Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В ходе проекта было проведено компьютерное моделирование структуры филамента DED домена каспазы-8 и компьютерный дизайн потенциальных ингибиторов образования филаментов на основе низкомолекулярных химических соединений, а также пептидов. Полученная модель филамента позволила провести детальный анализ и предсказание участков, ключевых для взаимодействия DED доменов в составе филамента. Наибольшее число взаимодействующих остатков наблюдалось на интерфейсе взаимодействия DED2 домена с DED1 доменом. В связи с этим, дальнейший рациональный дизайн низкомолекулярных соединений и пептидов был сфокусирован на ингибировании взаимодействия DED1 домена с DED2 доменом. Проведенный анализ DED2 домена белка каспазы-8 позволил выявить гидрофобную полость которая и была использована для поиска ингибиторов с помощью виртуального скрининга библиотеки малых химических соединений ZINC, из числа которых были идентифицированы 20 соединений кандидатов для экспериментальной проверки. Также были разработаны модели структуры пептидов, кандидатов для пептидных ингибиторов. В результате оптимизации структуры данных пептидов путем аминокислотных замен были получены структуры трех новых пептидов-кандидатов, обладающих, согласно моделированию методом молекулярной динамики в неявной воде, повышенной стабильностью вторичной структуры. Дополнительно были предложены модификации этих пептидов, повышающие их стабильность, расчет которых осуществлялся с использованием подхода дизайна «сшитых» пептидов. Также в рамках проекта была проведена экспериментальная проверка действия низкомолекулярных химических соединений casp8in. Соединения группы casp8in согласно теоретическим предсказанием должны ингибировать активацию каспазы-8 и соответственно индукцию апоптоза через внешний путь индуцируемый цитокинами семейства фактора некроза опухоли (CD95 лигандом (CD95L, от анг., CD95 Ligand) и TRAIL). Соединения были проверены при добавлении CD95L, вызывающего индукцию внешнего пути апоптоза через активацию каспазы-8 в комплексе DISC, в комбинации с соединениями Сaspin8. Кроме того в панель первичной проверки соединений был включен цитокин TRAIL, который в настоящее время более широко используется в клинических и доклинических испытаниях. TRAIL связывается с другим рецептором гибели TRAIL-R1/R2 и также вызывает клеточную гибель через активацию каспазы-8 в комплексе DISC. Все эксперименты проводились в соответствии с разработанными ранее методиками на клеточной линии Jurkat. Интересно, что фактически все соединения группы Сaspin8 продемонстрировали небольшие ингибирующие эффекты на клеточную гибель в низких концентрациях в соответствии с их предсказанным механизмом действия как ингибиторов каспазы-8. Более того, в ходе исследований было проведено изучение тканеспецифичности действия малых химических соединений casp8in и FLIPin. Проведенные исследования показали, что эффекты по ингибированию клеточной гибели соединениеми casp8in наблюдаемые на других клеточных линиях, были не очень значительные и не превосходили эффекты, наблюдаемые на клеточной линии Jurkat, что позволило сделать заключение о том что именно линия Jurkat является оптимальной клеточной моделью для разработки соединений casp8in. Кроме проверки соединений Сaspin8 на других клеточных линиях также была проведена проверка действия низкомолекулярных соединений группы FLIPin на других клеточных линиях при действии CD95L. Следует отметить, что соединения группы FLIPin разработанные в ходе первого этапа проекта специфически взаимодействуют с длинной изоформой белка с-FLIP (c-FLIPL) и, согласно предложенной модели, ускоряют апоптоз в составе гетеродимера c-FLIPL-каспаза-8. Проверка их действия на различных клеточных линиях также с использованием системы измерении жизнеспособности клеток, основанного на детектировании АТР, показала, что соединения группы FLIPin имеют наибольшую эффективность действия в клеточной линии HeLa с повышенной экспрессией длинной изоформы белка с-FLIP-с-FLIPL (HeLa-CD95-FL), что еще раз показывает специфичность их действия. Также было проведено изучение эффектов комбинированного действия соединения FLIPin В и цитокина TRAIL. Цитокин TRAIL в настоящее время широко используется в клинических и доклинических испытаниях. TRAIL связывается с другим рецептором гибели TRAIL-R1/R2 и также вызывает клеточную гибель через активацию каспазы-8 в комплексе DISC. с-FLIPL является также важным регулятором TRAIL-опосредованного апоптоза, и также как и в случае CD95-опосредованного апоптоза способен образовывать гетеродимер c-FLIPL-каспаза-8, который