Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Исследования, проведенные в рамках этапа 2017 года можно разделить на три блока: исследования и разработки в области развития методов и техники масс-спектрометрии ИЦР ультравысокого разрешения; исследования в области разработки новых методов и подходов; исследования биологических и медицинских образцов с использованием техники масс-спектрометрии ультравысокого разрешения; исследование сложных биологических и природных соединений и их смесей при помощи масс-спектрометрии ультравысокого разрешения. В рамках блока направлений, связанных с развитием техники и методов масс-спектрометрии ультравысокого разрешения основные усилия были сосредоточены на разработке подходов к увеличению временной стабильности сигнала ИЦР с целью повышения чувствительности и разрешающей способности масс-спектрометров ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье. Основное внимание было уделено исследованию влияния вакуумных условий на стабильность и воспроизводимость сигналов ИЦР. Эти условия во многом определяют разрешающую способность и чувствительность в режиме ультравысокого разрешения, т.к. длительность временного сигнала, необходимая для получения разрешающей способности на уровне, превышающем миллион, составляет многие минуты. На предыдущих этапах проекта уже были усовершенствованы системы детектирования и обработки сигнала. В рамках этапа проекта в 2017 году были проведены исследования влияния локального давления (давления непосредственно в измерительной ячейке) на разрешающую способность масс-спектрометра с гармонизированной измерительной ячейкой. Локальное давление отличается от измеряемого давления в вакуумной системе из-за прямого транспорта молекул из области высокого давления в ионною ловушку спектрометра молекулярным пучком. Было предложено и апробировано техническое решение для создания системы локальной откачки в области измерительной ячейки ИЦР на основе титанового сублимационного насоса, монтируемого непосредственно в области измерительной ячейки ИЦР и позволяющего понизить локальное давление в системе ниже достижимого при помощи откачки турбомолекулярным насосом более чем в три раза. В качестве индикатора локального давления использовался сам временной сигнал ИЦР. Однако, было показано, что выигрыш в разрешающей способности от внедрения сложной и громоздкой системы сублимационной откачки сравним с потерями в разрешающей способности, возникающими вследствие дрейфа частоты, вызванного нестабильностью числа ионов в измерительной ячейке, неоднородностью магнитного поля и несовершенством геометрии ячейки. Поэтому, было принято решение дальнейшие работы по оптимизации параметров измерительной ячейки сосредоточить на поиске способов уменьшения влияния этих эффектов. Для уменьшения проникновения нейтральных молекул из области с атмосферным давлением в область ультравысокого вакуума, в которой функционирует измерительная ячейка ИЦР были проведены работы по оптимизации конструкции вакуумной камеры масс-спектрометра в интерфейсе перехода из области низкого вакуума в форвакуум. Для этого была создана электродинамическая ионная воронка, в конструкции которой был предусмотрен ряд новых решений, существенно упрощающих обслуживание ионной воронки и позволяющих располагать нагреваемый капилляр, выполняющий роль входного интерфейса масс-спектрометра, смещенным относительно оси воронки. Было продемонстрировано, что такое решение позволяет существенно понизить количество нейтральных молекул, которые попадают из нагреваемого капилляра прямиком в измерительную ловушку прибора и таким образом уменьшать локальное давление в ней. Кроме этого, в результате произведенной модификации системы ввода ионов, стеклянный нагреваемый капилляр был заменен на металлический, что существенно упростило процесс создания и адаптации к масс-спектрометру ионных источников разной конструкции, а том числе источника с косвенным нагревом, источника с двумя параллельными капиллярами и т.п., которые использовались при решении других задач в рамках проекта. В рамках второго из вышеперечисленных направлений исследований, а именно разработки новых методов и подходов исследования биологических и медицинских объектов с использованием техники масс-спектрометрии ультравысокого разрешения, были выполнены работы, направленные на создание новых методов ионизации и разработку ионных источников новой конструкции, прежде не использовавшихся совместно с масс-спектрометрами ультравысокого разрешения. Для демонстрации возможностей осуществления, обнаруженного нами ранее в рамках работ по проекту явления суперметаллизации и H/D обмена на пролете была разработана конструкция ионного источника, основанного на методе электроспрея, содержащего два параллельных капилляра, один из которых