Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Оленеводство относится к стратегически значимой отрасли Арктических регионов нашей страны. Фундаментальной целью проекта является расширение сведений об особенностях формирования микробиоты рубца северных оленей, позволяющих им использовать для питания скудные питательные ресурсы тундры и лесотундры. Впервые с применением современных метагеномных подходов нами были выполнены исследования микробиома рубца северных оленей Rangifer tarandus Ненецкой породы, обитающих на территории Арктических регионов России. В результате впервые был выявлен ряд закономерностей, характеризующих зависимость состава микробиоты рубца от половозрастных особенностей, региональных условий обитания и кормовой базы, здоровья животных. 1) В 2017-2018 г. был организован ряд экспедиций регионы Российской Арктики: Мурманскую область, Ямало-Ненецкий и Ненецкий АО. В летне-осенний период было отобрано 59 образцов содержимого рубца от северных оленей Ненецкой породы, включая особи различных половозрастных групп (телята и взрослые особи до 20 лет), клинически здоровые и истощенные животные с проявлениями некробактериоза (включая поражения копыт). В зимне-весенний период было отобрано 103 образца содержимого рубца, что составило задел на второй год выполнения Проекта. Параллельно на территориях пастбищ были отобраны образцы различных растительности, составляющей основу рациона северных оленей, в результате чего была создана музейная коллекция гербария образцов высших растений и лишайников из 54 образцов летне-осеннего периода и 21 образца зимне-весеннего периода. Планируется дальнейшее пополнение коллекций образцов содержимого рубца, а также растений и лишайников с пастбищ. В первый год выполнения Проекта запланированы исследования образцов, собранных в летне-осенний период. 2) С целью получения объективной картины по данным ветеринарных служб была охарактеризована эпизоотическая обстановка в Арктических регионах. Подавляющее число инфекционных заболеваний северных оленей было зарегистрировано в летне-осенний период, что, вероятно, обусловлено, их физиологическими особенностями. Средний процент падежа был максимальным (11,6%) от инфекционных заболеваний. Проблема некробактериоза была характерна для всех исследуемых регионов, бруцеллез и пастереллез - только для Ямало-Ненецкого АО. 3) Растительность с пастбищ северных оленей была охарактеризована по ботаническому составу, питательности и уровню токсичности. В летне-осенний период растительность изучаемых регионов Арктической зоны России представлена преимущественно травянистыми (многолетние травы, в т.ч. Póa árctica, Erióphorum vaginatum и другими), кустарниковыми, кустарничковыми (Sаlix borеalis, Vaccinium uliginosum, Bеtula nаna, Sаlix polaris), древесными растениями (Bеtula pendula), и лишайниками (Cladonia, Nephroma). Судя по результатам оценки питательности многокомпонентных проб, повторяющих состав усредненного летнего пастбищного рациона, корма северных оленей содержали высокое количество сырой клетчатки и низкое - других питательных веществ. В целом, наименьшие показатели питательности выявлены для образцов из Мурманской области. Результаты определения токсичности усредненных образцов с пастбищ и лишайников показали отрицательный результат. Однако в тканях лишайников и высших растений пастбищ Арктической зоны России наблюдалось множественное загрязнение микотоксинами (минимум 3-мя): афлатоксинами, охратоксином А, Т-2-токсином, зеараленоном (ЗЕН) и дезоксиниваленолом (ДОН). Присутствие микотоксинов в тканях древесных и кустарниковых растений, составляющих летне-осенние пастбищные рационы северных оленей, было продемонстрировано впервые. При этом количество микотоксинов в образцах высших растений (Embryophyta) по сравнению с пробами лишайников было достоверно выше (p≤0,05). Доминирующими практически во всех исследованных образцах являлись фузариотоксины ДОН и ЗЕН. Содержание микотоксинов некоторых представителей высших растений (V. uliginosum, многолетние травы) варьировало в зависимости от места произрастания, тогда как для лишайников (рода Cladonia) такой зависимости практически не наблюдалось. 