Аннотация результатов, полученных в 2017 году
За 2017 г по направлению исследований клеточных механизмов контроля качества было установлено, что подавление аутофагии - важнейшего механизма контроля качества митохондрий - ингибиторами комплекса III (миксотиазола, антимицина, стигмателлина) связано с подавлением синтеза пиримидиновых нуклеотидов в митохондриях. Мы предположили, что ингибиторы комплекса III блокируют синтез фосфолипидов необходимых для аутофагии. В поддержку этого предположения было показано, что интермедиат биосинтеза фосфолипидов цитидин-5'-дифосфохолина (CDPH) предотвращает ингибирование аутофагии под действием миксотиазола. Окончательное подтверждение нашей гипотезы были получены в экспериментах, где фосфолипиды, добавленные в среду инкубации блокировали ингибирующий эффект миксотиазола на аутофагию. В отличие от CDPH, добавление в среду инкубации фосфолипидов не влияет на уровень пиримидинов в клетке, т.е, действие миксотиазола на аутофагию связано с подавлением биосинтеза фосфолипидов. Наряду с описанным эффектом мы предположили, что ингибиторы комплекса III вызывают изменения профиля экспрессии генов участвующих в контроле качества митохондрий. Анализ транскриптома показал, что миксотиазол влияет на экспрессию 32 белков, участвующих в аутофагии. В частности, повышается экспрессия белка LC3, участвующего в формировании фагофора. Парадоксально, мы обнаружили снижение содержания LC3 при длительной (17 ч) инкубации с миксотиазолом. Было показано, что этот эффект не связан с деградацией LC3 после слияния аутофагосом с лизосомами и не предотвращается селективными ингибиторами каспаз и протеасом. Дальнейшие исследования будут направлены на выяснение роли других протеаз и белка р53 в снижении содержания LC3. Предполагается, что в отличие от быстро обратимого эффекта подавления биосинтеза фосфолипидов, деградация LC3 может приводить к необратимому ингибированию аутофагии. Исследование новых митохондриально-направленных прооксидантов показало, что производное нафтохинона, конъюгированного с децилтрифенилфосфонием (SkQN) вызывает мощную генерацию перекиси водорода в изолированных митохондриях сердца крысы. При этом ингибирование комплекса I или NQO1 (ферментов способных восстанавливать нафтохинон) не влияло на SkQN-зависимое образование перекиси водорода. Мы предположили, что остаток нафтохинона в SkQN способен к электрофильной модификации функциональных групп ферментов дыхательной цепи, что приводит к образованию перекиси. Для проверки этой гипотезы был синтезирован аналог SkQN с метилированным хиноидным кольцом нафтохинона (SkQM). В экспериментах на изолированных митохондриях SkQM практически не стимулировал продукцию перекиси, что хорошо согласуется с предполагаемым механизмом прооксидантного действия SkQN. Токсическое действие SkQN и SkQМ было исследовано на нескольких линиях опухолевых клеток и на нормальных подкожных фибробластах человека. Токсическое действие SkQN блокировалось антиоксидантами и снижалось в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования (FCCP) рассеивающего мембранный потенциал на мембране митохондрий. Токсичность SkQN для клеток была существенно выше, чем в случае SkQМ. Таким образом, токсическое действие SkQN было связано с избыточной продукцией АФК в митохондриях. Сравнение токсического действия SkQN на клетки карциномы простаты, клетки рака шейки матки, клетки фибросаркомы и рабдомиосаркомы не выявило заметных различий с токсичностью по отношению к нормальным фибробластам. Для проверки роли раковой трансформации в токсичности SkQN были выбраны нормальные легочные фибробласты человека (линия MRC5) и клетки MRC5, трансформированные онкогенным вирусом SV40. Сравнение этих двух линий не выявило отличий в токсическом действии SkQN. Таким образом, несмотря на высокую токсичность митохондриально-направленного прооксиданта, не получено указаний на перспективность его применения в противоопухолевой терапии. Также в 2017 г были получены предварительные данные о предполагаемом проэстрогеновом действии катионов трифенилфосфония (SkQ1, SkQR1 и C12TPP) на клетках карциномы молочной железы человека MCF-7, экспрессирующих эстрогеновый рецептор альфа (ЭР-альфа). По результатам трех экспериментов наблюдалось небольшое, статистически недостоверное, увеличение пролиферации клеток MCF-7 (МТТ-тест) под действием катионов трифенилфосфония и 17-бета-эстрадиола. Это действие подавлялось фульвестрантом, антагонистом ЭР-альфа. Проведено сравнение действия SkQ1 и 17-бета-эстрадиола на экспрессию эстроген-зависимых генов (greb1, igfbp4, nd6, nd4, tfam,cox6, tff1) в