной терапии, с практически 100% до 10-15%. В результате HER-таргетная терапия для лечения немелкоклеточного РЛ применяется только для опухолей с активирующими мутациями в гене EGFR. Таким образом, применение этого перспективного и щадящего метода лечения лишились 85% больных. Предлагаемый в нашем исследовании терапевтический подход по снижению концентрации HER-лигандов призван сделать таргетную терапию эффективной и для этой когорты пациентов. Мы планируем создать рекомбинантный белок, специфически связывающий HER-лиганды. Мы испытаем, как сыворотка крови человека влияет на ингибирующее воздействие препаратов эрлотиниб, гефитиниб и лапатиниб на рост клеток, имеющих происхождение от РМЖ и РЛ в присутствии в отсутствие рекомбинантного белка. Полученный белок предлагается использовать как противоопухолевый препарат для лечения РМЖ и РЛ в комбинации с ингибиторами тирозин киназы. Результаты исследования будут запатентованы, поскольку использование тест-системы имеет коммерческую значимость как для применения уже имеющихся HER-таргетных препаратов, так и для разработки новых. Мы ожидаем, что отбор пациентов РМЖ, основанный на результатах предлагаемого исследования, приведет к увеличению частоты объективного ответа пациентов на лечение посредством HER2-таргетной терапии. Такой отбор существенно снизит частоту случаев неэффективного применения таргетной терапии. Таким образом, применение разработанных подходов даст возможность больным РМЖ получить более эффективное для них лечение и повысит эффективность использования миллиардов рублей ежегодно. Дорогостоящее лечение HER-таргетными препаратами будет применяться как раз для тех больных, для которых оно приведет к успеху. Следующий аспект разрабатываемой технологии заключается в том, что клинические исследования новых HER2-таргетных препаратов, при которых отбор пациентов будет проводиться с помощью разрабатываемых тест-систем, будут давать более высокие показатели эффективности. Это, в перспективе, будет приводить к более быстрому одобрению применения препаратов. Мы также надеемся, что разрабатываемый нами препарат для снижения концентрации HER-лигандов будет применяться для лечения РЛ и, впоследствии, РМЖ. Область применения результатов выполнения проекта – медицина (диагностика) и фармакология (разработка препаратов противоопухолевой терапии), биотехнология (производство тест-систем).