4) Микробное сообщество рубца северных оленей исследовали с применением комплекса молекулярно-генетических методов: NGS-секвенирования, T-RFLP-анализа и количественной ПЦР. Общее биоразнообразие микроорганизмов в рубце Rangifer tarandus было значительным, существенная часть которых не была идентифицирована до филума. Методом NGS-секвенирования детектированы представители 27 филумов (25 - бактериальных, 2 - археотных), среди которых идентифицировано 533 рода. Процентная доля филумов Firmicutes и Bacteroidetes суммарно составила 79,06-90,18%, Proteobacteria – не более 5%, Cyanobacteria, Spirochaetes, Verrucomicrobia - не более 3%, остальных - в минорном количестве. По данным Т-RFLP-анализа детектировано 183 филотипа бактерий, среди которых идентифицированы члены филумов Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, Tenericutes, Fusobacteria, Cyanobacteria. Обоими методами оценки биоразнообразия детектированы представители 2 филумов архей, среди которых доминировали представители Euryarchaeota, а представители Crenarchaeota выявлены в минорном количестве. С применением T-RFLP-анализа определено присутствие до 167 филотипов архей. Микробное сообщество рубца Rangifer tarandus характеризовалось рядом отличий от других жвачных - присутствием в бактериальном сообществе цианобактерий (филум Cyanobacteria), целлюлозолитических бактерий семейств Eubacteriaceae и Clostridiaceae, а также большим процентным отношением метаногенных архей филума Euryarchaeota, что может объясняться физиологическими особенностями северных оленей. Во всех исследованных образцах содержимого рубца отмечено присутствие возбудителей инфекционных заболеваний, включая бактерии родов Mycoplasma, Fusobacterium, Campylobacter, Arcobacter, в единичных случаях детектированы - Enterobacter, Pasteurella. 5) Основным детерминантом всех компонент микробного сообщества рубца северных оленей оказались региональные условия обитания, что, по всей видимости, обусловлено различиями в составе пастбищного рациона и эпизоотической ситуацией в стаде. Наименьшее сходство с другими регионами отмечено для образцов из Мурманской области, пастбищный рацион которой отличался составом растительности, меньшей питательностью и загрязненностью микотоксинами. В целом, отмечены значимые изменения представленности ряда таксонов в связи с показателями питательности и токсичностью пастбищного рациона северных оленей, что позволяет уточнить аспекты взаимодействия и совместного обитания симбионтов в сложнокомпонентной системе рубца, характеризующейся многообразием источников растительных полисахаридов и разнообразием спектра продуцируемых микроорганизмами ферментов. Помимо традиционно связываемых с процессами деградации целлюлозы рубцовыми микроорганизмами, статистически значимая связь установлена между уровнем клетчатки в пастбищных кормах и членами семейств Methanobacteriaceae, Spirochaetaceae, Nostocaceae, Veillonellaceae, Rivulariaceae. При этом представленность в рубце целлюлозолитических микроорганизмов была отрицательно связана с уровнем загрязненности растительности микотоксинами. Выявлена тенденция к увеличению в рубце уровня патогенов (семейств Mycoplasmataceae, Fusobacteriaceae, Campylobacteraceae) на фоне более высокого поражения микотоксинами растений и лишайников. При анализе особенностей микробиоты рубца особей различных возрастных групп наиболее значимые различия зарегистрированы между группами молодняка (до 2 лет) и взрослыми особями (старше 2 лет). В течение онтогенеза детектировано существенное расширение таксономического разнообразия микроорганизмов, а также достоверное увеличение представленности ряда таксонов, в т.ч. семейств Methanobacteriaceae, Eubacteriaceae, Clostridiaceae, Lachnospiraceae (p≤0,05), что свидетельствует о повышении потенциала микробного сообщества к ферментации растительных полисахаридов. Доля возбудителей инфекционных заболеваний в онтогенезе изменялась неодинаково в различных регионах, что позволяет предположить взаимосвязь присутствия патогенов с другими факторами, в т.ч. с эпизоотической ситуацией в стаде. Стоит отметить, что значимых изменений в микробиоме рубца важенок и хоров не наблюдалось. В среднем у важенок отмечалась тенденция к снижению доли филумов Euryarchaeota, Spirochaetes и повышению представленности членов филума Fusobacteria. Клинически здоровые животные отличались по составу микробного сообщества рубца большим содержанием бактерий Bacteroidales (p≤0,05), архей класса Methanobacteriales (p≤0,05) и меньшим - порядка Lactobacillales (в т.