Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Поверхностная модификация наночастиц может придать им уникальные химические свойства, позволяющие модифицировать их поверхность функциональными биомолекулами. Однако, большинство существующих методов поверхностной модификации, такие, как физическая адсорбция или прямая химическая конъюгация имеют ряд серьезных недостатков. (1) На поверхности частиц должны быть представлены функциональные группы, стерически достпные для того, чтобы химическая конъюгация прошла правильным образом. Например, карбодиимидный EDC/sulfo-NHS метод требует оснащения поверхности наночастиц –COOH группами. (2) Большинство существующих методов биоконъюнгации не позволяют контролировать ориентацию присоединяемых к поверхности наночастиц молекул. (3) У низкомолекулярных соединений, присоединенных к поверхности наночастицы, существует проблема стерических затруднений при связывании с мишенью. (4) Может возникать частичная денатурация присоединяемых белков посредством нескольких функциональных группы (например, посредством нескольких ε-амино групп лизинов), приводя к частичной потере функциональной активности. (5) Может возникать проблема преимущественной конъюгации только одного из нескольких компонентов из-за различных физико-химических свойств компонентов (таких как pI, глобулярность белка, размер молекул, гидрофобность/гидрофильность и так далее). (6) Многоступенчатый процесс химической конъюгации является времязатратным (часто, до нескольких часов). (7) Может происходить потеря коллоидной стабильности на промежуточных стадиях биоконъюгации из-за изменения поверхностного заряда наночастиц. Эти проблемы ограничивают область применения наноструктур для тераностики и персонализированной медицины. Таким образом, существует острая необходимость в разработке новых подходов эффективного, селективного и быстрого присоединения биомолекул с правильной ориентацией к поверхности наночастиц. В ходе выполнения Проекта для решения этих проблем мы разработали различные универсальные стратегии биомодификации наночастиц для биомедицинских применений. Первый способ основан на SiO2-связывающем пептиде, который связывает поверхность наночастиц, и белковой адапторной системе, а именно, белковой паре барназа*барстар, служащей «молекулярным клеем» между пептидом и присоединенной биомолекулой. Белки барназа и барстар являются небольшими, гидрофильными и существенно не изменяют свойства создаваемых конструкций на основе наночастиц. Более того, эти белки не экспрессируются у млекопитающих, в отличие от, например, стрептавидин*биотин пары, широко используемой для биоконъюгации: эндогенный биотин может конкурировать за сайты связывания в разных системах in vivo. Разработанная нами процедура биомодификации наночастиц сведена к нескольким минутам, сохраняет ориентацию и функции биомолекул и позволяет контролировать количество и отношение присоединенных молекул. Возможности предлагаемой платформы для биомодификации наночастиц были продемонстрированы путем присоединения к различным типам наночастиц молекул DARPin9.29 и 4D5scFv, которые распознают онкомаркер HER2/neu, а также путем последующей высокоселективной доставки модифицированных наночастиц на различные раковые клетки, свехэкспрессирующие HER2/neu в одностадийном или двустадийном формате (с пре-таргетингом с помощью HER/neu-распознающей молекулы). Рецептор HER2/neu является членом семейства EGFR и сверхэкспрессируется в 20-30% случаев рака молочной железы, а также в некоторых других типах злокачественных новообразований. Сверхэкспрессия HER2/neu часто коррелирует с устойчивостью пациентов к химиотерапии, влекущей за собой высокий метастатический потенциал опухоли, высокий риск рецидива заболевания и связан с общей статистикой выживаемости. Однако этот рецептор представлен в гораздо меньшем количестве на многих типах здоровых человеческих клеток. Таким образом, точная оценка статуса HER2/neu раковых клеток имеет важное клиническое значение, и требует быстрых, точных и высокопроизводительных методов оценки как in vitro, так и in vivo. Мы показали, что разработанный нами метод сохраняет биологическую активность присоедиянемых к наночастицам молекул DARPin9.29, в то время как широко используемый карбодиимидный EDC/сульфо-NHS метод конъюгации приводил к полной потере функциональной активности DARPin9.29-модифицирвоанной наночастицы. Продемонстрированные возможности данной платформы позволяют рассматривать этот метод как перспективную альтернативу обычно используемым методам химическй конъюгации в нанобиотехнологии, тераностических и клинических применениях. Второй