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Семейство трансмембранных рецепторов HER/HER состоит из четырех структурно сходных тирозинкиназ, в том числе белки EGFR u HER2. Известно несколько факторов роста, которые способны связываться и активировать рецепторы, названные HER лигандами. Примерно 20% пациентов с раком молочной железы (РМЖ) экспрессируют HER2 на повышенном уровне. В начале 21 века в практику вошли таргетные препараты для блокирования активности как EGFR, так и HER2. Их принимают сотни тысяч больных, а их продажи составляют миллиарды долларов в год. При этом, при использовании в монотерапии, объективный ответ наблюдается у 20 - 35%, а в комбинации с химиотерапией – у 50-65% пациентов. Объектом исследований в рамках проекта являются внутриклеточные и внеклеточные факторы, влияющие на ответ опухолевых клеток на применение НЕR-таргетных препаратов и молекулярные механизмы устойчивости к препаратам. Цель проекта – разработка способов отбора пациентов для применения HER-таргетной терапии для повышения ее эффективности. В 2018 году, были получены следующие основные результаты: 1) Мы начали исследование гипотезы, что концентрация лигандов НЕR-рецепторов связана с эффективностью терапии. В итоге, связь концентрации лигандов HER в периферической крови пациентов с результатами лечения РМЖ будет исследована для пациентов, проходящих курс таргетной терапии с использованием препарата трастузумаб. На настоящем этапе, мы измерили концентрацию трех HER лигандов в крови человека методом иммуноферментного анализа (ИФА). Проведя измерения концентрации указанных лигандов в 100 мкл сыворотки крови экспериментальной выборки десяти здоровых женщин-добровольцев, мы показали, что концентрации лигандов колеблются: для EGF, от значений неотличимых от уровня фона до 72 пкг/мл, то есть различные образцы отличаются минимум в 18 раз; для HB-EGF, от значений неотличимых от уровня фона до 120 пкг/мл, то есть минимум в 7 раз. Большие вариации в концентрации лигандов соответствует нашим предварительным исследованиям и литературным данным. 2) Ответ опухоли на таргетную терапию может зависеть от множества факторов (белков или метаболитов), присутствующих в организме пациента. Если эти факторы препятствуют действию препарата на опухолевые клетки в организме пациента, то они могут препятствовать и действию препарата in vitro. Поэтому мы предполагаем, что влияние крови пациента на действие препарата можно быстро испытать еще до начала дорогостоящего курса терапии. Если сыворотка существенно снижает ингибирующий эффект трастузумаба на рост клеток in vitro, можно предположить, что прогрессирование опухоли будет подавляться этим препаратом слабее. В рамках исследования, будет измерено анти-пролиферативное воздействие трастузумаба в концентрации, соответствующей IC10 в присутствии ста образцов крови HER2-позитивных пациентов РМЖ с известным ответом на терапию препаратом трастузумаб. Мы установим, связаны ли результаты HER-таргетной терапии с подавлением ингибирующего воздействия препарата сывороткой крови пациента in vitro. Для начала выполнения этой задачи, мы измерили ингибирующее воздействие противоопухолевого препарата трастузумаб на рост клеток, чувствительных к препарату клеточных линий РМЖ, ZR-75, SK-BR-3 и BT-474, в присутствии сыворотки крови человека. Сначала мы измерили действие трастузумаба на клоногенность и пролиферацию клеток и определили IC50 and IC10 концентрации трастузумаба, а также воздействие сыворотки крови человека в отсутствие препарата. Мы измеряли выживаемость клеток с трастузумабом в концентрации IC10, в присутствии сыворотки крови человека. Мы создали протокол для таких измерений применительно к сыворотке крови онкобольных. Также мы фракционировали сыворотку, которая оказывала максимальное воздействие на ингибирующий эффект трастузумаба и обнаружили, что воздействие связано с высокомолекулярной фракцией.

Публикации

1. А.Буздин, М.Сорокин, A.Гаража, E.Секачева, Э.Ким, Н.Жуков, И.Вонг, К.Ли, С.Кар, К.Хартманн, A.Самии, A.Гизе, Н.Борисов Molecular pathway activation - New type of biomarkers for tumor morphology and personalized selection of target drugs. Seminars in Cancer Biology, 53:110-124 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2018.06.003

2. В.Ткачев, M.Сорокин, А.Мещеряков, A.Симонов, A.Гаража, A.Буздин, И.Мучник, Н.Борисов FLOating-Window Projective Separator (FloWPS): a data trimming tool for support vector machines (SVM) to improve robustness of the classifier Frontiers in Genetics, - (год публикации - 2018)

3. М. Zolotovskaia, M.Sorokin, S.Roumiantsev, N.Borisov, A.Buzdin Pathway instability is an effective new mutation-based type of cancer biomarkers. Frontiers in Oncology, - (год публикации - 2018)