клетках MCF-7. Обнаружено, что: (1) SkQ1 и 17-бета-эстрадиол увеличивают экспрессии генов greb1, igfbp4; (2) только 17-бета--эстрадиол, но не SkQ1 увеличивает экспрессию tff1; (3) только SkQ1 увеличивает экспрессию cox6; (4) на экспрессию остальных генов исследуемые вещества не влияли. По направлению изучения митохондрий на дрожжевых моделях мы показали, что добавление разобщителей может препятствовать клональной экспансии мтДНК, содержащей большую делецию. Мы обнаружили, что этот эффект связан с активацией Atg32-зависимой митофагии. Ранее считалось, что у дрожжей разобщители не способны активировать митофагию, однако, мы показали, что это не так в клетках с гетероплазмией. Еще одним направлением нашей работы было изучение YSP-генов, два из которых (YSP1 и YSP2) были открыты ранее в нашем институте. Ранее нами было показано, что делеция этих генов влияет на структуру митохондриальной сети при стрессе, вызванном амиодароном, а также в стационарной фазе роста. В отчетный период нам удалось обнаружить, что эти гены также необходимы для адаптации клеток дрожжей к стрессорным условиям. Делеция гена YSP2 приводила к увеличенной чувствительности клеток дрожжей к гиперосмотическому стрессу, тепловому шоку и замерзанию. Сверхэкспрессия YSP2, наоборот, делала клетки более устойчивыми к гиперосмотическому стрессу. Результаты этого направления исследования представлены на FEBS конгрессе. В области изучения роли митохондрий на ранних стадиях апоптоза было установлено, что перекисное окисление липидов митохондрий происходит в результате взаимодействия цитохрома с с кардиолипином липосом, изменения его конформации и приобретения им пероксидазной активности. В этой системе добавление мутантного белка с заменами K86A/K87A приводило к практически полному подавлению пероксидазной активности цитохрома с . Вероятно, для связывания с кардиолипином белок должен иметь положительный заряд и замена ключевых лизинов 86 и 87 на нейтральные аланины приводит к подавлению такого взаимодействия. Кроме того, впервые было продемонстрировано взаимодействие между циклическим аденозин 3′,5′- монофосфатом (cAMP), одним из наиболее важных регуляторных молекул в живых организмах, и митохондриально-направленным антиоксидантом SkQ1. Данные, полученные на моделях жидкой мембраны и тромбоцитах человека, показали способность SkQ1 к селективному транспорту cAMP через модельные и природные мембраны, в то время как циклический гуанозин 3′,5′-монофосфат не транспортировался. В частности, SkQ1 вызывал транспорт cAMP через ячейку Прессмана, в то время как cGMP оставался в приемном отделении ячейки. Следует отметить, что в отличие от SkQ1, лишенный хинона додецилтрифосфоний, был неэффективен при транспорте cAMP через мембрану. В случае тромбоцитов, SkQ1 также мог служить в качестве переносчика cAMP, но не cGMP, снаружи клеток в цитоплазму, что регистрировалось по фосфорилированию вазодилятор-стимулируемого белка. Было предположено, что перенос cAMP через мембраны под действием SkQ1 может влиять на сигнальные функции cAMP в клетках. Также была изучена роль окислительного стресса и повреждений в патологических старческих изменениях, в соответствии с митохондриальной теорией старения. По нашим представлениям принципиальное отличие молодого и старого организмов заключается не в самом наличие стресса и возникновении повреждений, а в способности к их репарации. Так нами были подобраны условия для мягкой и короткой (однократная 15 секундная ишемия) ишемической тренировки почечной ткани (прекондиционированию), что делало ее устойчивой к серьезному ишемическому повреждению (40 минутной ишемии). Однако данная тренировка обеспечивала защиту только у молодых животных, но не работала у старых. Этот эффект связан именно с тем, что подобная тренировка активизировала механизмы репарации окислительных повреждений у молодых животных, и к моменту длительной ишемии они были уже активны, что и снижало повреждающее воздействие, тогда как у старых животных эти механизмы не активировались подобной тренировкой. Нами также были исследованы еще несколько подходов к предварительной тренировке органов: удаленное ишемической прекондиционирование (УИП), при котором ишемической тренировке подвергается один орган, а повреждающему воздействию – другой. Например, для защиты мозга от инсульта может применяться тренировка почки и даже конечности (достигаемая просто ее короткими пережатиями, в частности процесс измерения давления с манжетой на руке во многом является прекондиционирующим воздействием). Нами было показано, что УИП конечности