разработанный нами метод синтеза и модификации наночастиц основан на стабилизации наночастиц магнетита посредством короткого фрагмента белка из магнитотактических бактерий, который участвует в формировании магнитосом in vivo, а именно Mms6. Mms6 представляет собой небольшой белок (6.5 кДа), который играет ключевую роль в биоминерализации кристаллов магнетита и образовании магнитосом в бакетриях Magnetospirillum magnetum (штамм AMB-1). Мы разработали новый рекомбинантный слитый белок, содержащий C-концевую часть белка Mms6 (которая участвует в связывании магнетита) и барстара, как элемент белковой пары барназа*барстар, данный белок Bs-C-Mms6 был экспрессирован в E. coli [штамм BL21 (DE3)]. Было показано, что в широком диапазоне концентраций белок не влияет на жизнеспособность клеток. Измерение ферментативной активности барназы после инкубации с различными концентрациями Bs-C-Mms6 показало, что Bs-C-Mms6 ингибирует активность барназы, демонстрируя сохранение функциональности барстара в белке слияния. Специфичность и селективность формирования белкового комплекса барназа*Bs-C-Mms6 также была показана на поверхности эукариотических клеток. Мы показали, что нанокристаллы магнетита успешно стабилизируются белком Bs-C-Mms6 (в качестве контроля использовали различные другие белки). Только стабилизированные белком Bs-C-Mms6 частицы магнетита в физиологических условиях сохраняли свою стабильность агрегации (по сравнению с контрольными белками). Таким образом, мы получили функциональные наночастицы на стадии синтеза, готовые к к использованию для самосборки для экспериментов по доставке к клеткам как in vivo, так и in vitro. Более того, поскольку мы показали, что как Bs-C-Mms6, так и Bs-C-Mms6-стабилизированные наночастицы нетоксичны для клеток, их применение in vivo представляется особенно перспективным.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Поверхностная модификация наноструктур различными биологически активными молекулами позволяет успешно применять весь огромный потенциал различного рода нанообъектов для задач биомедицины. Функционально активные частицы обычно получают посредством их стабилизации различными полимерами на этапе синтеза и последующей химической модификацией различными биомолекулами, такими как, например, антитела и аптамеры. Это влечёт за собой ряд проблем, таких как неориентированное присоединение, маленькое число молекул на поверхности и невозможность легко варьировать присоединяемые компоненты по требованию. Для решения данной проблемы, в ходе реализации данного Проекта, мы разработали метод стабилизации наночастиц магнетита с одновременной модификацией функционально активным белком, а именно, барстаром, для последующей самосборки необходимых компонентов с этими частицами посредством взаимодействия высокоаффинной белковой пары барназа*барстар (Kaff = 10^14 М-1). В частности, нами был разработан биосовместимый белок слияния Bs-C-Mms6, содержащий С-концевую часть белка Mms6 (магнетит-связывающего белка магнитотактических бактерий) и барстара (ингибитор бактериальной рибонуклеазы барназы). С использованием данного белка получены стабильные в PBS наночастицы магнетита, модифицированные Bs-C-Mms6. Эти частицы могут быть использованы для самосборки с любым типом содержащих молекул, содержащих барназу. Чтобы продемонстрировать эффективность этого подхода для разработки наночастиц для адресной доставки, мы реализовали самосборку синтезированных наночастиц с белком слияния барназы и DARPin9.29, – DARPin9.29-Bn. Скаффолдовый белок DARPin9.29 распознает внеклеточный домен клинически значимого онкомаркера HER2/neu. Мы показали, что полученные таким образом наночастицы избирательно связываются с данным онкомаркером и могут быть использованы для детекции HER2/neu-позитивных раковых клеток в диагностических целях. Более того, было показано, что все белки из предложенной системы, а именно – барназа, барстар, и DARPin9.29-Bn на обладают гемотоксичностью: все исследуемые белки не вызывают гемагглютинации и гемолиза эритроцитов в широком диапазоне концентраций. Также была исследована иммуногенность белков барназы, барстара и DARPin9.29-Bn для иммунокомпетентных мышей линии BALB/c. Показано, что на 21 день после первой инъекции белков (всего 7 инъекций по 10 мкг) в сыворотке животных не обнаруживается белок-специфичных антител, что позволяет судить о возможности многократного введения исследуемых структур без серьезных рисков, ассоциированных со специфичным B-клеточным иммунным ответом организма. При том, что разрабатываемые в Проекте наноструктуры демонстрируют достаточную эффективность в in vitro