Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1. Теоретическое исследование нуклеотид-связывающих белков внешних отделов митохондрий как перспективных регуляторов состояния мРТР цитозольными нуклеотидами. На основании ранее проведенного методом тандемной масс-спектрометрии исследования протеома митохондрий печени крыс, с использованием баз данных и поисковых систем UniProt, PubMed, Google, Yandex была собрана и проанализирована информация о нуклеотид-связывающих белках внешних отделов митохондрий (НАД(Ф)Н оксидоредуктазах, других НАД(Ф)Н-связывающих белках, а также АТФ/АДФ-связывающих белках митохондрий, доступных для цитозольных нуклеотидов) и их установленной или потенциальной роли в регуляции состояния мРТР, пермеабилизации внешней мембраны, а также в контроле клеточной гибели. На основании составленного обзора осуществлялся отбор перспективных нуклеотид-связывающих регуляторов мРТР для последующей проверки (VDAC, SCaMC, AAC, NOX4, AIF1), выбирались направления исследования и планировались эксперименты. Части обзора вошли в написанные нами статьи, направленные в научные журналы для рассмотрения (BBAMEM-S-18-00198; FRBM-S-18-00326). Основная часть обзора войдет в статью, посвященную идентификации внешнего НАДН-связывающего регулятора состояния мРТР на следующем этапе работы. 2. Определение оптимальных форм внешних нуклеотидов, условий ингибирования ими мРТР, а также важных для ингибирования аминокислотных остатков белков. С использованием количественных методов был протестирован эффект восстановленных (АТФ, НАДФН, НАДН), негидролизуемых (альфа-НАДН), и окисленных нуклеотидов (АДФ, НАДФ+, НАД+) на скорость Са2+-зависимой и циклоспорин А-чувствительной пермеабилизации внутренней мембраны (мРТР) и величину кальциевой емкости митохондрий. Было обнаружено, что защитным эффектом обладают АДФ > АТФ > АДФ+олигомицин > β-НАДН > β-НАД+ > α-НАДН. НАДФН и НАДФ+ являлись слабыми стимуляторами индукции мРТР. Среда инкубация с низкой ионной силой резко повышала защитный эффект НАДН и НАД+, что говорит о важности ионных взаимодействий НАД(Н) с белком-мишенью для реализации защитного эффекта. Эффект ионов Mg2+ на НАДН-зависимое подавление мРТР может говорить об участии Mg-НАДН комплекса в связывании с внешним регулятором мРТР, тогда как подавление защитного эффекта НАД(Н) оксидом азота – об участии тирозиновых остатков в связывании нуклеотида с белком-мишенью. Защитный эффект АТФ и АДФ (в миллимолярных концентрациях) и его дозозависимое усиление Mg2+ хорошо согласуются с ролью переносчиков АТФ/АДФ – AAC и SCaMC в регуляции мРТР нуклеотидами из цитозоля. 3. Определение вкладов митохондриальных переносчиков адениновых нуклеотидов (AAC, SCaMC), предполагаемого внешнего АТФ/АДФ-зависимого регулятора мРТР, а также неизвестного внешнего НАДН-зависимого регулятора мРТР в общий защитный эффект внешних НАД(Н)/АДФ/АТФ на митохондрии. Входе ингибиторного анализа с использованием конформационно-специфичных ингибиторов ААС (транслоказа адениновых нуклеотидов ) подтверждена ее важная роль в регуляции мРТР как АТФ/АДФ, так и НАДН/НАД+. Обнаружен феномен подавления мРТР низкими (≤ IC50) дозами ингибиторов ААС, стабилизирующих переносчик как в с (CATR), так и в m (BA) конформации. Установлено, что конформационно-специфичные ингибиторы ААС способны модулировать защитный эффект адениновых и, в меньшей степени, пиридиновых нуклеотидов. В низких концентрациях и CATR, и BA, усиливают защитный эффект нуклеотидов; в присутствии высоких концентраций ВА защитный эффект нуклеотидов равен