Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В ходе выполнения работ по Проекту при помощи физико-химических методов анализа, а также статистических данных был проведен отбор и анализ белкового растительного сырья, подходящего для механоферментативной переработки в компоненты продуктов функционального, специального и лечебно-профилактического питания. На основе данных Федеральной службы государственной статистики показано, что что производство зерновых и бобовых культур преобладает над остальными видами, большую долю среди бобовых (77 %) занимает горох. Установлено, что коэффициент утилитарности аминокислотного состава максимален у зерен гороха, что свидетельствует о его оптимальном соотношении аминокислот по отношению к эталонному белку куриного яйца. Проведенный анализ растительных культур по валовым сборам, а также биологической и пищевой ценности позволил выделить бобовые как наиболее перспективный тип растительного сырья для механоферментативной переработки в компоненты продуктов функционального, специального и лечебно-профилактического питания. Высокая пищевая ценность и сбалансированный аминокислотный состав позволили выделить биомассу семян гороха как перспективный объект для проведения исследований и установления физико-химических закономерностей, которые в последствии смогут быть перенесены на другие виды биомассы. Элементным анализом показано, что содержание белка в выбранной биомассе зерна гороха составляет 27,5 %, что согласуется с данными, полученными спектрофотометрическим методом Лоури. Определены молекулярные массы белков, выделенных из растительного сырья раствором гидроксида натрия. Были обнаружены полипептиды с молекулярными массами до 135 кДа, что полностью согласуется с литературными данными. Содержание крахмала, определенное по ранее разработанной исполнителями Проекта методике, составило 27,3 %, что близко к значениям, отмечаемым в литературе. Предложено для дальнейшего ферментативного гидролиза использовать препарат Протосубтилин ГЗХ (ПО «Сиббиофарм», Россия), содержащий не только претеазы, но и амилазу – фермент, гидролизующий крахмал. Протеазы компаний НПО «Агросистема», «Novozymes» и «Shandong Longda Bio-Products» отобраны для изучения фундаментальных аспектов протекания ферментативного гидролиза. Проведены работы по разделению выбранного белкового сырь – биомассы семян гороха – на фракции. В твердой фазе получены три фракции экстрактов и одна фракция нерастворимого остатка. Показано, что выделенные фракции значительно отличаются по химическому составу. Фракции № 1 и 2 благодаря содержанию белка можно считать белковыми, фракцию № 3 – белково-углеводной, а фракцию № 4 – углеводной, состоящей из крахмала, не растворимого в данных условиях. Можно предполагать, что для данных фракций будет отличаться характер процессов, протекающих при механической активации. Для ферментативного гидролиза целесообразно будет использовать ферменты с различным профилем каталитической активности. Методом гель-электрофореза было показано, что белковые молекулы всех выделенных фракций также имеют молекулярную массу от 5 кДа до 135 кДа, преобладают молекулы с достаточно высокой молекулярной массой от 24 кДа до 135 кДа. Показано, что в ходе механической обработки происходит разрушение модельных белковых молекул – альбумина и его димера – а также белков в составе выделенных фракций и в составе растительного сырья, с образованием смеси низкомолекулярных продуктов. Отмечено, что разложение наблюдается даже спустя две минуты, а спустя 10 минут разложилась значительная часть высокомолекулярных белков. Методом формольного титрования показано значительное увеличение количества концевых аминогрупп, свидетельствующих о разрушении цепей макромолекул. Сделан вывод, что роль механохимической обработки сводится не к полному (энергозатратному) крекингу белковых молекул, а в увеличении площади поверхности, доступной для реагентов, снижении степени кристалличности крахмала и разупорядочении структурной организации растительного сырья. Определены изменения удельной площади поверхности при измельчении биомассы семян гороха, а также предел измельчения. Из данных рентгеновской дифракции расчитаны степени кристалличности различных образцов крахмала, а также биомассы гороха до и после механохимической обработки. Показано, что крахмал, содержащийся в растительном сырье, а также выделенный и модифицированный для дальнейшего применения, может обладать степенью кристалличности в широком диапазоне значений и может быть