экспериментах, возникает вопрос об их применимости in vivo. Для внутривенно введённых частиц, достаточно длительное время циркуляции в кровотоке является необходимым условием для адресной доставки препарата либо его постепенного высвобождения. Однако наночастицы, будучи введёнными в организм, воспринимаются его иммунной системой как инородные объекты, которые надо обезвредить или уничтожить. Макрофаги системы мононуклеарных фагоцитов эффективно удаляют чужеродные объекты, которые они в состоянии опознать. Таким образом, необходим поиск оптимальных путей введения наноструктур в организм и разработка методов, увеличивающих время циркуляции наноагентов в кровотоке. Для решения данной задачи было проведено исследование влияния предварительной инъекции в кровоток наночастиц магнитета в кремниевой оболочке разных размеров в разных дозах на время циркуляции в кровотоке модельных наночастиц магнетита размером 100 нм. Получены данные об эффективности блокировки макрофагов системы мононуклеарных фагоцитов магнитными наночастицами с кремниевой оболочкой с целью продления циркуляции целевых наночастиц в кровотоке. В частности, показано, что среди тестируемых частиц 1000 нм наночастицы наиболее успешно продлевают время циркуляци целевых частиц в дозе, соответствующей 5 мг/мышь весом 20 г. Показано увеличение времени циркуляции 100 нм целевых наночастиц в кровотоке в 4 раза. Полученные результаты могут быть применены для продления циркуляции адресных наноагентов для диагностики и терапии HER2/neu-положительных опухолей. Другим многообещающим подходом, позволяющим значительно усилить эффективность наноагентов in vivo, является их транспортировка на поверхности эритроцитов («RBC-hitchhiking») в крови. В проекте показано, что наночастицы, транспортируемые на поверхности эритроцитов в крови, могут быть использованы для увеличения эффективности доставки наночастиц и лечения опухоли даже в том случае, когда не наблюдается значительного продления времени циркуляции в кровотоке. В частности, показано, что такое транспортирование для 100 нм наночастиц может усилить доставку ненаправленных наночастиц в лёгкие в 120 раз. Для этого был проведен сравнительный анализ разных наночастиц в диапазоне размеров от 100 до 200 нм, с разными покрытиями и поверхностным зарядом. Были отобраны наночастицы, которые обладают оптимальной скоростью адсорбции/десорбции с поверхности эритроцитов и обладают минимальной токсичностью. Было также показано, что такое эритроцит-опосредованное перенаправление частиц в лёгкие можно использовать для эффективной борьбы с легочными метастазами агрессивной меланомы B16-F1. Продемонстрированная технология может стать ценным инструментом для разработки новых стратегий доставки на основе наночастиц размером около 100 нм для лечения агрессивных и мелкоклеточных типов рака, а также других заболеваний лёгких.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В течение третьего года реализации Проекта были получены эффективные наноагенты для онкотераностики, а именно, полимерные биодеградируемые PLGA наночастицы, загруженные визуализирующим красителем и химиотерапевтическим соединением, модифицированные скаффолдовым распознающим полипептидом – аффибоди, связывающим клинически значимый онкомаркер человека HER2. Данные наноагенты были всесторонне охарактеризованы различными физико-химическими методами, продемонстрирована их коллоидная стабильность в солевых растворах до и после модификации, а также подтверждены заявленные свойства. Было показано, что данные наноструктуры способны селективно визуализировать как in vitro, так и in vivo HER2-сверхэкспрессирующие раковые клетки. В частности, для данной задачи была разработана модель ксенографтной опухоли у иммунодефицитных мышей, сохраняющей экспрессию HER2 рецептора на протяжении всей регистрируемой динамики роста опухоли, а также экспрессирующей люциферазу для возможности прижизненной биолюминесцентной визуализации динамики роста опухоли in vivo. Также в ходе выполнения проекта были разработаны два метода, позволяющие значительно продлить время циркуляции наноагентов в кровотоке путем блокировки макрофагов системы мононуклеарных фагоцитов (а именно, биосовместимыми наночастицами или собственными клетками крови). Данные подходы позволили значительно усилить биомедицинскую эффективность магнитных наноструктур, в частности, усилить доставку в опухоль меланомы B16 магнитных наночастиц более чем в 50 раз по сравнению с контролем. Опубликовано 5 работ в изданиях, индексируемых WOS, при этом одна работа в Q1. Результаты работы представлены на трех российских и двух международных конференциях.