ускоряет клеточную гибель за счет более эффективной активации каспазы-8. Комбинаторное воздействие соединения FLIPin В и цитокина TRAIL было протестировано на широкой панели клеточных линий, в которую входили: клеточная линия HeLa-CD95, клеточная линия острого лейкоза OCI-AML, Т клеточная линия Jurkat и клеточная линия острого лейкоза MV4-11. Измерения проводились также с использованием системы измерения жизнеспособности клеток. Важным результатом данных исследований стало детектирование более эффективного действия соединения FLIPin В в комбинации с цитокином TRAIL, по сравнению с аналогичными данными при комбинаторном воздействии с CD95L. Все протестированные клеточные линии показали пониженное количество жизнеспособных клеток при комбинаторном воздействии соединения FLIPin В и цитокина TRAIL по сравнению с действием одним цитокином TRAIL. Данные результаты показывают на возможные различия молекулярного механизма действия белка с-FLIPL при индукции TRAIL-опосредованного апоптоза и безусловно требуют дальнейшего изучения. Кроме того проведенные исследования указывают на важнейший терапевтический потенциал данного подхода и возможность его применения для лечения онкологических заболеваний. Наконец, был проведен компьютерный анализ взаимодействия молекулярно-генетических сети (МГС) внешнего пути апоптоза с МГС семи различных патологических состояний (агрессивное поведение, тревожный невроз, коморбидное состояние астмы и гипертонии, нарушения аутистического спектра, большое депрессивное расстройство, болезнь Паркинсона, хроническое заболевание вируса гепатита С). Компьютерный анализ проводился с помощью комплексного подхода, включающего разработанные методы приоритезации генов, на основе анализа структуры сети, а также известных методов приоритезации генов. Выявлено 819 дифференциально экспрессирующихся генов в гипоталамусе, вентральной тегментальной области и в сером веществе периакведуктума у крыс с агрессивным и дружелюбным поведением (Брагин с соавт., 2017). Среди этих дифференциально экспрессирующихся генов 11 генов (Bag3, Cx3cl1, Src, Dapk1, Gclc, Krt8, Nrg1, Ret, Scg2, Tlr3 и Unc5b) вовлечены во внешний путь апоптоза. Дополнительно были выявлены гены, участие которых в апоптозе обусловлено посредством взаимодействий в анализируемых сетях с генами нейронального апоптоза, включая Tsc1, Adamts4, Lgals3, Ezr, Acan, Th и др.) (Брагин с соавт., 2017). Анализ генов аутистического спектра показал, что наиболее перспективными для дальнейшего исследования в экспериментах в качестве потенциальных мишеней могут быть гены ERBB3, PARK7, FYN, BCL2 и JAK2, вовлеченные во внешний путь апоптоза. Среди перспективных для дальнейшего экспериментального исследования генов депрессивных расстройств, согласно компьютерному анализу, оказались гены-кандидаты (GRIN1, F2R и PPARGC1A) из числа генов нейронального апоптоза, а также ген FASLG, вовлеченный во внешний путь апоптоза. Максимальным приоритетом среди генов, ассоциированных с болезнью Паркинсона, имели гены внешнего пути апоптоза, включая BCL2, CASP3 и HMOX1, GSK3A и JAK2. Анализ МГС хронического заболевания вируса гепатита С позволил выявить 40 белков человека, вовлеченных во внешний путь апоптоза, являющихся мишенями белков вируса гепатита С, обладающих высокими значениями показателей центральности в МГС, среди которых наиболее важными являются TNF, TGFB1, IFNG, SRC, AKT1 и IL2.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе выполнения проекта с применением метода виртуального скрининга было проведено предсказание структур химических соединений - кандидатов для специфичного ингибирования включения белка c-FLIP в состав DED филамента. В результате был получен набор низкомолекулярных химических соединений, потенциально способных ингибировать взаимодействия белка c-FLIP с DED доменами по типу III, при этом, не блокируя тип III взаимодействия между DED доменами каспазы-8. Специфичность данного подхода обуславливается различиями в первичной и третичной структурах участка связывания низкомолекулярного соединения, по сравнению с белком c-FLIP. На основе анализа взаимодействия вирусного белка ks-v-FLIP и NEMO, а также структурного моделирования по гомологии были получены структуры пептидов, способных специфически связываться с DED1 доменом белка c-FLIP. Анализ взаимодействий с использованием метода имуннопреципитации показал, что разработанные пептиды способны специфически связываться с изоформами белка c-FLIP, содержащими DED домены. Было показано, что рационально сконструированный пептид, названный superFNIIP, способен ингибировать активацию CD95 индуцированную активацию