разупорядочен различными методами, в том числе механохимически. Продемонстрированно, что аморфизация крахмала протекает довольно быстро в течение первой минуты механохимической обработки, а дальнейшее проведение обработки не приводит к значительным изменениям дифракционной картины. Степень кристалличности выделенного горохового крахмала и крахмала в составе биомассы семян гороха снизилась с 26 до 21 % и с 25 до 14 %, соответственно. Подобные изменения степени кристалличности, протекающие за технологически приемлемое время, дают основание прогнозировать высокую эффективность процесса механоферментативной переработки белкового растительного сырья, работы по изучению которого запланированы на второй год выполнения Проекта. Таким образом, были получены данные, касающиеся процессов, протекающих при механохимической обработке белковых веществ и крахмала в индивидуальном виде и в составе растительного сырья. Получена информация об изменении молекулярных масс белков, протекающем в результате механокрекинга, об снижении степени кристалличности крахмала. Сделано предположение, что роль механохимической обработки – при рассмотрении результатов с прикладной точки зрения – сводится к увеличению площади поверхности, доступной для реагентов, снижению степени кристалличности крахмала и разупорядочению структурной организации растительного сырья. Результаты работ по отбор и анализу белкового растительного сырья, подходящего для механоферментативной переработки в компоненты продуктов функционального, специального и лечебно-профилактического питания представлены в рукописях трёх статей. Анализ современных тенденций развития технологий на рынке белков принят к публикации в ведущем отраслевом журнале «Пищевая промышленность», а технологические особенности и перспективы использования растительных белков в индустрии питания – приняты к публикации в журнале «Хранение и переработка сельхозсырья» (входят в базу РИНЦ). Полученные результаты были представлены членом научного коллектива в виде устного доклада на Международной научной студенческой конференции «МНСК-18» (22-27 апреля 2018 г., Новосибирск). Работа заняла второе место в конкурсе, проводимом среди молодых учёных. Подана заявка на участие в V Международной конференции «Фундаментальные основы механохимических технологий» (25-28 июня 2018 г., Новосибирск).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках изучения механической активации растительного сырья в присутствии ферментов, а также установления закономерностей протекания ферментативного гидролиза активированного сырья были проведены работы по совместной механической активации биомассы и протеолитических ферментов, определению начальных скоростей и выходов гидролиза. Показано, что механическая обработка в условиях сдвигового воздействия протекает достаточно эффективно – средний диаметр частиц не превышает 50-70 мкм, что позволяет предположить высокую реакционную способность продуктов обработки при последующем гидролизе. Методом тепловой десорбции газа показано для активированных образцов более чем трехкратное увеличение удельной площади поверхности, что даёт право прогнозировать соответствующее увеличение начальной скорости реакции. Определение начальных скоростей и конечных выходов продуктов последующего за механической обработкой ферментативного гидролиза позволило заключить, что обработка в максимально энергонапряженном режиме позволяет проводить ферментативный гидролиз белков с большей начальной скоростью и с большей эффективностью (спустя 7-10 часов). Дальнейшее замедление гидролиза связано с достижением максимального выхода, при котором большинство белков гидролизовалось до водорастворимых соединений, а в качестве нерастворимых соединений выступают полисахариды, не гидролизуемые протеазами. В проведенных полнофакторных экспериментах были найдены оптимальные условия механоферментативного гидролиза: -- 1 стадия – гидролиз белков: температура: 50 оС, время – 6 часов, количество препарата 0,2 % от количества субстрата; -- 2 стадия – гидролиз крахмала: температура: 60 оС, время – 5 часов, количество препарата 0,8 % от количества субстрата; -- 3 стадия – гидролиз некрахмалистых полисахаридов и фитиновой кислоты: температура – 50 оС, время – 5 часов, количество целлюлозолитического препарата 0,3 %, глюкоамилазного препарата 0,4 %; фитазы – 0,01 %. Гидролиз белков и крахмала требуется проводить в последовательном режиме: сначала гидролиз белков, потом гидролиз крахмала. Добавление на этих стадиях ферментов, гидролизующих