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Семейство трансмембранных рецепторов HER/HER состоит из четырех тирозинкиназ, в том числе белков EGFR u HER2/neu. Известно несколько факторов роста, которые способны связываться и активировать рецепторы, названные HER лигандами. Примерно 20% пациентов с раком молочной железы (РМЖ) экспрессируют HER2 на повышенном уровне. В начале 21 века в практику вошли таргетные препараты для блокирования активности как EGFR, так и HER2, например, Трастузумаб, Эрлотиниб и Лапатиниб. При использовании в монотерапии, объективный ответ наблюдается у 20 - 35%, а в комбинации с химиотерапией – у 50- 65% пациентов HER2-позитивного РМЖ. Объектом исследований в рамках проекта являются внутриклеточные и внеклеточные факторы, влияющие на ответ опухолевых клеток на применение НЕR-таргетных препаратов и молекулярные механизмы устойчивости к препаратам. Цель проекта – разработка способов отбора пациентов для применения HER-таргетной терапии для повышения ее эффективности. В 2019 году мы получили результаты по следующим основным направлениям: 1) Проверка взаимосвязи концентрации лигандов НЕR-рецепторов в крови пациентов и эффективности терапии. Мы измерили концентрацию шести HER лигандов методом иммуноферментного анализа. Проведя измерения концентрации лигандов в сыворотке крови выборки здоровых женщин-добровольцев и 50 пациентов HER2-позитивного РМЖ, мы показали, что концентрации лигандов значительно варьируют у разных индивидуумов. Так, концентрации эпирегулина составили от 0 до 2322 пг/мл (среднее 490 пг/мл, медиана 149 пг/мл). Концентрации EGF составили от 239 до 1260 пг/мл (среднее 526 пг/мл, медиана 432 пг/мл). Концентрации HB-EGF составили от 19,3 до 1099 пг/мл (среднее 111 пг/мл, медиана 38,9 пг/мл). Концентрации TGF-альфа составили от 0 до 126 пг/мл (среднее 18,1 пг/мл, медиана 4,1 пг/мл). Большие вариации в концентрации лигандов соответствует нашим предварительным исследованиям и литературным данным. В дальнейшем, после получения клинических результатов лечения, будет исследована взаимосвязь концентрации лигандов HER в периферической крови пациентов с ответом на терапию препаратом Трастузумаб. 2) Мы получили рекомбинантный белок, внеклеточный домен EGFR, который можно использовать для снижения концентрации HER-лигандов. Мы показали, что под действием этого белка клоногенность клеток снижается в присутствии HER-таргетных препаратов. 3) Ответ опухоли на таргетную терапию может зависеть от множества факторов, присутствующих в организме. Если эти факторы препятствуют действию препарата на опухолевые клетки в организме пациента, то они могут препятствовать и действию препарата in vitro. Влияние сыворотки крови пациента на действие препарата можно испытать еще до начала дорогостоящего курса терапии. Если сыворотка существенно снижает ингибирующий эффект Трастузумаба на рост клеток in vitro, можно предположить, что прогрессирование опухоли будет подавляться этим препаратом слабее. Для проверки этого предположения, мы измерили ингибирующее воздействие противоопухолевых препаратов Трастузумаб и Лапатиниб на рост клеточных линий, чувствительных к этим препаратам (BT-474 и SK-BR-3) в присутствии сыворотки крови пациентов с РМЖ и здоровых добровольцев. Мы измерили способность клеток формировать колонии (клоногенность) и обнаружили, что даже в концентрации 1,25% сыворотка крови человека существенно изменяет клоногенность клеток в присутствии препарата. Для клеток линии BT-474 сыворотка снижает клоногенность клеток до 10 – 60% от исходного уровня, а для клеток линии SK-BR-3 мы наблюдали обратный эффект – сыворотка увеличивала клоногенность в 1 – 1,7 раза. При этом влияние сыворотки значительно варьирует от пациента к пациенту. 4) В ходе исследования, у одной из испытуемых пациенток мы обнаружили сыворотку, способную полностью подавлять рост клеточных линий РМЖ даже в концентрации 0,5%. Такое сильнейшее антипролиферативное воздействие было связано с иммуноглобулинами сыворотки.

Публикации

1. Д. Э. Камашев, Т. В. Ракитина, Д. С. Матюшкина, Д. В. Евсютина, А. А. Ванюшкина, Ю. К. Агапова, В. Е. Анисимова, А. Л. Дробышев, И. О. Бутенко, О. В. Побегуц, Г. Ю. Фисунов ИЗМЕНЕНИЕ ПРОТЕОМНОГО ПРОФИЛЯ E. COLI ПРИ УДАЛЕНИИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ГИСТОНОПОДОБНЫЙ БЕЛОК HU: ПО ДАННЫМ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО ДВУМЕРНОГО ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗА БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, Vol. 45, No. 5, pp. 524–533. (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1134/S1068162019050029

2. Золотовская М.А., Сорокин М.И., Емельянова А.А., Борисов Н.М., Кузьмин Д.В., Боргер П., Гаража А.В., Буздин А.А. Pathway Based Analysis of Mutation Data Is Efficient for Scoring Target Cancer Drugs Frontiers in Pharmacology, 10:1 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.3389/fphar.2019.00001