приводит к статистически значимому снижению неврологической симптоматики через 24 ч после ишемии. УИП конечности сопровождалось значительным повышением в мозге уровня белков, ассоциированных с индукцией ишемической толерантности, таких как pGSK-3-бета, BDNF и HSP70. Кроме этого мы показали, что такие анестетики, как золетил и хлоралгидрат также обладают прекондиционирующим эффектом. Параллельно нами ведется работа по исследованию сепсис-подобных состояний, для которых известна лидирующая роль окислительного стресса, как главного повреждающего фактора. В частности, мы показали, что сепсис-подобный ответ может возникать не только на бактериальную инфекцию, но и на введение изолированных митохондрий. Данные исследования представляют интерес прежде всего тем, что при получении травм в кровоток может попадать большое количество митохондрий, что может вызывать сепсис-подобный ответ и приводить к гибели организма. Например, вполне вероятно, что смертность при краш-синдроме (токсикозе, вызванном резким попаданием в кровоток продуктов повреждения тканей) определяется именно сепсис-подобной реакцией организма на собственные митохондрии. Наконец, было исследовано влияние митохондриально-направленных антиоксидантов на состояние коллапса у животных, вызванного введением стрептозотоцина в желудочки головного мозга. Результаты эксперимента показали, что SkQT1 и SkQ1 не оказывали достоверного влияния на развитие коллапса, в отличие от ранее показанного эффекта SkQTR1. Видимо, позитивный эффект последнего связан с присутствием родаминовой группы.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 г в рамках проекта "Митохондрии на перепутьи жизни и смерти" было продолжено изучение механизмов регуляции аутофагии под действием ингибитора комплекса III дыхательной цепи миксотиазола. Ранее мы обнаружили, что миксотиазол подавляет инициацию аутофагии, а при длительной инкубации вызывает деградацию основного маркера аутофагосом белка LC3. Установлено, что деградация LC3 определяется катепсинами в составе лизосом и блокируется ингибитором слияния аутофагосом с лизосомами. Различными методами подтверждено накопление поздних аутолизосом после длительной инкубации с миксотиазолом. Ранее мы обнаружили активацию белка р53 под действием миксотиазола. Этот эффект связан с подавлением активности дигидрооротатдегидрогеназы и нарушения биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов. Показано, что активация аутофагии и деградация LC3 под действием миксотиазола зависит от активации белка р53. Анализ транскриптомов показал, что под действием миксотиазола происходит р53-зависимое повышение экспрессии генов, кодирующих белки участвующие в аутофагии. Этот эффект может компенсировать р53-независимое торможение индукции аутофагии под действием миксотиазола. Мы исследовали индукцию селективной аутофагии митохондрий (митофагии) под действием ингибиторов митохондриальных функций. Для этого были получены клеточные линии содержащие на внешней мембране митохондрий два флуоресцентных белка mCherry (красный) и GFP (зеленый). Зеленый флуоресцентный белок теряет флуоресценцию при низком рН и при попадании в аутолизосому сохраняется лишь красная флуоресценция. В этих клетках оказана индукция митофагии под действием протонофорного разобщителя FCCP и катионных соединений SkQ1 и C12TPP. Индукция митофагии в случае катионных соединений коррелирует со снижением мембранного потенциала митохондрий. Миксотиазол и другие ингибиторы дыхания не вызывают значительной митофагии. Мы обнаружили, что антиоксиданты и разобщители окислительного фосфорилирования способны повышать количество клеток линии MCF-7 по результатам резазуринового теста. Данный эффект не обусловлен прямым действием на эстрогеновые рецепторы и эстроген-зависимые элементами промоторов генов. В области исследования митохондрий на дрожжевых моделях мы провели сравнительный анализ стрессов на клетках дрожжей с подавленной экспрессией генов антиоксидантных ферментов. Мы обнаружили, что азольные ксенобиотики не вызывают вторичного окислительного стресса в клетках дрожжей как считалось ранее. В то же время, резистентность клеток к этанолу и пропанолу оказалась зависимой от активности гена митохондриальной супероксиддисмутазы. По направлению изучение роли митохондрий на ранних стадиях апоптоза были проведены эксперименты по влиянию миноциклина на свойства кардиолипина и его способность связывать цитохром с. Считается, что пероксидазная активность цитохрома с, которая является результатом его взаимодействия с кардиолипином, участвует в процессе апоптоза, индуцируя