некрахмалистые полисахариды замедляет гидролиз. Показано, что в состав гидролизата входят низкомолекулярные продукты, предположительно аминокислоты и олигопептиды, присутствует незначительное количество белковых молекул со степенью полимеризации до 30 кДа. В состав углеводных компонентов входит преимущественно глюкоза с незначительными примесями маннозы и пентозанов. Показано, что совместная активация растительного сырья вместе с ферментами не приводит к повышению выхода. Полученная информация не позволяет говорить о получении механокомпозитов, характеризующихся высокими начальными скоростями гидролиза, что не согласуется с данными предварительных экспериментов, проведенных до начала работ по Гранту, когда образование механокомпозита было зафиксировано. Предложено объяснение, что было изменено вещество-носитель (стабилизатор), добавляемое в раствор ферментов перед распылительной сушкой. Данное объяснение согласуется с выводами ранних работ, где показано, что структура вещества, на которое сорбируется фермент во многом определяет устойчивость последнего при механическом воздействии. Для увеличения скорости лиофильной сушки получаемых гидролизатов, повышения точности контроля давления и температуры была модифицирована сушилка «Иней 4»: - установлен вакуумный датчик, обеспечивающий измерения давления в камере, где находится образец, что даёт исследователю информацию о ходе сушки и о моменте, когда вся вода удалилась из образца; - установлен игольчатый натекатель, который позволил значительно ускорить процесс сушки из-за более интенсивного переноса молекул воды от образца к конденсору; - установлены в камеру испарения три термопары, позволяющие получать дополнительную информацию о состоянии образцов. В биологических испытаниях полученного в оптимальных условиях гидролизата установлено, что однократное внутрижелудочное введение гидролизованной биомассы гороха самцам белых мышей в максимально допустимом объеме не вызывает существенных видимых изменений в общем состоянии и поведении на протяжении всего срока наблюдения. Однократное пероральное введение исследуемого препарата в максимально допустимом объеме не оказывает негативного влияния на показатели крови. Токсичность данного препарата может быть классифицирована как невыраженная. Согласно ГОСТ 12.1.007-76 по степени токсичности фармацевтических средств исследуемый препарат относится к IV классу опасности – вещества малоопасные. Исследования по влиянию гидролизованной гороховой биомассы на аминокислотный состав мяса показали, что в мясе цыплят группы, получавшей кормовую добавку в виде гидролизованной биомассы гороха, по сравнению с контролем повышено содержание белка, жира и большинства незаменимых аминокислот: изолейцина, метионина, треонина, триптофана. Таким образом, применение гидролизованной биомассы гороха цыплятам с первых дней жизни, способствует повышению питательных свойств мясной продукции, что выражается в повышении содержания белка (в том числе незаменимых аминокислот) и жира. Были разработаны рецептуры лиофилизованных супов-пюре: суп-пюре гороховый овощной и суп пюре гороховый с индейкой. По органолептическим показателям качества сухие супы не обладают посторонним привкусом и запахом, а при добавлении воды легко восстанавливаются в первоначальное состояние с сохранением исходных показателей качества. Готовые изделия характеризуются низкой кислотностью и невысоким содержанием жира. В супах, приготовленных на основе гидролизата, значительно повышена концентрация незаменимых аминокислот, а также количество низкомолекулярных углеводов, что может быть полезно спортсменам для восстановления сил после тренировки. В ходе выполнения Проекта были опубликованы следующие статьи: -- Bychkov A., Podgorbunskikh E., Bychkova E., Lomovsky O. Current achievement in the mechanically activated processing of plant raw materials // Biotechnology and Bioengineering. 2019. V. 116:5. P. 1231-1244. -- Bychkov A.L., Gavrilova K.V., Bychkova E.S., Akimenko Z.A., Chernonosov A.A., Kalambet Y.A., Lomovskii O.I. Fractionation and hydrolysis of proteins of plant raw materials obtaining functional nutrition products // IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 2019. V. 479:1. # 012001. Статья авторов Гаврилова К.В., Бычков А.Л., Бычкова Е.С., Акименко З.А., Черноносов А.А., Каламбет Ю.А., Ломовский О.И. под названием «Механически активированный гидролиз белкового растительного сырья для получения пищевых компонентов» принята к печати в журнал Foods and Raw Materials.