их собственному защитному эффекту; в присутствии высоких концентраций CATR защитный эффект нуклеотидов снижен, примерно в 3 раза, по сравнению с их собственным защитным эффектом. Даже в присутствии CATR в высоких концентрациях защитный эффект АТФ, АДФ и НАДН сохранялся, что доказывает существование альтернативных (ААС-независимых) механизмов подавления мРТР внешними нуклеотидами в миллимолярных концентрациях. Эксперименты по SCaMC-зависимому входу/выходу АТФ/АДФ в и из митохондрий, а также расчет влияния ионов Mg2+ на уровень свободных и протонированных форм нуклеотидов и их комплексов с Mg2+ в среде инкубации показали, что внешний MgАТФ подавляет индукцию мРТР за счет Са2+-зависимого, SCaMC-опосредованного его накопления в матриксе в обмен на неорганический фосфат или протонированный АДФ. MgАДФ подавляет индукцию мРТР, ингибируя обмена внешнего протонированного АДФ и фосфата на эндогенный MgАТФ. Мы не нашли подтверждения существованию внешнего сайта регуляции мРТР адениновыми нуклеотидами, отличного от ААС. Обнаружен феномен активации выхода эндогенного АТФ субмиллимолярными концентрациями внешнего НАДН и НАД+. Выход, по данным ингибиторного анализа, осуществляется с участием ААС и, в некоторых случаях, может приводить к повышению чувствительности митохондрий к Са2+. Доказано, что защитный эффект внешнего НАД(Н) в отношении индукции мРТР реализуется через внешний регуляторный сайт. Действие адениновых и пиридиновых нуклеотидов на мРТР может быть либо синергическим, либо антагонистическим: АТФ в низких концентрациях потенцирует, а АДФ ослабляет защитный эффект НАД(Н), что, по-видимому, связано с эффектами нуклеотидов на уровень АТФ в матриксе митохондрий и внешний регуляторный сайт. 4. Выявление роли цитозольных пиридиновых нуклеотидов в регуляции «супероксидных вспышек» в пермеабилизованных митохондриях. Считается, что «супероксидные вспышки» в пермеабилизованных митохондриях являются важным элементом внутриклеточной сигнализации, регуляции мРТР на уровне клетки и клеточной гибели. С использованием потенциал-независимого зонда на супероксид анион (MCLA) была проведена проверка гипотезы об участии цитозольных пиридиновых нуклеотидов в индукции «супероксидных вспышек» в митохондриях при пермеабилизации мембран порообразующим пептидом или по механизму мРТР. Установлено, что цитозольный НАДФН и, в меньшей степени, НАДН, входящие в митохондрии при пермеабилизации мембран, способны вызывать резкое увеличение генерации супероксид аниона и пероксида водорода с участием оксидоредуктаз матрикса или внутренней мембраны. При параллельной регистрации продукции супероксид аниона и степени восстановленности пиридиновых нуклеотидов обнаружен ранее не описанный феномен: в присутствии как НАДФН, так и НАДН, вспышка супероксид аниона наблюдалась только при существенном окислении пиридиновых нуклеотидов. При этом повышение общей концентрации НАДФН плюс НАДФ+ и НАДН плюс НАД+ в митохондриальной суспензии сдвигало значение редокс потенциала, при котором наблюдалась максимальная генерация супероксид аниона, в область больших значений: от -315 (17.7 µМ НАДФ(Н)) до -296 mV (175 µМ НАДФ(Н)) и от -330 (25 µM НАД(Н)) до -250 mV (660 µM НАД(Н)). Более того, дыхательные субстраты концентрационно-зависимым образом ингибируют окисление добавленного НАД(Ф)Н, откладывают появление «супероксидных вспышек» и снижают их интенсивность. Эти данные позволяют объяснить активацию генерации АФК в условиях ишемии/реперфузии, в органах при высоких физических нагрузках, при интоксикации микробными токсинами, а также при других неблагоприятных условиях. 