прогревается до высокой температуры (650 К и выше) а другой работает параллельно в стандартных условиях. При помощи этого ионного источника были проведены детальные исследования особенностей процессов H/D обмена и фрагментации ионов в нагреваемом капилляре и была показана возможность осуществления структурных исследований при помощи разработанного подхода. Помимо этого, был детально исследован процесс фрагментации ионов пептидов в нагреваемом капилляре и была показана возможность проведения экспресс-идентификации пептидов и белков при помощи фрагментации такого типа с использованием data-independent анализа совместно с хроматографическим разделением. Одним из наиболее быстро развивающихся направлений современных исследований в области биомедицинской масс-спектрометрии является разработка методов построения изображений поверхностей срезов тканей в различных ионах (mass spectrometry imaging в англоязычной литературе)- метод, использование которого позволяет не только сроить изображение срезов тканей и органов но и отслеживать распространение определенных веществ в них напрямую, без использования косвенных методов (красители, метки и пр.). В рамках этапа 2017 года были проведены работы по созданию методов построения масс-спектрометрических изображений с использованием масс-спектрометров ионного циклотронного резонанса. Сложность задачи создания таких методов и ионных источников на их основе состоит в необходимости обеспечения функционирования таких источников в режиме накопления ионов, что с одной стороны увеличивает время сканирования. Для решения этой задачи была разработана оригинальная система акустооптического лазерного сканирования на основе лазера с длиной волны 2940-3100 нм и системы фокусировки лазерного пучка, обеспечивающей формирование пятна, диаметр которого 20-30 мкм. Использование такой «неизнашиваемой» системы позволяет осуществлять эффективную десорбцию и быстрое сканирование поверхности образцов с пространственным разрешением, достаточным для исследования биологических образцов макроскопического размера – срезов тканей и органов. Одним из новых методов исследования структуры исследуемых молекул (положения в них двойных связей) является использование реакции озонирования в процессе электроспрея. Озонирование модифицирует также молекулы подверженные окислению: фенолы, спирты и т.д. В то же время, задача обнаружения изолированных двойных и тройных С-С связей в составе гуминовых веществ (ГВ), остается не решенной, так как при структурном анализе методом спектроскопии ЯМР происходит перекрывание спектральных линий. Это не позволяет однозначно определить все типы углерода. Поэтому в рамках проекта был разработан подход озонирования суспензии гуминовых веществ в CCl4 путем 20 минутного барботирования озоном со скоростью 200 мл/мин. Эксперимент проводили на растворенном органическом веществе реки Суввани – SRDOM (стандарт Международного гуминового общества). Было показано, что действие озона приводит к появлению более насыщенных компонентов, которые отсутствовали в исходном образец. Это можно объяснить раскрытием ароматических колец фенолов и хинонов в составе ГВ под действием озона. В то же время молекулы с увеличенным содержанием кислорода, которые соответствовали бы внедрению озона по двойной связи, не наблюдались. Это свидетельствует об отсутствии изолированных кратных С-С связей в составе речных гуминовых веществ. В качестве прямого метода определения структурных фрагментов индивидуальных компонентов сложных систем является химическая модификация кислородных функциональных групп. Поэтому в рамках проекта был разработан поход определения распределения карбоксильных групп по индивидуальным молекулам в составе гуминовых веществ. В рамках задач, целью которых является исследование сложных биологических и природных соединений и их смесей при помощи масс-спектрометрии ультравысокого разрешения были проведены исследования возможности применения TopDown метода протеомного анализа на примере определения пострансляционных модификаций и аминокислотных замен белков транстиретина и казеина, присутствующих в природе одновременно в виде нескольких форм с использованием методов масс-спектрометрии ультравысокого разрешения в комбинации с методами фрагментации ионов исследуемых веществ при захвате электрона, поглощении излучения ИК лазера и столкновениях с нейтралями, в том числе, в десольвирующем капилляре электроспрейного источника. Были выполнены сравнительные эксперименты на этих же белках по поиску и идентификации посттрансляционных модификаций и аминокислотных замен методами Bottom Up. Была показана возможность исследования изоформ и модификаций этих белков, а также модификаций указанных белков на основе анализа тонкой структуры их изотопов в масс-спектрах родительских ионов и масс-спектрах фрагментов. В сотрудничестве с Центром акушерства, гинекологии и перинатологии им В.