ч. семейства Streptococcaceae), семейства Veillonellaceae (p≤0,05). Для оленеводства проблема некробактериоза среди других болезней северных оленей относится к одной из наиболее значительных, поскольку приносит наиболее существенный урон экономический и хозяйственной деятельности населения районов Крайнего Севера. В связи с этим важно отметить в рубце особей с симптомами некробактериоза совместное присутствие повышенной доли ряда патогенов, включая возбудителей некробактериоза филума Fusobacteria (p≤0,05), пастереллеза (класса Pasteurellales), гастроэнтеритов (семейства Enterobacteriaceae). Итак, в рамках 1 года исследований по Проекту установлено, что основным детерминантом всех компонент микробного сообщества рубца северных оленей оказались региональные условия обитания, а другие изучаемые факторы (пол, возраст, состояние здоровья) были менее значимы, однако вносили определенный вклад в соотношение микроорганизмов в рубце. На 2 год выполнения Проекта (2018-2019 гг.) запланирована оценка закономерностей состава микробиоты рубца северных оленей с указанными факторами в зимне-весенний период, что позволит оценить адаптационные особенности микробиоты рубца организма-хозяина в ответ на скудный рацион в связи с сезонной изменчивостью. 6) В рамках проекта были выделены микроорганизмы из рубца северного оленя, перспективные в качестве источника целлюлаз, биодеструкторов токсинов, обладающие антагонистическими свойствами в отношении патогенов для создания пробиотических кормовых добавок, как для оленеводства, так и для других отраслей животноводства. Была создана коллекции из 63-х разлагающих различные источники целлюлозы ассоциаций микроорганизмов, выделенных из рубцового содержимого клинически-здоровых особей северных оленей. Десять наиболее активных изолятов деградировали целлюлозу до 44-62%. У наиболее активных ассоциаций отмечена значительная антагонистическая активность в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium, что позволило предположить присутствие в культуральных жидкостях ассоциаций антимикробных веществ. В результате экспериментов in vitro установлена способность всех исследованных изолятов к биодеструкции как минимум двух из пяти исследуемых микотоксинов, в т.ч. афлатоксинов и Т-2 токсина. Наиболее выраженная способность изучаемых изолятов к биотрансформации наблюдалась в отношении афлатоксинов (от 22,8 до 75,1% при p≤0,05). Один из изолятов (№26) обладал способностью к биодеструкции всех исследованных токсических метаболитов микромицетов (от 13,4 до 87,5% при p≤0,05). Вероятно, механизм биотрансформации нескольких микотоксинов, имеющих различную химическую природу, обеспечивается большой лабильностью метаболизма изолятов и разнообразием их ферментных систем. Подобные ферментные системы могут являться эволюционным приспособлением рубцовых микроорганизмов к поступлению в макроорганизм кормов с высоким содержанием микотоксинов. Культивирование изолятов бактерий на жидкой питательной среде, содержащей микотоксины, практически во всех случаях не приводило к ингибированию роста микроорганизмов. Отобранные штаммы перспективны в качестве инновационного профилактического биоконтролирующего средства в животноводстве для подавления патогенной микрофлоры и снижения микотоксикологической нагрузки в процессе консервирования влажных кормов.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
На 2 год выполнения Проекта (2018-2019 гг.) исследования были направлены на характеристику микробиома рубца северных оленей в зимне-весенний период для изучения адаптационных особенностей микробиоты рубца организма-хозяина в ответ на скудный рацион. Особенностью кормовой базы северного оленя в зимне-весенний период по сравнению с летне-осенним является высокая доля лишайников в рационе (до 75%). 1) В 2018-2019 г. был организован ряд экспедиций в регионы Российской Арктики. Суммарно в зимне-весенний период за время выполнения Проекта было отобрано 119 образцов содержимого рубца от северных оленей Ненецкой породы, включая особей различных половозрастных групп, клинически здоровых и истощенных животных. Параллельно на территориях пастбищ были собраны образцы растительности, составляющей основу рациона северных оленей для оценки ботанического состава, питательности и токсичности. Суммарно в зимне-весенний сезон за период Проекта было отобрано 45 образцов высших растений и лишайников. 