выход белка из митохондрий в цитоплазму. В модельной системе было показано, что пероксидазная активность цитохрома с вызывает пермеабилизацию кардиолипин-содержащих липосом. В настоящей работе изучен эффект антибиотика миноциклина, который имеет также нейропротекторное действие, на подавление пермеабилизации липосом и на подавление связывания белка с кардиолипином. Эти результаты могут служить объяснением ингибированию миноциклином выхода цитохрома с из митохондрий при индукции апоптоза. По направлению изучения роли митохондрий на организменном уровне было оценено влияние компонентов митохондрий, входящих в понятие DAMPs, на острую почечную недостаточность и выживание крыс после ишемии/реперфузии почек. Патологический процесс, развиваемый в почках и во всем организме усугубляет ответ последнего на введение DAMPs (damage associated molecular patters) в конечном счете выражающийся в повышенной смертности животных. Внутрибрюшинное введение митохондрий на фоне ишемии/реперфузии (И/Р) почки резко повышает гибель животных в течение 3 дней после И/Р. В то же время не было выявлено снижения почечной функции по сравнению с И/Р без введения митохондрий. Концентрация креатинина в крови крыс через 48 ч после И/Р почки составляла 435 мкМ, а при И/Р на фоне введения митохондрий 437 мкМ. Само по себе введение митохондрий внтурибрюшинно интактным животным не вызывало никакой смертности, однако несколько повышало концентрацию креатинина в крови (95мкМ простив 50 мкМ у интактных крыс). Митохондриальный антиоксидант оказывал выраженный эффект на гибель животных, повышая выживание животных у группы И/Р + митохондрии + SkQ1 до 60% по сравнению с 25% у группы И/Р+митохондрии и 75% у группы И/Р. Для повышения эффективности доказанного нами нейропротекторного действия митохондриально-направленного антиоксиданта, были предприняты попытки комбинации фармакологического подхода с биоинженерными подходами трансплантации в пораженную черепно-мозговой травмой область мозга искусственной трехмерной структуры, на основе которой будет происходить восстановление архитектоники мозга. В качестве такой структуры был выбран скаффолд из фиброина шелка, который после введения в мозг не только показал высокую биосовместимость, но и приводил к уменьшению очага поражения и неврологического дефицита, вызванного экспериментальной травмой мозга, а также уменьшал клеточную гибель, вызванную in vitro кислородно-глюкозной депривацией, являющейся модель ишемического поражения. Также в 2018 г были оценены нетоксические для культивированных зернистых нейронов мозжечка концентрации веществ С12R19 и тимохинона, входящих в состав митохондриально-адресованного антиоксиданта SkQTR1. Показано, что С12R19 начинает оказывать токсическое действие уже с концентрации 0,25 мкМ, снижая выживаемость до 82±3% за 24 ч. 1 мкМ С12R19 снижал выживаемость нейронов до 50±7%. При стимуляции окислительного стресса перекисью водорода, защитного действия С12R19 не обнаружено. «Вторая часть молекулы» - тимохинон, составляющий антиоксидантную группу молекулы SkQTR1, начинает проявлять токсичность для культивированных нейронов только с концентрации 30 мкМ, снижая их выживаемость до 78±11%. Обнаружено, что токсическое действие тимохинона (50 мкМ, 5 ч) сопровождается повышением продукции свободных радикалов, набуханием митохондрий, изменением ультраструктуры этих органелл, что выражается в снижении их электронной плотности и набухании. Кроме того, наблюдалось снижение электронной плотности цитоплазмы, что может указывать на набухание и отек самих нейронов. Используя модель цинковой токсичности, мы обнаружили, что тимохинон в концентрации 0,25-1 мкМ защищает культивированные нейроны от токсического действия ионов цинка (35 мкМ Zn2+, 24 ч), повышая выживаемость клеток с 45±5% (только действие ионов цинка) до 60±5% (0,25 мкМ тимохинона), 88±5% (0,5 мкМ тимохинона). Показанное нами защитное действие тимохинона при токсическом действии цинка имеет большое значение, так как дисбаланс этого иона в головном мозге вовлечен в целый ряд нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, интервал концентраций между протекторными и токсическими концентрациями тимохинона очень высокий (различие в концентрациях в 60 раз), что позиционирует это вещество как перспективный нейропротектор. Известно, что токсическое действие цинка связано с его негативным действием на митохондрии. Видимо, защитное действие наномолярных концентраций тимохинона направлено на митохондрии, тогда как высокие (десятки микромолей) повреждают эти органеллы, вызывая окислительный стресс.