И. Кулакова с применением разработанных методов построения изображений были получены молекулярные изображения на основе масс-спектроров ультравысокого разрешения срезов тканей опухолей матки, возникающих при развитии гиперпролиферативных заболеваний. Таким образом, появилась возможность продолжить исследования и провести сравнительный анализ масс-спектрометрических изображений опухолей матки разного типа. Помимо протеомных, липидомных и метаболомных исследований в рамках этапа проекта 2017 года было проведено сравнение молекулярного состава органического вещества Земли и космического происхождения. К сожалению, из-за особенностей политической ситуации не удалось произвести исследования органики, выделенной из образцов лунного грунта американской коллекции. Ввиду ограниченности доступного для исследования материала (Институт Геохимии РАН выдал только 0.1г образца лунного грунта) провести сравнительный анализ на основе различных методов экстракции и предварительного фракционирования методами гель-хроматографии не удалось. Поэтому для интерпретации масс-спектрометрических данных, полученных в результате исследования органического вещества лунного грунта, выделенного нами ранее, был проведен сравнительный анализ на основе статистической информации, полученной при исследовании земного органического вещества различного происхождения. Для этого были по той же методике, которая использовалась при получении масс-спектров органического вещества из лунного грунта, измерены масс-спектры ультравысокого разрешения речных гуминовых веществ, бурого угля, торфа, биотоплива, биомассы зеленых водорослей. Картирование молекулярных составов на диаграмме Ван Кревелена показало, что органическое вещество космического происхождения отличается максимальным вкладом низкооксиленных молекул с O/C<0.5, причем их составляли как молекулы алифатического характера с H/C>1.5, так и ароматические соединения с H/C<1. На основании проведенных исследований был сделан вывод, что особенностью органического вещества лунного грунта является нетипичный для земных источников высокий вклад азот- и серосодержащих соединений. Действительно, только угольные гуминовые вещества характеризуются близки вкладом CHON-компонентов. Различие молекулярного состава органического вещества земной и космической природы можно объяснить принципиально различными условиями их синтеза. Считается, что природное органическое вещество земного происхождения получается в результате окислительной поликонденсации и биодеструкции полифенолов. Получаемые ароматические продукты устойчивы к полной минерализации и накапливаются в природных источниках: почве, торфе, углях и т.д. Органическое вещество космического происхождения получается в результате радиационного действия на простые неорганические молекулы протопланетного диска, такие как CO, CH3OH, NH3, CH4. Причем основным действующим механизмом является рекомбинация радикалов без доступа кислорода с последующей циклизацией органических интермедиатов. Полученную информацию можно использовать как базу для последующих фундаментальных сравнительных исследований органического вещества земного и космического происхождения.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Реализованы методы протеомного анализа, основанные на методике по нисходящей или сверху-вниз (top- down) в комбинации с подходом bottom up (по восходящей или снизу вверх) с целью исследования структурных особенностей моноклональных антител, включая анализ локализации S-S связей. В качестве объекта исследования был выбран экулизумаб (eculizumab), который является рекомбинантным гуманизированным моноклональным антителом – каппа-иммуноглобулином (IgG2/4k). В результате использования различных ферментов (трипсин, Lys-C и Glu-C, и нескольких их комбинаций) получено 100%-ное покрытие сиквенса белка. При анализе модификаций было отмечено, что первый остаток тяжелой цепи конвертирован в пироглутамат. При анализе деамидирования наблюдалась высокая степень модификации по остатку 298 тяжелой цепи, а также значительный уровень деамидирования по остаткам 316 и 385 тяжелой цепи, в то время как в легкой цепи значимых уровней деамидирования не наблюдается. Предложенный подход к анализу локализации S-S связей показал свою эффективность. С помощью анализа масс-спектров S-S связанных пептидов, полученных в результате гидролиза различными ферментами, удалось локализовать как ранее подтвержденные и ожидаемые внутренние S-S связи, так и установить новые ранее не подтвержденные. 