3. Никитин Д., Гаража А., Сорокин М., Пензар Д., Ткачев В., Марков А., Гайфуллин Н., Боргер П., Полторак А., Буздин А. Retroelement-Linked Transcription Factor Binding Patterns Point to Quickly Developing Molecular Pathways in Human Evolution Cells, 6;8(2). pii: E130 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.3390/cells8020130

4. Сунцова М., Гайфуллин Н., Аллина Д., Решетун А., Ли К., Менделеева Л., Сурин В., Сергеева А., Спирин П., Прасолов В., Морган А., Гаража А., Сорокин М., Буздин А. Atlas of RNA sequencing profiles for normal human tissues Scientific Data, 6(1):36 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1038/s41597-019-0043-4

5. Борисов Н., Буздин А. New Paradigm of Machine Learning (ML) in Personalized Oncology: Data Trimming for Squeezing More Biomarkers From Clinical Datasets Frontiers in Oncology, 17;9:658 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.3389/fonc.2019.00658

6. Буздин А., Сорокин М., Поддубская Е., Борисов Н. High-Throughput Mutation Data Now Complement Transcriptomic Profiling: Advances in Molecular Pathway Activation Analysis Approach in Cancer Biology Cancer Informatics, 18:1176935119838844 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1177/1176935119838844

7. Никитин Д., Сорокин М., Ткачев В., Гаража А., Марков А., Буздин А. RetroSpect, a New Method of Measuring Gene Regulatory Evolution Rates Using Co-mapping of Genomic Functional Features with Transposable Elements Evolution, Origin of Life, Concepts and Methods. Издательство Springer, Cham, pp 85-111 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1007/978-3-030-30363-1_5