5. Изучение вклада различных изоформ VDAC в нуклеотид-зависимое подавление мРТР в изолированных митохондриях и пермеабилизованных клетках. Изучение вклада различных изоформ VDAC в НАД(Н)-зависимое подавление мРТР проводили путем измерения величины максимальной Са2+-емкости митохондрий в пермеабилизованных клетках и скорости Са2+-зависимого набухания изолированных и очищенных в градиенте Перколла митохондриях с нормальной экспрессией различных изоформ VDAC, а также с подавленной экспрессией изоформ 2, 1 и 3. Полученные результаты, однако, не позволили нам сделать однозначного заключения об участи VDAC в данной регуляции. Это связано как с особенностями самого объекта, выбранного для изучения (митохондрии мышиных эмбриональных фибробластов не демонстрировали Са2+-зависимого набухания), так и с недостатками методики измерения (при изучении величины Са2+-емкости митохондрий в пермеабилизованных клетка мы не учитывали антагонизм эффектов НАД(Н) и АДФ в низких концентрациях, поскольку эти данные мы получили впоследствии; также, мы не контролировали динамику степени восстановленности добавленного НАДН в клеточной суспензии). Кроме того, возможно, внешний НАД(Н)-зависимый регулятор мРТР экспрессируется не во всех типах митохондрий. После устранения методических недочетов и/или замены объекта изучения, на следующем этапе работы эти исследования будут повторены. 6. Выявление аминокислотных остатков белков, критических для связывания НАДН и НАД+, на основе анализа данных кристаллографических исследований структуры НАД(Н)-связывающих белков. Анализ данных ~ 60 кристаллографических исследований структуры НАД(Н)-связывающих белков показал, что в связывании участков никотинамид-рибоза и аденин-рибоза молекулы НАД(Н) с наибольшей вероятностью участвуют остатки глутаминовой и аспарагиновой кислоты (в 88 % белков), а также гистидина (75 %), тогда как в связывании фосфатных групп НАДН участвуют остатки аргинина (53 %) и лизина (15 % белков). Вместе с данными по оптимальным для ингибирования мРТР формам нуклеотидов, условиям инкубации, критическим аминокислотным остаткам, на следующем этапе ти результаты лягут основу разработки нового метода выявления белков с неканоническими НАД(Н)-связывающими доменами/последовательностями Информация о публикациях в СМИ, посвященных результатам проекта, с упоминанием Фонда: Пущинская среда. Новые факторы защиты митохондрий: научный поиск для сохранения клеток мозга и сердца. "Пущинская среда", № 46 (1149) 16 ноября 2017 года, стр. 8. http://inpushchino.ru/upload/105725_530f52a48e807ce8f44c00d5ea7841b5bda321ea.pdf

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. В соответствии с заявленным планом, была проведена проверки эффекта NAD(H) на индукцию мРТР (регистрация по максимальной Ca2+-ёмкости) в митохондриях пермеабилизованных мышиных эмбриональных фибробластов с подавленной экспрессией различных изоформ VDAC, в пермеабилизованных клетках линий HEK293T, HEp-2, THP-1, в пермеабилизованных изолированных гепатоцитах и кардиомиоцитах. Во всех случаях, проверяли эффект отмывки от эндогенного АДФ/АТФ на показатель эффективности NAD(H). Такая же проверка проведена в митохондриях, изолированных из сердца и мозга. Установлено, что защитный эффект внешнего NAD(H) зависит от степени дифференциации клетки. Мощный (двух- и более кратный) защитный эффект пиридиновых нуклеотидов имел место в пермеабилизованных дифференцированных клетках (гепатоциты и кардиомиоциты), а также в митохондриях, выделенных