2. Разработан новый прототип комбинированного источника ионизации, совмещающий четыре метода ионизации: обычное и нативное электрораспыление (ЭР), радиоактивную ионизацию и фотоионизацию при атмосферном давлении (ФИАД). Преимущества данного источника состоит не только в комбинации различных независимых методов ионизации, но и в новой системе транспорта ионов по параллельным капиллярам, один из которых можно нагревать до 400 оС. Такой нагрев приводит к термической фрагментации больших молекул, в частности белков и пептидов. В итоге, в масс-анализатор попадает как материнский молекулярный ион пептида, так и ионы его фрагментов. Это позволяет быстро и надежно определять структуру соединения. Ранее на предыдущем этапе исследования нами были продемонстрированы эксперименты по озонированию и исследованию смесей липидов. В текущем году удалось проанализировать продукты озонирования плазменного фибринстабилизирующего фактора (FXIII) в режиме с хроматографическим разделением. Впервые исследована модификация каталитической субъединицы FXIII-A плазменного фибринстабилизирующего фактора при его индуцированном окислении с помощью озона. Показано, что в результате окисления белка обнаруживаются модифицированные сайты во всех структурных элементах субъединицы FXIII-A: β-сэндвич (Tyr104, Tyr117, Cys153), каталитический домен (Met160, Trp165, Met266, Cys328, Asp352, Pro387, Arg409, Cys410, Tyr442, Met475, Met476, Tyr482, Met500), β-цилиндр 1 (Met596), β-цилиндр 2 (Met647, Pro676, Trp692, Cys696, Met710). Результаты данного исследования вошли в обзорную статью коллектива по H/D обмену в истоничке ионизации в высокорейтинговом журнале (Kostyukevich et al., Mass. Spec. Rev., 2018, 37, 811–853). 3. Разработан интерфейс к масс-спектрометру ИЦР для получения изображений срезов тканей при высоком разрешении масс-спектрометра на основе устройства двухкоординатного сканирования. В интерфейсе предусмотрена и реализована возможность ионизации срезов лазером (MALDI). В партнерстве с НМИЦ нейрохирургии им. Н.Н.Бурденко были получены и проанализированы масс-спектрометрические изображения опухолевых тканей мозга. В качестве демонстрационного объекта был использованы образцы анапластической астроцитомы. Данная опухоль характеризуется наличием больших пространственных гетерогенностей, в частности, из-за наличия вкраплений некрозов в солидную часть, что делает ее подходящим объектом для апробации методик масс-спектрометрического построения изображений. Для некротического кластера с помощью решающего дерева были выявлены характерные ионы, которые в дальнейшем удалось идентифицировать с помощью MS/MS анализа. В частности, оказалось, что сигналы от SM 34:2[M+H]+, SM 36:4[M+H]+, SM 38:4[M+H]+ характеризуют некротическую область опухоли. 4. Совместно с Центром акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова проведены демонстрационные эксперименты, показывающие возможности построения масс-спектрометрических изображений тканей плаценты. Продемонстрировано хорошее соответствие масс-спектрометрического изображения, построенного по отдельным ионам соответствующих липидов и гистологического изображения. Также идентифицированы основные ионы, которые позволяют четко выделять области, соответствующие различным типам тканей. Например, показано, что два различных фосфатидил холина (PC 36:4 и PC 32:0) характерны для стволовых и терминальных ворсин хориона. 5. В рамках исследования молекулярного строения растворимого органического вещества (РОВ) природного происхождения, совместно с группой проф. Перминовой И.В. (Хим. факультет МГУ ) проведено сравнение широкой выборки образцов, выделенных из водоемов различных широт: средних, тропических и арктических. Визуализация полученных данных масс-спектрометрии высокого разрешения на диаграммах ван Кревелена с последующим разбиением диаграммы на классы органических соединений выявило значимые отличия между образцами. Показано, что арктические образцы характеризуются большим вкладом насыщенных компонентов (алифатических и пептидов) и очень низким вкладом полифенолов. Это указывает на низкую степень трансформации РОВ арктических широт. В то же время образцы умеренных и тропических широт почти не содержат насыщенных соединения и обогащены ароматическими структурами, что подчеркивает высокую степень микробиологического разложения в окружающей среде. Разработанные коллективом проекта масс-спектрометрические подходы для исследования природных объектов были применены для идентификации нового класса биологически активных пиридиновых алкалоидов – метаболитов грибов Aspergillus cavernicola. Разработанные для анализа природного органического вещества методы пробоподготовки и анализа с использованием МС ИЦР ПФ, были применены для определения распределения различных классов органических соединений по молекулярному составу щелочно-растворимой фракции метеорита Мерчисон. Для этого проводили анализ экстракта, очищенного методом твердофазной экстракции, аналогичной для образцов