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Мы исследовали влияние сыворотки крови человека в отсутствие таргетных препаратов для линий BT-474, SK-BR-3, A431, A549. Оказалось, что клоногенность клеток BT-474 значимо не меняется в присутствии 62 образцов сыворотки пациентов, а в присутствии 35 образцов – существенно ингибируется. И наоборот, клоногенность клеток SK-BR-3 существенно увеличилась в присутствии сыворотки для всех образцов, в среднем в 2,67 раза. В целом, образцы крови здоровых доноров оказывали на клоногенность такой же эффект, как и образцы пациентов, больных РМЖ, разница между здоровыми донорами и больными РМЖ была статистически не значима. Мы обнаружили пятикратную вариацию в клоногенности клеток SK-BR-3 между индивидуальными образцами сыворотки в присутствии лапатиниба для выборки из 102 пациентов, больных РМЖ. Все протестированные образцы сыворотки существенно уменьшали ингибирование клоногенности SK-BR-3 препаратом трастузумаб, в среднем в 2,74 раза. Сыворотка крови также уменьшала воздействие EGFR-специфичных препаратов эрлотиниба и цетуксимаба на ингибирование роста клеток А431. Мы показали, что фракции сывороток после удаления иммуноглобулинов на аффинной колонке белок G - агароза полностью сохраняли эту активность. В свою очередь, иммуноглобулиновая фракция этой активностью не обладала. Мы также показали, что первая фракция элюции с гель-фильтрационной колонки G-25, содержащая белки крупнее 5 кДа, лишь в небольшой степени уменьшала эффект эрлотиниба и цетуксимаба на клоногенность. При этом вторая фракция элюции сохраняет ингибирующую активность. Было проведено измерение концентраций HER-лигандов для 25 образцов сыворотки крови человека. Уровень EGF в сыворотке достоверно коррелировал со способностью сыворотки увеличивать образование колоний клеток SK-BR-3 в присутствии таргетных препаратов, была зафиксирована корреляция 0,55 для трастузумаба и 0,7 для лапатиниба. Мы завершили ИФА-измерения концентрации шести HER-лигандов и исследовали связь между концентрациями лигандов и результатами терапии. Наши результаты подтверждают гипотезу о том, что концентрация EGF может являться прогностическим фактором таргетной терапии трастузумабом: чем ниже концентрация EGF, тем больше шансов на успех терапии. Клоногенность клеток А431, A549, H1975 была измерена в присутствии растворимого аффинно очищенного эктодомена hEGFR, а также взятых по отдельности EGFR-таргетных препаратов эрлотиниб и гефитиниб, и образцов сыворотки крови. Клоногенность клеток BT-474 была измерена в присутствии эктодомена hEGFR, трастузумаба и образцов сыворотки крови. Присутствие EGF (наиболее представленного в крови лиганда EGFR), как и сыворотки крови человека, в среде культивирования также снижает ингибирующее воздействие эрлотиниба на рост клеток. Поэтому мы ожидали, что эктодомен hEGFR свяжет лиганды EGFR, имеющиеся в сыворотке крови человека и усилит действие препаратов эрлотиниб и гефитиниб на клетки. В проведенных нами экспериментах было показано, что присутствие растворимого эктодомена не влияло на ингибирующее действие таргетных препаратов. Мы также использовали альтернативный подход и иммобилизовали эктодомен hEGFR на аффинной колонке. Путем пропускания сыворотки через аффинную колонку, получили сыворотку, обедненную лигандами EGFR. Мы обнаружили, что обедненная сыворотка могла снижать ингибирующее воздействие препаратов на рост клеток лишь в гораздо меньшей степени, чем исходная сыворотка. Мы также показали, что чувствительность клеток к HER-таргетным препаратам может уменьшаться при повышенных концентрациях EGF в среде. Мы провели измерение клоногенности клеток А431 в широком диапазоне концентраций цетуксимаба (0-100 мкг/мл) и EGF (0-500000 пкг/мл). При концентрации цетуксимаба 6 - 20 мкг/мл образование колоний оказалось полностью блокировано, однако оно оказалось восстановлено до контрольного уровня в присутствии 1000-10000 пкг/мл EGF. Мы также показали, что для 1000 пкг/мл EGF, что близко к физиологической концентрации в крови человека, полуингибирующая концентрация цетуксимаба составила 3 мкг/мл, то есть в 60 раз выше, чем без дополнительного EGF в среде. Мы также впервые провели сравнение проявленности известных онкомаркеров по данным РНК-секвенирования и ИГХ для парафинизированной ткани опухолевых биоптатов или хирургического операционного материала. Были получены профили РНК-секвенирования для 39 образцов РМЖ и 19 образцов рака легкого. Для них же определяли статус по ряду клинических ИГХ-онкомаркеров. В результате были зафиксированы достаточно высокие (корр. по