Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Агонисты дофаминовых D2-рецепторов широко используются в терапии болезни Паркинсона и гиперпролактинемии, т.е. состояний, связанных с дисфункцией нигро-стриатной и тубероинфундибулярной дофаминовых систем. Целью настоящего исследования было обоснование возможности использования агонистов D2-рецепторов для нормализации функций дофаминовой мезолимбической системы и снижения потребления алкоголя с использованием экспериментальной модели алкогольной зависимости. Методы исследования. Эксперименты проводились на половозрелых крысах - самцах Wistar. Потребление алкоголя изучали в модели «свободный выбор» между двумя поилками, содержащими 10% раствор этанола и воду. В работе использовали методы изучения поведения животных: «темная/светлая камера» для оценки уровня тревоги, Activiscop – для изучения суточных ритмов «сон/бодрствование», установка для выработки условной реакции пассивного избегания (УРПИ) – для изучения обучения и памяти. Относительный уровень экспрессии мРНК в мозге анализировали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени после обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Уровень дофамина и норадреналина в мозге определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с электрохимической детекцией. Контроль уровня пролактина и кортикостерона в плазме крови осуществляли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты исследования. В первой серии экспериментов было показано, что экспрессия мРНК дофаминовых D2-рецепторов снижена в стриатуме хронически алкоголизированных животных с высоким уровнем потребления алкоголя. Полученные данные согласуются с результатами клинических и экспериментальных исследований [Nutt et al., 2015; Feltmann et al., 2018] и являются одной из предпосылок для использования агонистов дофаминовых рецепторов для снижения потребления алкоголя. Основываясь на фармакодинамических (высокое сродство к D2-рецепторам) свойствах, были выбраны для исследования два синтетических эрголиновых производных – каберголин и бромокриптин. Показано, что при внутрибрюшинном введении в дозе 0,5 мг/кг/сутки каберголин снижал потребление алкоголя у животных с высоким уровнем предпочтения алкоголя. Эффект бромокриптина проявлялся только при введении 2 раза в сутки с интервалом 8 часов, что связано с коротким периодом его полувыведения. Были изучены эффекты длительного введения каберголина на поведение животных. Показано, что каберголин снижает уровень тревоги у крыс с высоким потреблением алкоголя (тест «темная/светлая камера»), но не влияет на выработку и сохранение навыка пассивного избегания (УРПИ). Целью следующего этапа работы было выяснить, сохраняется ли эффект каберголина на потребление алкоголя при: а) снижении дозы препарата; б) использовании интраназального способа введения; в) изменения режима введения. Показано, что каберголин в дозе 0,05 мг/кг, в/б снижает потребление алкоголя, однако эффект был менее выражен, чем при использовании дозы 0,5 мг/кг, и достигал уровня достоверности только на 2-й неделе после начала введения. Доза каберголина 0,005 мг/кг, а также дозы 0,05 мг/кг и 0,005 мг/кг при интраназальном введении оказались неэффективными. При введении 0,5 мг/кг каберголина с интервалом 48 часов падение потребления алкоголя отмечалось в течение 24 часов после инъекции и восстанавливалось практически до начального уровня на следующие сутки. Таким образом, можно предполагать, что, несмотря на длительный период полувыведения [Kvernmo et al., 2006], для достижения стойкого эффекта снижения потребления алкоголя необходимо постоянное присутствие препарата в крови. Проверка наличия собственного «подкрепляющего» потенциала у каберголина показала, что каберголин при введении в течение 5 дней в аверсивном (ярко освещенном) отсеке экспериментальной камеры в дозах 0,5 мг/кг и 0,05 мг/кг вызывает феномен «предпочтение места» при тестировании через 24 часа, но не через 7 дней. Учитывая, что вещества, обладающие аддиктивным потенциалом, вызывают стойкий феномен «предпочтения места» [Bardo and Bevins, 2000], можно предполагать, что полученные результаты связаны скорее с анксиолитическим действием каберголина, нежели с наличием собственного подкрепляющего эффекта. Для выяснения механизмов действия каберголина изучали эффект его длительного введения на экспрессию мРНК ключевых белков дофаминовой, серотониновой, опиатной систем мозга животных с различным уровнем потребления алкоголя. Выраженное снижение экспрессии мРНК DRD2 в стриатуме и гипофизе животных с высоким уровнем потребления алкоголя, т.