бурого угля, до и после инкубации в D2O, для замещения всех подвижных протонов в функциональных группах. Мы обнаружили, что S-содержащие соединения составляют основную долю всех соединений нерастворимого органического вещества. Причем мы обнаружили, что распределение кислородных классов по интенсивности совпадает для СНО и CHOS соединения, что говорит о восстановленном характере серы в серосодержащих соединениях. Для определения типа серы мы оценивали количество дейтероводородных обменов и количество гетероатомов в соединениях, которые несут подвижные протоны. Результаты подсчета для 300 наиболее интенсивных пиков в масс-спектре были подсчитаны количества обменов и предложен тип атома серы и класс органических соединений. Как видно, количество подвижных протонов меняется в S-содержащих соединениях от 2-х до 6. Это, в зависимости от молекулярного состава, соответствует разным валентным состояниям серы от тиолов (S-2) до сульфоновой группы (S+4). По результатам исследования подготовлена статья в журнал Geochimica et Cosmochimica Acta (IF 4.1). Также в рамках проекта нами был разработан источник ионизации, позволяющий проводить фотоионизацию испарения нефти при различном давлении – от атмосферного до 10 торр. Впервые, показано, что при атмосферном давлении в масс-спектрах нефти доминируют CHN соединения, в то время как при создании условий разряженной атмосферы вплоть до 10 торр мы в масс-спектре доминируют ионы углеводородов. Результаты исследования представлены в виде публикации в высокорейтинговом журнале (Kostyukevich et al., Anal. Chem. 2018, 90 (15), 8756-8763). Наряду с гуминовыми веществами и цианобактериями, которые являются природными источниками углерода, в настоящее время появилась целый пул биомассы, получаемой из отходов пищевой промышленности и товаров потребления. Скорость накапливания такой биомассы столь большая, что использование её для получения биотоплива и биоактивных пищевых добавок так же является перспективным направлением. Поэтому мы провели аналогичный эксперимент по высокотемпературному сжижению биомассы отходов сыра и мяса. Анализ МС ИЦР ПФ показал доминирующий вклад CHN компонентов, однако в отличие от цианобактерий, так же обнаруживались соединения ON2 класса. Появление кислородсодержащих компонентов объясняется присутствием жиров и углеводов в составе мяса и сыра, что отличает их биохимический состав от синезеленых водорослей, состоящих на 70% из белка. Тем не менее, сопоставление данных с помощью диаграммы Венна, показывающей пересечение молекулярного пространства, показало совпадение более 50% молекулярных формул для биотоплива, полученного из пищевых отходов и цианобактерий. Результаты исследования были опубликованы в высокорейтинговых зарубежных журналах (Perminova IV, et. al. Environ Sci Technol. 2018 Oct 8. doi: 10.1021/acs.est.8b01029; Altınelataman C, et.al. Food Chem. 2019 Jan 15;271:724-732. doi: 10.1016/j.foodchem.2018.08.004. Epub 2018 Aug 3.). 6. Реализован новый метод высокопроизводительного сбора MS/MS данных (data undependent analysis - DIA, аналог SWATH). Метод был реализован с помощью оригинального входного интерфейса, состоящего из 2-х входных капилляров для транспорта ионов. Новая система транспорта ионов позволяет проводить ионы по параллельным капиллярам, один из которых можно нагревать до высоких температур (400 оС) с целью фрагментации. Как было отмечено выше, такой нагрев внутри транспортного капилляра приводит к термической фрагментации больших молекул, в частности белков и пептидов. В итоге, в масс-анализатор попадает как материнский молекулярный ион пептид, так и ионы его фрагментов. Это позволяет быстро и надежно определять структуру соединения, например, в тандеме с хроматографическим разделением пептидов и белков. Эффективность нового подхода продемонстрирована на примере термической диссоциации белка убиквитина и смеси триптических пептидов белка цитохрома С. Анализ смеси триптических пептидов цитохрома С проводился в режиме ручного попеременного переключения каналов мультиплексированного источника ионов во время жидкостной хроматографии. Триптические пептиды цитохрома С были успешно идентифицированы в режиме высокопроизводительного сбора MS/MS данных (data independent) при термической диссоциация пептидов в эксперименте с хроматографическим разделением. В будущем планируется полностью автоматизировать систему управления клапанами и, соответственно, потоками ионов через оба капилляра, а также контролировать температуру нагрева капилляров, что позволит проводить эксперименты в режиме метод высокопроизводительного сбора MS/MS данных (data independent) полностью без оператора. Результаты исследования представлены в виде публикации в высокорейтинговом журнале (Kostyukevich&Nikolaev, Anal. Chem., 2018, 90, 3576-3583).