2) С целью получения объективной картины по данным ветеринарных служб была охарактеризована эпизоотическая обстановка в Арктических регионах. В зимне-весенний период исследуемых регионов не зарегистрировано заболевания северных оленей некробактериозом, что, вероятно, обусловлено физиологическими особенностями северных оленей. Наибольший процент падежа в целом от инфекционных заболеваний был зафиксирован в Мурманской области. 3) Для анализа закономерностей между составом микроорганизмов в рубце северных оленей и особенностями кормовой базы были оценены питательная ценность и уровень токсичности многокомпонентных проб, повторяющих состав усредненного зимне-весеннего пастбищного рациона северных оленей. В зимне-весенний период кормовая база северных оленей изучаемых регионов Арктической зоны России представлена до 75% лишайниками (Cladonia, Nephroma), до 20% подснежной зеленью (многолетними травами, в т.ч. Póa árctica, Erióphorum vaginatum и др.) и до 20% кустарничковыми (Vaccinium uliginosum, Bеtula nаna и др.). Судя по результатам оценки питательности, корма северных оленей содержали высокое количество сырой клетчатки и низкое - других питательных веществ. В целом, кормовая база северных оленей в зимний период характеризовалась меньшей питательностью по сравнению с летне-осенним сезоном, что является вполне закономерным. Наименьшие показатели питательности выявлены для образцов из Мурманской области. Результаты определения токсичности усредненных образцов с пастбищ и лишайников показали отрицательный результат. Тем не менее, во всех исследованных пробах растительности, отобранных на территориях пастбищ северных оленей, наблюдалось множественное (минимум 4-мя) загрязнение микотоксинами. Установлено, что общая пораженность кормов микотоксинами в зимне-весенний период была существенно ниже по сравнению с летне-осенним. В зимне-весенний сезон загрязнение образцов микотоксинами ДОН, Т-2 и ЗЕА практически не имело географических закономерностей. Содержание в исследуемых образцах таких микотоксинов, как АФЛА и ОХРА варьировало в значительной степени в зависимости от места произрастания. Содержание АФЛА и ОХРА в образцах с пастбищ Ненецкого АО и Ямало-Ненецкого АО, было достоверно выше по сравнению с образцами, отобранными на пастбищах Мурманской области. 4) Микробное сообщество рубца северных оленей исследовали с применением комплекса молекулярно-генетических методов: NGS-секвенирования, T-RFLP-анализа и количественной ПЦР. Общее биоразнообразие микроорганизмов в рубце Rangifer tarandus было значительным, существенная часть которых не была идентифицирована до филума. Методом NGS-секвенирования детектированы представители 27 филумов (25 - бактериальных, 2 - археотных). Количество идентифицируемых родов в зимне-весенний период было меньшим (296 родов бактерий и архей) по сравнению с летним сезоном (533 рода). Процентное содержание филумов Firmicutes и Bacteroidetes было значительным и суммарно составило 79,06-90,18%, Proteobacteria – не более 6%, Cyanobacteria, Spirochaetes, Verrucomicrobia - не более 3%, остальных - в минорном количестве. В зимне-весенний период, по сравнению с летне-осенним, в бактериальном сообществе рубца Rangifer tarandus условно-патогенные и патогенные микроорганизмы, в т.ч. представители семейств Сampylobacteriaceae, Enterobacteriaceae, Mycoplasmataceae, филума Fusobacteria, выявлялись в минорных количествах. В археотном сообществе по данным NGS-секвенирования и T-RFLP-анализа детектировано присутствие архей 2 филумов, в т.ч. Euryarchaeota (до 99,8%) и Crenarchaeota (до 0,21%). Число филотипов архей по данным T-RFLP-анализа составило 134. 5) В зимне-весенний период в рубце северных оленей Арктических регионов России основным детерминантом всех компонент микробного сообщества, как и в летне-осенний сезон, оказались региональные условия обитания. Остальные изучаемые факторы (половозрастные особенности, состояние здоровья) оказывали меньшее влияние на соотношение микроорганизмов в рубце. При оценке возрастных изменений микробиома рубца в зимне-весенний период наиболее значимыми различия оказались (как и в летне-осенний период) между взрослыми (старше 2 лет) и молодыми (до 2 лет) особями. Наиболее четко возрастные различия визуализировались методом главных компонент внутри каждого региона в отдельности. Так, на примере Ямало-Ненецкого АО показано, что у взрослых животных по сравнению с телятами и молодняком отмечена тенденция к увеличению числа OTUs (операционных таксономических единиц) и показателей биоразнообразия. В целом, в течение онтогенеза у северных оленей зафиксирована тенденция к увеличению