Спирмену 0.65-0.798) и статистически достоверные (p < 0.00004) корреляции между профилями онкомаркеров по данным РНК-секвенирования и ИГХ для маркерных генов HER2/ERBB2, ER/ESR1 и PGR для РМЖ, и гена PDL1 для рака легкого. Значения площади под ROC-кривой (AUC) составили: 0.963 для HER2, 0.921 для ESR1, 0.912 для PGR, и 0.922 для PDL1. Это свидетельствует о надежности и аналитической валидности результатов, полученных с использованием специфического метода РНК-секвенирования, примененного нами в данной работе. Мы также провели клиническое исследование NCT03521245 для выявления дополнительных экспрессионных биомаркеров трастузумаба при HER2-позитивном метастатическом или рецидивирующем РМЖ. С помощью РНК-секвенирования мы профилировали генную экспрессию для 23 образцов фиксированной в формалине парафинизированной ткани HER2-позитивного РМЖ, полученных от пациентов с известным статусом ответа на трастузумаб. Для групп пациентов-ответчиков и неответчиков на лечение, мы обнаружили ряд дифференциально регулируемых генов и молекулярных путей. Мы сравнили эти результаты с 42 профилями РНК-секвенирования пациентов-ответчиков и неответчиков на терапию трастузумабом, ранее опубликованными по итогам клинических исследований NCT00513292 и NCT00353483. Мы не нашли корреляции между статусом ответа и уровнем экспрессии самого гена ERBB2 в HER2-положительных образцах РМЖ. Сравнение дифференциально регулируемых генов и молекулярных путей в объединенном наборе данных выявило 15/27 активированных/подавленных у ответчиков на трастузумаб генов и 15/25 молекулярных путей, соответственно. Тем не менее, по сравнению с моделью случайного распределения, статистически значимым оказалось только пересечение молекулярных путей, активированных у ответчиков по сравнению с неответчиками. Классификатор, построенный нами на основе наиболее сильно активированного дифференциального молекулярного пути «cAMP Pathway (Protein Retention)», показал наилучшую эффективность для прогнозирования ответа на трастузумаб HER2-положительного РМЖ как для наших, так и для ранее опубликованных данных. Этот путь также статистически достоверно (p=0,041) предсказывал время до рецидивирования заболевания в комбинированном наборе данных (наши экспериментальные + предыдущие литературные данные). Мы применили тот же подход для анализа парафинизированных образцов рака желудка, лечение которого также включает использование трастузумаба в случае обнаружения амплификации или повышенной экспрессии белка HER2. При рецидиве используются уже другие виды терапии, в частности, моноклональное терапевтическое антитело рамуцирумаб, которое ингибирует ангиогенез в опухоли, блокируя белок VEGFR2. Доля пациентов, демонстрирующих клинический ответ на рамуцирумаб, составляет по разным оценкам 30-80%, что говорит о необходимости персонализации назначения этого препарата. Мы получили 15 профилей РНК-секвенирования для пациентов с рецидивирующим раком желудка, для которых имелась информация о клиническом ответе на таргетную терапию рамуцирумабом. Группа ответчиков отличалась от неответчиков дифференциальной экспрессией трех генов: CHRM3, LRFN1 и TEX15. Среди них, ген CHRM3 обладал повышенной экспрессией в группе ответчиков на терапию. Мы также провели алгоритмическое моделирование эффективности рамуцирумаба, основываясь на полученных молекулярных профилях, и сравнили результаты с реально наблюдаемым ответом на лечение. Оказалось, что алгоритмически предсказанный ответ являлся хорошим прогностическим маркером (AUC ≥ 0.7). Эти результаты подтверждают возможность выявления маркеров ответа на таргетную терапию опухолей на основании данных транскриптомного анализа и, в частности, РНК-секвенирования. Мы провели РНК секвенирование для клеток линий, имеющих происхождение от HER2+ РМЖ, подвергнутых воздействию сыворотки крови человека, трастузумаба и EGF. Мы показали, что под действием сыворотки крови человека клоногенность клеток SK-BR-3 повышается и при этом повышается активность внутриклеточных путей, ответственных за клеточную адгезию и движение. Для клеток BT-474, мы выявили сигнальные пути клетки, активность которых меняется под действием трастузумаба в наибольшей степени. Мы показали, что активность этих путей значительно снижается, если в среде присутствуют и EGF, и трастузумаб. В то же время EGF снижает способность трастузумаба ингибировать пролиферацию. Также мы установили, что сыворотка крови, в наибольшей степени ингибирующая рост клеток BT-474, значительно активирует те пути, которые отвечают за конденсацию хроматина и регуляцию транскрипции.