из специализированных органов (печень, сердце, мозг). Напротив, в эмбриональных и раковых клетках эффект отсутствовал или был слабо выражен. Эти данные вошли в статью и были опубликованы (Kharechkina ES, et al, Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2019 1863(5) 771-783. doi: 10.1016/j.bbagen.2019.01.003). Эти результаты позволили ввести новый критерий для отбора потенциальных NAD(H)-зависимых внешних регуляторов мРТР. Поскольку все протестированные клетки экспрессировали полный набор изоформ VDAC, было высказано предположение, что чувствительность митохондрий к NAD(H) может модулировать молекулярный партнер NADH-связывающего белка внешних отделов митохондрий (причем уровень экспрессии данного партнера связан со степенью дифференциации клетки). 2. При проведении теоретического исследования, направленного на поиск возможных NAD(H)-зависимых внешних регуляторов мРТР, с помощью баз данных UniProt и Medline были проанализированы данные о митохондриальной локализации и способности связывать цитозольный NAD(H) 176 белков, относимых к митохондриальному протеому. Было обнаружено, что в настоящее время подтверждено наличие 14 белков, способных связывать цитозольный NAD(H) (AGK, AIFM1, AIFM2, AIFM3, CYB5R1, CYB5R3, GAPDH, KMO, RDH13, SIRT1, SORD, VDAC1, VDAC2, VDAC3). Именно среди данных белков, по нашему мнению, следует искать внешний NAD(H)-зависимый регулятор мРТР с наибольшими шансами на успех. Анализ данных тандемной масс-спектрометрии протеома митохондрий печени крыс и мышиных эмбриональных фибробластов позволил сузить ряд претендентов: AIFM2, AIFM3 и SIRT1 не экспрессировались ни в митохондриях печени, ни в митохондриях фибробластов. Анализ субстратной специфичности выбранных белков показал, что RDH13 и Kmo более специфичны к NADP(H), чем к NAD(H), тогда как первый не проявляет защитного эффекта, что, по-видимому, позволяет исключить данные белки из первоочередных претендентов. Проведение теоретического поиска способности данных белков участвовать в регуляции клеточной гибели, а также зависимости экспрессии их белков-партнеров от степени дифференциации клеток, показало, что наиболее вероятными регуляторами мРТР могут быть VDAC1-GAPDH, VDAC1-HKs и AIFM1-Mia40. Это дало нам объект для дальнейших исследований. 3. Теоретический поиск позволил найти реагенты, способные вызывать диссоциацию и/или ингибирование выбранных NAD(H)-связывающих белков и их партнеров: взаимодействие VDAC1-GAPDH разрушается восстанавливающими агентами, средой инкубации с высокой ионной силой, а также коммерчески-доступным противодиабетическим препаратом пиаглитазоном (PIO) в высоких концентрациях; взаимодействие VDAC1-HKs может быть разрушено миллимолярным ясмонатом; взаимодействие и/или функционирование пары AIFM1-Mia40 может регулироваться окислителями и MitoBlock 6, специфическим ингибитором белка Erv1, окисляющего Mia40. Проверка эффектов MitoBlock 6, слабых окислителей и ясмоната на NAD(H)-зависимое подавление мРТР в изолированных митохондриях печени и пермеабилизованных клетках HEp2, HEK293T и мышиных эмбриональных фибробластов не дала положительных результатов. В то же время, PIO и DTT в некоторых концентрациях и при определенных условиях инкубации вызывали двукратное увеличение величины Ca2+-ёмкости митохондрий в пермеабилизованных клетках HEp2 и HEK293T. Эти данные вошли в статью (Kharechkina ES, et al, Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2019 1863(5) 771-783. doi: 10.1016/j.bbagen.2019.01.003). Окончательно роль системы VDAC1-GAPDH в NAD(H)-зависимой регуляции мРТР может быть доказана в экспериментах по селективному подавлению экспрессии GAPDH и (GAPDH+VDAC) в ближайшее время. 