содержания целлюлозолитических (сем. Eubacteriaceae) и лактат-ферментирующих (сем. Veillonellaceae) бактерий, что свидетельствует о повышении потенциала микробного сообщества к ферментации растительных полисахаридов. Ни по одной из исследуемых компонент микробиома рубца, значимых изменений между важенками (самками) и хорами (самцами) не наблюдалось. Интересно, что в зимний период в бактериальном сообществе рубца важенок сохранялась выявленная в предыдущий этап исследований (летне-весенний сезон) тенденция к увеличению представителей доли филума Spirochaetes. Учитывая, что региональный фактор оказал наибольшее влияние на микробиом рубца северных оленей, были установлены закономерности между составом микроорганизмов и особенностями кормовой базы, ее питательной ценности и уровня токсичности (в т.ч. количества различных групп микотоксинов). Высокие статистически значимые коэффициенты корреляции были детектированы с содержанием клетчатки в рационе для бактерий семейств Clostridiaceae (r=0,56), Ruminococcaceae (r=0,90), Rikenellaceae (r=0,49), Rivulariaceae (r=0,48), Thermoactinomycetaceae (r=0,52), что позволяет оценить их связь с процессами рубцового пищеварения. Интересно, что представленность в рубце микроорганизмов семейства Veillonellaceae была отрицательно связана с уровнем загрязненности растительности микотоксинами (r=-0,67 для охратоксина). Определена тенденция к увеличению представленности в рубце возбудителей инфекционных заболеваний (таких как Brucellaceae, Burkholderiaceae, Erysipelotrichaceae) на фоне повышения пораженности кормов микотоксинами. У ослабленных особей в рубце было выявлено достоверно меньшее (P<0,05) присутствие целлюлозолитиков (родов Lachnobacterium, Clostridium) и кислот-утилизирующих бактерий (родов Megasphaera, Veillonella, Dialister). Между содержанием в рубце северных оленей фузобактерий (сем. Fusobacteriaceae) и лактобактерий (сем. Lactobacillaceae) выявлена достоверная положительная связь (r=0,46), которая обнаруживается у КРС (крупного рогатого скота) при некробактериозе, характеризующемся гнойно-некротическими поражениями кожи и тканей, слизистых оболочек и внутренних органов животных. Биохимические исследования сыворотки крови выявили у ослабленных особей северных оленей пониженное содержание белка, альбуминов и щелочной фосфатазы, а также повышение ферментативной активности аспартатаминотрансферазы, что может свидетельствовать о протекающих патологических процессах в желудочно-кишечном тракте животных. На следующий период выполнения Проекта (2019-2020 гг.) запланирован сравнительный анализ состава микробиома рубца северного оленя в летне-осенний и зимне-весенний периоды. В результате планируется оценить влияние сезонного фактора на состав микробиоценоза рубца северных оленей в связи с региональными экологическими условиями, составом, питательностью и токсичностью рациона, половозрастными особенностями и состоянием здоровья животных. На основании полученных данных будут идентифицированы и охарактеризованы микроорганизмы, принимающие прямое или опосредованное участие в механизмах адаптации к сезонным рационам. 6) Особенностью представителей рубцового микробиоценоза, эволюционирующего совместно с макроорганизмом, является способность образовывать ряд пищеварительных ферментов, в том числе, целлюлаз, что позволяет жвачным животным эффективно использовать энергию кормов, богатых клетчаткой. В связи с этим особую важность приобретает достигнутый в ходе проекта результат получения микроорганизмов из рубца северного оленя, перспективных в качестве источника целлюлаз, биодеструкции токсинов микромицетов, обладающих антагонистическими свойствами в отношении патогенов. В рамках 2 года выполнения проекта были исследованы ассоциации бактерий, выделенные из рубцового содержимого клинически-здоровых особей северных оленей в зимне-весенний период, а также продолжено изучение свойств штаммов, выделенных в летне-осенний сезон. Из образцов содержимого рубца, отобранного в зимний период, была создана коллекция из 48 ассоциации микроорганизмов, разлагающих целлюлозу и карбоксиметилцеллюлозу, описана их морфология и культуральные свойства. Наиболее активными оказались 3 изолята, разложившие 30,2-45,1% исходной целлюлозы. У целлюлозолитических изолятов, наиболее активно разлагающих различные источники клетчатки, был определен уровень антагонистической активности по отношению к кишечной бактерии Escherichia coli, к