е. в областях мишенях дофамин-синтезирующих нейронов среднего мозга и гипоталамуса (тубероинфундибулярные нейроны), нивелировалось у животных, получавших каберголин. Анализ экспрессии генов опиоидной системы мозга показал, что у животных с высоким уровнем потребления алкоголя снижен уровень мРНК каппа-опиоидного рецептора (КОР) в среднем мозге и предшественника его эндогенного лиганда препродинорфина (ppDyn) в стриатуме, причем каберголин частично нивелировал эти нарушения. Важную роль при формировании аддиктивного поведения играют гормоны – кортикотропин-релизинг гормон (CRF) и пролактин (PRL). У предпочитающих алкоголь крыс была повышена экспрессия мРНК CRF в гипоталамусе и миндалине и PRL в гипофизе. Введение каберголина также нивелировало различия между группами. Важную роль в механизмах анксиолитического действия эрголиновых агонистов D2-рецепторов могут играть нейротрофические факторы. В данном исследовании различия в уровне мРНК BDNF в среднем мозге крыс с высоким и низким уровнем потребления алкоголя обнаружены не были, однако каберголин вызывал достоверное повышение уровня мРНК в обеих группах. Изменений уровня мРНК D2- ауторецепторов в среднем мозге у животных с высоким уровнем потребления алкоголя и у животных, получавших каберголин, обнаружено не было. Однако, учитывая важную роль D2-ауторецепторов в регуляции синтеза, освобождения и обратного захвата дофамина, можно предположить, что их длительная стимуляция каберголином может приводить к изменению регуляции дофаминовой нейротрансмиссии. Анализ уровня моноаминов в мозге показал, что у животных с высоким уровнем потребления алкоголя снижено содержание дофамина в стриатуме и гипоталамусе. Каберголин восстанавливал уровень дофамина в гипоталамусе предпочитающих алкоголь животных, не влияя на уровень дофамина в стриатуме. Повышенная экспрессия мРНК кортикотропин-релизинг гормона (CRF) в гипоталамусе и миндалине, пролактина в гипоталамусе, а также низкий уровень дофамина в гипоталамусе могут быть важными факторами, определяющими нарушение нейрогуморальной регуляции у хронически алкоголизировнных животных с высоким уровнем потребления алкоголя. Действительно, было показано, что в плазме крови животных с высоким уровнем потребления алкоголя повышен уровень пролактина, причем этот эффект не проявлялся в группе животных, получавших каберголин. Заключение. Учитывая полученные на данном этапе работы данные, представляется целесообразным дальнейшее экспериментальное изучение каберголина и других представителей агонистов дофаминовых D2-рецепторов в качестве перспективных регуляторных препаратов, влияющих на различные нейрохимические и нейрогуморальные звенья механизма формирования зависимости от алкоголя и других психоактивных веществ. Список литературы: Bardo M.T., Bevins R.A. // Psychopharmacology (Berl). 2000. V. 153(1). P.31-43. Feltmann K., Borroto‐Escuela D.O., Rüegg J., et al. // Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 2018. 42(2). P. 338-351. Kvernmo T., Härtter S., Burger E. // Clin.Ther. 2006. V.28. №8. P. 1065-1078. Nutt D.J., Lingford-Hughes A., Erritzoe D., Stokes PR et al. // Nat Rev Neurosci. 2015. V.16(5) P.305-312.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Основной целью второго этапа Проекта было выяснение возможных механизмов эффекта селективного агониста дофаминовых D2 рецепторов каберголина на потребление алкоголя. Для этого было проведено несколько серий экспериментов. Модификация теста «предпочтение места» была использована, чтобы установить, связано ли снижение потребления алкоголя каберголином с подавлением им положительно-подкрепляющего эффекта алкоголя или усилением аверсии к алкоголю. Показано, что каберголин достоверно снижает положительно-подкрепляющий эффект алкоголя у животных с высоким уровнем потребления, не влияя на аверсивный эффект алкоголя у отвергающих его животных. Снижение положительно-подкрепляющего эффекта алкоголя на фоне введения каберголина может быть связан с его влиянием на различные звенья регуляции дофаминовой нейротрансмиссии мозга. В соответствии с полученными ранее методом RT-PCR данными был проведен сравнительный анализ уровня белка D1, D2, каппа-опиоидного рецепторов и BDNF в структурах мезолимбической дофаминовой системы у животных с высокой и низкой алкогольной мотивацией и оценена возможность коррекции нарушений каберголином. В экспериментах были использованы хронически алкоголизированные животные с высоким (H) и низким (L) уровнем потребления алкоголя. Каберголин в дозе 0,5 мг/кг/сутки (Hcab и Lcab) или растворитель (Hv и Lv) вводили внутрибрюшинно в течение 16 дней. Экспрессию белков изучали через 24 часа после последней инъекции каберголина методом Вестерн-блоттинг. Было показано достоверное снижение экспрессии дофаминовых D1 рецепторов в стриатуме животных с высоким уровнем потребления алкоголя и тенденция к увеличению экспрессии D2-рецептора у животных, получавших каберголин. Достоверных различий в экспрессии КОР рецепторов в среднем мозге ни в одной из групп животных обнаружено не было. Таким образом, нормализующий эффект каберголина в отношении дофаминовых D2 рецепторов