4. С использованием методов регистрации индукции мРТР (набухание, величина Са2+-ёмкости, мембранный потенциал), входа/выхода АТФ и АДФ (люциферин-люциферазный метод, скорости V3 и V4 дыхания), контроля скорости потока электронов в дыхательной цепи (физическая или химическая гипоксия/аноксия) мы изучили участие различных АТФ/АДФ-связывающих систем митохондрий (ANT, SCaMC, FoF1-ATPase) в регуляции мРТР адениновыми нуклеотидами в условиях нормоксии и гипоксии. В частности, был изучен эффект адениновых нуклеотидов на мРТР в присутствии ингибиторов ANT. Показано, что собственные эффекты карбоксиатрактилозида и бонгкрековой кислоты на мРТР были достаточно слабыми и не могли воспроизвести защитный эффект адениновых нуклеотидов. Карбоксиатрактилозид полностью подавлял мощный защитный эффект АТФ и АДФ, а бонгкрековая кислота практически на него не влияла. Эти данные говорят о том, что «с» конформация ANT действительно критически важна для подавления защитного эффекта адениновых нуклеотидов, однако, адениновые нуклеотиды могут защищать митохондрии, проникая в матрикс и действуя в обход ANT. Роль переносчика SCaMC в контроле мРТР оценили по изменению относительной эффективности подавления мРТР адениновыми нуклеотидами при одном или нескольких пульсах Са2+. Данная проверка не выявила значительной роли ScaMC в подавлении мРТР, хотя не исключено, что полная активация защитных систем происходит уже после первого импульса Са2+. Интересные закономерности были выявлены при изучении роли FoF1-АТФазы в АТФ/АДФ-зависимой регуляции мРТР. Так, ингибитор АТФазы олигомицин сильно, но лишь частично, подавлял защитный эффект внешних АТФ/АДФ. Олигомицин не подавлял защитный эффект АТФ/АДФ в присутствии бонгкрековой кислоты. Иными словами, стабилизация ANT в «m» конформации отменяет эффект ингибитора FoF1-АТФазы в отношении защитного эффекта адениновых нуклеотидов. Проверка роли степени фосфорилирования АТФ/АДФ матрикса в подавлении мРТР дала противоречивые результаты. Так, накопление АТФ (за счет фосфорилирования эндогенного АДФ) в матриксе не оказывало влияния на скорость индукции мРТР в митохондриях. С другой стороны, в присутствии субстратов аспартата и α-кетоглутарат, которые позволяет эффективно поддерживать генерацию АТФ в матриксе на субстратном уровне (без участия АТФазы) в условиях аноксии, митохондрии были способны поддерживать мембранный потенциал длительное время. Олигомицин не только не снижал эффективность поддержания мембранного потенциала, но напротив, усиливал её. В то же время, регуляторы мРТР (Mg2+, Ca2+/EGTA, неорганический фосфат, АТФ и АДФ) вносили существенный вклад в поддержание мембранного потенциала в аноксических условиях на других субстратах дыхания. Олигомицин не отменял защитного эффекта адениновых нуклеотидов. Можно предположить, что сохранение АТФ в матриксе является критически важным для подавления входа протонов и активации мРТР как в условиях нормоксии, так и гипоксии/аноксии. Полученные данные говорят о сложном механизме регуляции мРТР адениновыми нуклеотидами с участием, по меньшей мере, трех систем: ANT, SCaMC и FoF1-АТФазы, а также АТФ/АДФ пула в матриксе. Создание непротиворечивой модели регуляции мРТР адениновыми нуклеотидами требует дальнейшего изучения, а также осмысления полученных данных. 