Staphylococcus aureus - возбудителю стафилококкоза, а также к фитопатогенным грибам-продуцентам микотоксинов видов Fusarium oxysporum, F. sporotrichioides, Aspergillus alliaceus. Действие изолятов бактерий в опытах было избирательно и специфически проявлялось по отношению к микромицетам и бактериям. По отношению к Escherichia coli и Staphylococcus aureus антагонизм был минимальный. В отношении микромицетов был выявлен больший уровень антагонизма, однако он был видоспецифичен. По отношению к F.oxysporum и F. sporotrichioides был выявлен достаточно высокий уровень антагонизма у изолята №О-24 (35±3,4 и 50,3±5,2 мм соответственно). Полученные результаты позволяют предположить присутствие в культуральных жидкостях ассоциаций антимикробных веществ. Такими веществами могут являться органические кислоты, бактериоцины и др. Была проанализирована способность у наиболее активных целлюлозолитических бактериальных культур, выделенных у оленей в зимне-весенний период, разлагать микотоксины. Наибольший уровень биодеструкции наблюдался в отношении афлатоксинов. Был оценен таксономический состав наиболее перспективных изолятов с применением метода NGS-секвенирование. Установлено, что наиболее активные изоляты включали бактерии родов Bacillus, Bacteroides, Porphyromonas, Pseudomonas и др. Итак, выделенные в ходе выполнения Проекта изоляты представляют несомненный интерес для животноводства (в том числе, молочного и оленеводства) с целью их использования в качестве экологически чистых и безопасных пробиотических кормовых добавок.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На 3 год реализации Проекта (2019-2020 гг.) проведен сравнительный анализ состава микробиома рубца северных оленей Rangifer tarandus Российской Арктики в летне-осенний и зимне-весенний периоды. В результате было оценено влияние сезонного фактора на состав микробиоценоза рубца северных оленей в связи с региональными экологическими условиями, составом, питательностью и токсичностью рациона, половозрастными особенностями и состоянием здоровья животных. Проведенные исследования позволили идентифицировать и охарактеризовать микроорганизмы, принимающие прямое или опосредованное участие в механизмах адаптации к сезонным рационам. 1) Характеристику адаптационных особенностей формирования микробиоты рубца северных оленей Ненецкой породы проводили на основе данных молекулярно-генетического анализа образцов, отобранных в летне-осенний и зимне-весенний периоды во время экспедиций в регионы Российской Арктики. В исследование были включены образцы, исследованные в предыдущие периоды реализации Проекта. Также результаты исследований были пополнены полученными в ходе реализации 3 года Проекта данными по 52 образцам содержимого рубца северных оленей из коллекции, включающей 200 образцов, собранной в период экспедиций 2017-2019 гг. в Арктических регионах России 2) Оценка сезонных изменений формирования микробиома рубца северных оленей с учетом влияния ряда факторов (пол, возраст, региональные условия обитания, особенности кормовой базы, здоровье животных) на основе многомерных статистических методов позволила выявить закономерности, характеризующие адаптационные особенности микробных сообществ. В целом наиболее значимыми факторами влияния на микробиом рубца северных оленей Арктических регионов России оказались сезонные и региональные условия обитания. Другие изучаемые факторы (пол, возраст) были менее значимы, однако вносили определенный вклад в соотношение микроорганизмов в рубце. 3) Были установлены особенности формирования микробиома рубца северных оленей в различные сезонные периоды и в связи с местом их обитания. Для каждого сезона был характерен свой уникальный набор операционных таксономических единиц (ОТЕ). Полученные результаты позволяют сделать вывод о достаточно четкой ассоциации микробиома рубца северного оленя с особенностями питания в различные сезонные периоды, определяющие адаптацию к экологическим условиям. Наиболее четкие сезонные изменения детектированы для микроорганизмов, ассоциированных с процессами ферментации полисахаридов кормов. В зимне-весенний сезон выявлено достоверное увеличение содержания бактерий, деградирующих полисахариды лишайников, в т.