детектировался как на уровне экспрессии мРНК, так и белка. Кроме того, был показан активирующий эффект каберголина на уровень мРНК и белка BDNF в среднем мозге обеих групп животных, что может лежать в основе его антидепрессивного, анксиолитического и прокогнитивного действия. Так как эффект снижения потребления алкоголя отмечается уже на фоне однократного введения каберголина, можно предположить модуляторное влияние каберголина на активность дофаминовой мезолимбической системы. Изучение содержания дофамина методом ВЭЖХ показало, что у хронически алкоголизированных животных с высоким уровнем потребления алкоголя снижено содержание дофамина в стриатуме. Острое введение каберголина приводило к нормализации уровня дофамина. Этот эффект каберголина не был связан с его влиянием на экспрессию мРНК тирозингидроксилазы (TH), дофаминового транспортера (DAT) или моноаминоксидазы А (МАОА) в мозге «предпочитающих» алкоголь животных. Вместе с тем, острое введение каберголина приводило к достоверному повышению уровня мРНК везикулярных белков SNAP25 и 1,9 VAMP2 (в 2,4 раза и в 1,9 раз соответственно), что позволяет предположить, что «нормализующий» эффект каберголина на уровень дофамина в стриатуме может быть опосредован его активирующим влиянием на механизмы синаптической передачи в этой области мозга. Так как влияние каберголина на потребление алкоголя может быть частично обусловлено его анксиолитическим и антидепрессивным эффектами, дополнительная серия экспериментов была проведена для выяснения эффекта острого введения каберголина на содержание катехоламинов и экспрессию BDNF в среднем мозге и гипоталамусе. В этой серии экспериментов было показано увеличение содержания норадреналина и экспрессии мРНК BDNF в среднем мозге животных при введении каберголина, что может лежать в основе его антидепрессивной, анксиолитической и нейропротекторной активности. Ключевым для дальнейшего практического применения каберголина в терапии алкогольной зависимости является выяснение сохранности его эффекта после отмены. Показано, что стойкий эффект снижения потребления алкоголя у животных наблюдается на фоне введения препарата, причем оптимальным является режим дозирования – 1 раз в сутки, тогда как после отмены препарата отмечается постепенное повышение потребления, достигающее на 8-й день изначального уровня. Интересно, что при этом сохранялся повышенный уровень мРНК, но не белка дофаминового D2-рецептора в среднем мозге. Таким образом можно предположить что активация дофаминовых D2 пресинаптических ауторецепторов каберголином и обнаруженное увеличение экспрессии мРНК D2 на фоне приема алкоголя, ведет к уменьшению вызванного алкоголем выброса дофамина и, соответственно, снижению положительно подкрепляющего эффекта алкоголя, что согласуется с выводом, сделанным в эксперименте с использованием теста «предпочтение места». Возможно, наблюдаемый эффект лежит в основе повышения содержания дофамина в пресинаптическом депо, что препятствует истощению везикулярного пула медиатора у животных с высоким уровнем потребления алкоголя. Так как эрголиновые агонисты D2 рецепторов при длительном применении могут вызывать ряд нежелательных побочных эффектов, мы исследовали эффект неэрголиновых агонистов дофаминовых рецепторов – прамипексола и ропинерола на потребление алкоголя и поведение животных. Ропинирол не оказывал эффекта на потребление алкоголя животными, тогда как прамипексол снижал потребление в дозе 1,0 мг/кг и обладал сходным с каберголином анксиолитическим эффектом в тесте «темная/светлая камера». Анализ экспрессии генов показал увеличение мРНК и белка BDNF в среднем мозге у животных, получавших прамипексол относительно контрольной группы, но не дофаминового D2 рецептора в стриатуме и среднем мозге. Прамипексол в дозе 1 мг/кг не влиял на уровень пролактина в крови животных с высоким уровнем потребления алкоголя (ИФА), что может быть связано с его относительно не высоким по сравнению с каберголином сродством к дофаминовым D2 рецепторам. Таким образом, прамипексол оказывал сходный, но менее выраженный эффект на потребление алкоголя по сравнению с каберголином. Недостатком прамипексола по сравнению с каберголином является достаточно короткий период полувыведения (у человека 8-12 часов), что требует приема препарата пролонгированной формы длительного высвобождения. Вместе с тем, полученные в ходе выполнения проекта данные позволяют рассматривать каберголин и прамипексол в качестве перспективных лекарственных средств для снижения потребления алкоголя и коррекции коморбидных расстройств – тревоги и депрессии у больных с алкогольной зависимостью. За второй год выполнения проекта вышла 1 статья, одни тезисы, опубликованные в рецензируемом журнале, входящем в первый квартиль (Q1) и одна статья сдана в печать и находится на стадии рецензирования. Все журналы входят в базы данных Scopus и WoS.