Публикации

1. Борисов Н.М., Сорокин М.И., Гаража А.В., Буздин А.А. Quantitation of Molecular Pathway Activation Using RNA Sequencing Data Methods in Molecular Biology, 2063:189-206 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0138-9_15

2. Борисов Н.М., Сорокин М.И., Ткачев В.С., Гаража А.В., Буздин А.А. Cancer gene expression profiles associated with clinical outcomes to chemotherapy treatments BMC Medical Genomics, 13(Suppl 8):111 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1186/s12920-020-00759-0

3. Золотовская М.А., Сорокин М.И., Гаража А.В., Борисов Н.М., Буздин А.А. Molecular pathway analysis of mutation data for biomarkers discovery and scoring of target cancer drugs Methods in Molecular Biology, 2063:207-234 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0138-9_16

4. Камашев Д.Э., Сорокин М.И., Кочергина И., Дробышев А.Л., Владимирова У.С., Золотовская М.А., Воротников И., Шабан Н.А., Раевский М.М., Кузьмин Д.В., Буздин А.А. Human blood serum can donor-specifically antagonize effects of EGFR-targeted drugs on squamous carcinoma cell growth HELIYON (Cell Press), - (год публикации - 2021)

5. Сорокин М.И., Игнатьев К., Барбара В., Муравьева А., Сунцова М.В., Гайфуллин Н.М., Камашев Д.Э., Поддубская Е.В., Буздин А.А. Molecular Pathway Activation Markers Are Associated with Efficacy of Trastuzumab Therapy in Metastatic HER2-Positive Breast Cancer Better than Individual Gene Expression Levels Biochemistry (Moscow), Jul;85(7):758-772 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1134/S0006297920070044

6. Сорокин М.И., Игнатьев К., Поддубская Е.В., Владимирова У.С., Гайфуллин Н.М., Ланцов Д., Гаража А.В., Аллина Д., Сунцова М.В., Барбара В., Буздин А.А. RNA Sequencing in Comparison to Immunohistochemistry for Measuring Cancer Biomarkers in Breast Cancer and Lung Cancer Specimens Biomedicines, May 9;8(5):114. (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/biomedicines8050114

7. Сорокин М.И., Поддубская Е.В., Баранова М., Глускер А.А., Когония Л., Маркарова Е., Аллина Д.О., Сунцова М.В., Ткачев В.Т., Гаража А.В., Секачева М.И., Буздин А.А. RNA sequencing profiles and diagnostic signatures linked with response to ramucirumab in gastric cancer Cold Spring Harbor Molecular Case Studies, 6(2):a004945 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1101/mcs.a004945

8. Ткачев В.С., Сорокин М.И., Гаража А.В., Борисов Н.М., Буздин А.А. Oncobox method for scoring efficiencies of anticancer drugs based on gene expression data Methods in Molecular Biology, 2063:207-234 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0138-9_16

9. Буздин А.А., Скворцова И.И., Ли С., Вонг Й. Next Generation Sequencing Based Diagnostic Approaches in Clinical Oncology Frontiers in Oncology, - (год публикации - 2021)

Возможность практического использования результатов
Проведенное исследование закладывает научный фундамент под несколькими новыми экспериментальными системами предсказания ответа на терапию опухолей молочной железы герцептином и другими HER2-специфичными таргетными препаратами. Во-первых, мы выявили связь между клоногенностью клеток линии BT-474 в среде, содержащей трастузумаб и сыворотку периферической крови пациента (2,5%), и результатом терапии трастузумабом. Определяется характеристическое значение классификатора как отношение числа колоний в присутствии препарата и сыворотки крови человека к числу колоний без препарата и сыворотки крови человека. Например, в наших экспериментах получилось, что если полученное отношение было меньше 0,45, то вероятность успешной терапии составляла более 90%, а если отношение превышало 0,9, то вероятность успешной терапии была существенно ниже (около 35%). Во-вторых, в нашей экспериментальной выборке была выявлена взаимосвязь концентрации EGF в плазме крови пациента и прогноза таргетной терапии трастузумабом: чем ниже концентрация EGF, тем выше шансы на успех терапии. Так, если концентрация EGF в сыворотке крови пациента превышала 620 пкг/мл, то вероятность успеха терапии по нашим экспериментальным данным можно оценить как 45%, а в случае, когда концентрация EGF была ниже 620 пкг/мл, то вероятность успеха оценивалась как 86%. В-третьих, мы доказали способность использованной нами методики РНК-секвенирования количественно оценивать уровень биомаркерных белков в фиксированном опухолевом материале, в том числе материале РМЖ. Эти результаты свидетельствуют о надежности и высокой аналитической значимости результатов, полученных с использованием специфического метода РНК-секвенирования, примененного нами в работе по этому проекту. Мы также построили классификатор для выявления ответчиков и неответчиков на терапию трастузумабом. Классификатор, построенный на основе молекулярного пути «cAMP Pathway Protein Retention», показал высокую эффективность для прогнозирования ответа на трастузумаб HER2-положительного РМЖ как для наших экспериментальных, так и для ранее опубликованных данных. Этот путь также статистически достоверно (p=0,041) предсказывал время до рецидивирования заболевания в комбинированном наборе данных (наши экспериментальные + предыдущие литературные данные). Мы предполагаем, что эти результаты, в случае подтверждения результатов на независимых выборках аннотированных биообразцов, смогут найти воплощение в тест-системах нового поколения для прогнозирования эффективности таргетной терапии РМЖ.