ч. гемицеллюлозу (Butyrivibrio, Ruminococcus) и лихенин (Succiniclasticum, Bacteroidales), а также снижение доли метаногенных архей класса Methanobacteria, в частности рода Methanobrevibacter. В летне-осенний период отмечено достоверное увеличение доли бактерий семейства Paraprevotellaceae, способных ферментировать широкий спектр растительных углеводов. Выявленные региональные отличия состава микробных сообществ рубца северного оленя имели достаточно сильную приуроченность к различию в составе пастбищного рациона. Так, для Ненецкого АО (тундровая природно-климатическая зона) и Ямало-Ненецкого АО (лесотундровая природно-климатическая зона) преимущественно достоверные различия были отмечены для микроорганизмов, участвующих в процессах деградации углеводов кормов, таких как представители порядка Bacteroidetes, семейств Veillonellaceae, Ruminococaceae, Lachnospiraceae, родов Succiniclasticum, Oscilospira. Выявленные закономерности свидетельствуют о наличии определенных метаболических взаимосвязей между присутствием данных микроорганизмов в рубце северного оленя с разнообразием доступных им пастбищных кормовых растений. Широкий интерес представляют выявленные нами закономерности о развитии в летний период в рубце северного оленя целого спектра микроорганизмов, которые относятся к возбудителям инфекционных заболеваний, в т.ч. Porphyromonas endodontalis, родов Parvimonas, Sharpea, Fusobacterium, Acinetobacter и семейств Erysipelotrichaceae, Mycoplasmataceae и др. Присутствие ряда патогенов оказалось взаимосвязанным с местом обитания северных оленей, что, по всей видимости, может быть связано как с контаминацией кормовых растений пастбищного рациона животных, так и с эпизоотической ситуацией в стаде. При оценке возрастных изменений микробиома рубца у северных оленей в связи со сменой сезонов, наиболее значимыми различия оказались для показателей α- и β-разнообразия в подгруппах: 1) особи до 2 лет, 2) особи старше 2 лет. Достоверных отличий по данным биоразнообразия между важенками и хорами не наблюдалось. 3) В рамках характеристики адаптационных приспособлений микробиома северных оленей к возможности эффективного использования ими для питания скудных растительных ресурсов, особенно в зимне-весенний период, нами были определены микроорганизмы, ассоциированные с показателями питательности и токсичности кормовой базы северных оленей. Наиболее выраженной оказалась взаимосвязь между представленностью в рубце северного оленя микроорганизмов и показателями питательности, в частности с количеством сырой клетчатки (Ruminococcaceae, Dehalobacteriaceae, Succiniclasticum, Verrucomicrobia), протеина (Succiniclasticum, Lachnospiraceae), растворимых углеводов (Ruminococcaceae и Dehalobacteriaceae). Таким образом, присутствие целого спектра таксонов оказалось связанным одновременно с несколькими показателями питательности. Одновременно выявлено несколько таксономических групп, процентное содержание которых в рубце оказалось взаимосвязанным (Bacteroidetes, Veillonellaceae, Synergistetes, Ruminococcaceae), что, вероятно, связано с особенностями метаболизма данных микроорганизмов. Интерес к детоксицирующим свойствам микробиоты рубца северного оленя, как механизма адаптации к сезонным особенностям пастбищного рациона, также вызывает достаточно широкий интерес исследователей. Интересно, что присутствие всех групп микотоксинов (афлатоксины, охратоксин, Т-2-токсин, зеараленон, ДОН) в пастбищном рационе северных оленей оказалось отрицательно связано с количеством в рубце бактерий Dehalobacteriaceae и Succiniclasticum, выявляемых преимущественно в зимний сезон. В целом полученные результаты позволяют сделать вывод о достаточно четкой ассоциации микробиома рубца северного оленя с особенностями питания в различные сезонные периоды, определяющие адаптацию к экологическим условиям, проявляющиеся преимущественно на уровне минорных таксонов. 4) В летне-осенний и зимне-весенний сезоны у ослабленных особей были выявлены сходные изменения в микробиоме рубца. Характер изменения микробиома в комплексе с результатами анализа сыворотки крови могут свидетельствовать о развитии некробактериоза, который сопровождается некротическими поражениями органов, тканей и конечностей жвачных. Поскольку у северных оленей гнойные поражения копыт отмечаются преимущественно в летний сезон, нами был детально охарактеризован микробиом рубца северных оленей с клиническими проявлениями некробактериоза в этот период. У пораженных особей детектировано достоверно более высокое содержание фузобактерий, стафилококков и псевдомонад, некоторые виды которых могут являться причиной развития гнойно-некротических поражений. В целом, у здоровых особей выявлялось большее содержание целлюлозолитиков класса Clostridia (семейств Lachnospiraceae, Eubacteriaceae и Clostridiaceae), филума Bacteroidetes и кислот-утилизирующих бактерий порядка Negativicutes. Микробиом рубца телят с проявлениями некробактериоза характеризовался большими изменениями, в частности у них выявлялось достоверное увеличение (Р<0,05) содержания кампилобактерий и энтеробактерий по сравнению со взрослыми животными, что может быть обусловлено физиологическими особенностями данного этапа развития животных. 