сигнального пути NF-kB. Полученные результаты являются основой для дальнейшей разработки новых активаторов клеточной гибели. Для улучшения физико-химических свойств соединения FLIPinВ в 2016 году был проведен химический синтез, который позволил получить водорастворимые аналоги данного соединения- соединение FLIPinВΥ. Эффективность действия данного соединения была проверена с помощью систем детектирования клеточной гибели и систем измерения активности каспаз с использованием наборов, производимых фирмой Промега. В клинических и доклинических испытаниях в настоящее время более широко используется цитокин TRAIL, который связывается с рецепторами гибели TRAIL-R1/R2. Это связано, в первую очередь, с более низкой токсичностью данного цитокина по сравнению с СD95L, несмотря на то, что механизм данного явления, по-прежнему, является неустановленным. Поэтому на данном этапе проекта было проанализировано действие соединения FLIPinВΥ в комбинации с цитокином TRAIL. Для данных экспериментов была использована система тестирования разработанная для СD95L: аналогичные концентрации лиганда, водорастворимого аналога малого химического соединения FLIPinВ и времена инкубации. Данный анализ позволил установить, что TRAIL обладает более эффективным действием на индукцию клеточной гибели при комбинированном воздействии c соединением FLIPinВΥ по сравнению с СD95L и, таким образом, позволяет предположить потенциальное клиническое применение соединения FLIPinВ. В заключении, действие цитокина TRAIL в комбинации с соединениями FLIPinВ было протестировано на материале, полученном непосредственно от пациентов с острым миелоидным лейкозом и также показало эффективность действия. Данный анализ позволил установить, что лиганд TRAIL обладает эффективным действием на индукцию клеточной гибели при комбинированном воздействии c соединением FLIPinВΥ и, таким образом, позволяет предположить потенциальное клиническое применение соединения FLIPinВ. Помимо тестирования цитокина TRAIL на действие соединения FLIPinВ, были проверены его эффекты на действие других соединений разработанных в проекте, в частности, соединений casp8in и FADDin. При этом, также была использоваться система тестирования разработанная на предыдущих этапах проекта для СD95L: аналогичные концентрации лиганда, малого химического соединения и времена инкубации. Для детектирования потери жизнеспособности клеток использовалась система от фирмы Промега. В результате данных исследований было отобрано химическое соединение casp8inЕ, которое показало значительную эффективность действия при комбинаторном воздействии с цитокином TRAIL. В частности было показано, что данное соединение эффективно блокирует активацию каспаз и клеточную гибель, индуцированные через рецептор гибели, что соответствует предполагаемому механизму действия данного соединения. Таким образом, были получены данные о том, что данное разработанное соединение обладает наибольшим клиническим потенциалом для комбинаторного воздействия с цитокином TRAIL. В заключении, был проведен расширенный анализ молекулярно-генетических (МГ) сетей, описывающих взаимодействия внешнего пути апоптоза и патологических процессов, включая паразит/хозяин. Расширение МГ сетей проводилось путем анализа текстов полноразмерных научных статей с помощью методов автоматического извлечения знаний о молекулярно-генетических взаимодействиях. Для реконструкции МГ сетей дополнительно к данным, полученным при анализе текстов PubMed, использовались данные, полученные при анализе полноразмерных статей, доступных в PubMed Central. Анализ молекулярно-генетических сетей позволил выявить 44 белка, которые вовлечены во внешний путь апоптоза и являются мишенями ВГС. Среди этих белков можно выделить TNF, IFN-gamma, SRC, TGFB1, IL-2 и RAC, обладающих наибольшей центральностью в ассоциативной генной сети. Было показано, что механизмы взаимодействия апоптоза и патологических процессов при коморбидном сотоянии астмы и гипертонии затрагивают такие гены как IL1A, CD40LG, STAT3, IL15, FAS, APP, TLR2, C3, IL13 и CXCL10. Кроме того, проведен анализ структурных особенностей генной сети внешнего пути апоптоза для пяти тканей (лимфатический узел, эндометрий, эмбриональная ткань, сетчатка и чёрная субстанция) с помощью расширенной версии системы ANDSystem. Показано, что учет тканеспецифичности имеет важное значение при анализе генных сетей, в частности, при решении задачи поиска наиболее значимых центральных генов, и может найти применение в широком круге медико-биологических исследований, нацеленных на анализ различных биологических процессов, протекающих в отдельно взятых тканях.