5. С использованием стандартных методик оценки функционального состояния митохондрий и измерения мембранного потенциала установлено, что пиоглитазон (PIO) действует как низкоэффективный протонофор, эффект которого подобен эффекту желчных кислот. PIO подавляет эффективность окислительного фосфорилирования и снижает скорость генерации АТФ, особенно в условиях Са2+ нагрузок. PIO (10-100 мкМ) не оказывал заметного эффекта на индукцию мРТР (набухание) при однократной добавке Са2+, но мощно снижал величину максимальной Са2+-емкости митохондрий. PIO, но не FCCP в низкой концентрации, дозозависимо подавлял защитный эффект адениновых нуклеотидов в отношении мРТР. Эксперименты с пиранин-содержащими липосомами показали, что PIO может закислять среду в везикулах, но только если рН в них выше или равен рН внешней среды. При рН среды выше, чем рН внутри везикул, добавленный PIO терял способность транспортировать протоны. Напротив, FCCP мог защелачивать среду внутри везикул, если рН внешней среды был выше. Подавление активности UCP белков (1 мМ GDP) мало сказывалось на разобщающих свойствах PIO. Напротив, подавление ANT (1 мкМ карбоксиатрактилозид) подавляло разобщающий эффект PIO примерно на 50%. Эти результаты помогут разобраться в механизмах подавления мРТР адениновыми нуклеотидами в высоких (физиологических) концентрациях. Полученные данные оформлены в виде статьи (Kharechkina ES, et al., Pioglitazone is a low-efficient protonophore and modulator of mitochondrial permeability transition), которая будет направлена для публикации в иностранный журнал с хорошей репутацией. PDF файл статьи будет прикреплен к отчету. 6. С использованием люциферин-люциферазного метода были изучены концентрационные эффекты пиридиновых нуклеотидов на выброс АТФ из митохондриального матрикса. Показано, что 50 мкМ NADH и NAD вызывали полумаксимальную стимуляцию циркуляции остаточного и эндогенного АТФ/АДФ через ANT. NADPH и NADP были не эффективны. Поскольку данная активация не была связана с ускорением открывания мРТР, мы сделали заключение, что NAD(H), по-видимому, облегчает диссоциацию АТФ с переносчика. 7. С использованием люциферин-люциферазного метода было исследовано действие ряда соединений, способных модулировать состояние мРТР (бонгкрековая кислота и карбоксиатрактилозид, эрастин, пиоглитазон и MitoBlock6), на активность переносчика SCaMC. Установлено, что только бонгкрековая кислота подавляла SСaMC-опосредованный обмен адениновых нуклеотидов и фосфата с кажущейся IC50 ~ 12.5 мкМ. Хотя вследствие высоких значений IC50 бонгкрековая кислота не может быть использована в качестве селективного ингибитора SCaMC, она может послужить исходным соединением для разработки специфичных ингибиторов. Полученные данные помогают понять механизм защитного эффекта внешних адениновых нуклеотидов при индукции мРТР. http://rscf.ru/ru/node/naydena-prichina-vspyshek-aktivnykh-form-kisloroda-v-mitokhondriyakh?sphrase_id=18754 https://news.rambler.ru/other/40925708-naydena-prichina-vspyshek-aktivnyh-form-kisloroda-v-mitohondriyah/ https://indicator.ru/news/2018/09/30/aktivnye-formy-kisloroda-v-mitohondriyah/ http://xn--m1afn.xn--p1ai/ru/node/uchenye-otkryli-mekhanizm-pozvolyayushchiy-kletkam-protivostoyat-razvitiyu-patologiy https://news.sputnik.ru/obschestvo/ca7e5b43fa104ee6b14b44aef9914fa11a4e495d http://www.ras.ru/news/shownews.aspx?id=bd184a68-dcf1-46ae-a020-885c2f6a5baa https://openscience.news/posts/1423-uchenye-iz-iteb-ran-vyyasnili-prichinu-vspyshek-aktivnyh-form-kisloroda-v-mitohondriyah http://pushchino.ru/article/uchyonye-iz-iteb-ran-vyyasnili-prichinu-vspyshek-aktivnyh-form-kisloroda-v-mitohondriyah-41250