5) Следующей задачей Проекта на 3 год было продолжение исследований свойств изолятов из рубца северных оленей, перспективных в качестве источника целлюлаз, биодеструкторов токсинов, с высокой антимикробной активностью в отношении патогенов для создания пробиотических кормовых добавок, как для оленеводства, так и для других отраслей животноводства. В рамках данного этапа реализации проекта были продолжены исследования наиболее активных ассоциаций бактерий, выделенные из рубцового содержимого клинически-здоровых особей северных оленей. Из коллекции, включающей 111 ассоциаций, было отобрано 15 ранее не исследованных из наиболее активно разлагающих целлюлозу и карбоксиметилцеллюлозу, описана их морфология и культуральные свойства. Наибольшую активность проявили 2 изолята (№ 6 и 17), разложившие 31,6-38,6% исходной целлюлозы. У ассоциаций, наиболее активно разлагающих различные источники клетчатки изолятов, был определен уровень антагонистической активности по отношению к кишечной бактерии Escherichia coli, к Staphylococcus aureus - возбудителю стафилококкоза, а также к фитопатогенным грибам-продуцентам микотоксинов видов Fusarium oxysporum, F. sporotrichioides, Aspergillus alliaceus. У большинства изолятов наибольший уровень антагонизма был выявлен в отношении микромицетов, в связи с чем была проанализирована их способность разлагать микотоксины. Наибольший уровень биодеструкции наблюдался в отношении афлатоксинов и Т-2 токсина. Был оценен таксономический состав наиболее перспективных изолятов с применением метода NGS-секвенирование, по данным которого установлено, что состав наиболее активных ассоциаций был представлен бактериями родов Enterococcus, Bacillus, Clostridium, Bacteroides, Porphyromonas, Pseudomonas и др. Следующий этап исследований заключался в определении свойств изолятов, связанных с технологическими показателями возможности их использования в качестве основы для разработки биопрепарата. Была проведена оценка совместимости ассоциаций с используемыми в животноводстве подкислителями и антибиотиками, биотестирование токсичности, определение сохранности при различных температурных режимах и при длительном хранении, а также подбор оптимальных промышленных питательных сред для культивирования. Для данного этапа исследований из коллекции было отобрано 6 наиболее перспективных по свойствам изолятов № 15, 18, 21, 26, О-11, О-14. Практически во всех случаях культивирование изолятов в присутствии спектра тестируемых подкислителей и антибиотиков не приводило к ингибированию роста микроорганизмов ассоциаций. Наиболее устойчивыми ко всем исследуемым подкислителям и ряду антибиотиков оказались изоляты №18, 26 и О-14. При биотестировании на инфузориях токсического эффекта изолятов не отмечено. Результаты тестирования питательных сред для промышленного культивирования наиболее активных целлюлозолитических изолятов позволили подобрать оптимальные составы, позволяющие достигать высокого титра бактериальных клеток в питательной среде. При оценке сохранения жизнеспособности изолятов при длительном хранении (1, 3, 6 и 12 месяцев) в условиях исследуемых температурных режимов (4°С и 25°С) на жидкой питательной среде отмечено незначительное снижение титра при температуре 25°С после годового срока хранения. Итак, проведенные исследования продемонстрировали, что изоляты из рубца северных оленей имеют перспективу в качестве основы для разработки инновационного профилактического биоконтролирующего средства в животноводстве, которое может быть использовано для подавления патогенной микрофлоры и снижения микотоксикологической нагрузки. Поэтому полученные в ходе реализации Проекта изоляты представляют несомненный интерес для животноводства (в том числе, молочного и оленеводства) с целью их использования в качестве экологически чистых и безопасных пробиотических кормовых добавок.