Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Метаболические изменения у икры и молоди лососевых рыб оценивали по показателям (70-80, в зависимости от задач) липидного и жирнокислотного статуса, активности ключевых ферментов, катализирующих процессы аэробного и анаэробного синтеза АТФ, гликолиза, цикла трикарбоновых кислот, образования глицерофосфата из промежуточных продуктов распада углеводов и пентозо-фосфатного пути окисления углеводов, активности ферментов внутриклеточного протеолиза, активности основного фермента осморегуляции - Na+, K+-АТФазы, молекулярно-генетическим показателям, характеризующим мышечный рост. Результаты обработаны общепринятыми методами вариационной статистики. 1. В ходе полевых работ на нерестово-выростных участках (НВУ) рек Архангельской области были собраны на биохимический анализ пробы разновозрастной молоди атлантического лосося Salmo salar L. и кумжи Salmo trutta L. Проведен сравнительный анализ результатов исследований с данными, полученными в 2014-2016 г.г. для молоди лососевых рыб из рек и притоков Кольского полуострова. Результаты свидетельствуют о наличии общих адаптивных механизмов раннего развития, обеспечивающих генетически предопределенное развитие и реализацию жизненных стратегий у молоди лососевых рыб. Обнаруженные различия между разновозрастной молодью лососевых рыб из разных регионов обусловлены главным образом экологическими условиями (особенно кормовыми) НВУ, которые определяют темп их роста, реореакцию, пищевую активность, время перехода к новому этапу развития, готовность к смолтификации, успешность перезимовки и, в целом, - реализацию жизненной стратегии, а также выживаемость молоди в условиях северных широт. Вариации интенсивности и направления изученных ключевых метаболических реакций обеспечивают поддержание гомеостаза, выбор стратегии эффективного расходования запасных ресурсов, регуляцию синтеза структурных и запасных веществ в соответствии с возрастными потребностями, а также определяют возможности адаптации групп молоди лососей к условиям местообитаний. Показано, что молодь рыб готова к смолтификации только в том случае, если показатели ее биохимического статуса соответствуют уровню, необходимому для адаптации к новой (морской) среде обитания. 2. Дана морфо-ихтиологическая характеристика икры лосося и кумжи, которая была собрана в октябре-ноябре 2017 года (по 3,5 тыс. икринок каждого вида), оплодотворена, заложена на инкубацию на форелевой ферме (ООО «Янисъярви», Республика Карелия). Наблюдение за эмбриональным развитием (в градусо-днях) свидетельствует о нормальном протекании процесса эмбриогенеза. Предварительные результаты сравнения результатов биохимических исследований, полученных для лосося и кумжи на этапе оплодотворения и на ранних стадиях развития (бластулы, гаструлы) икры, развивающейся в условиях форелевой фермы, с результатами, полученными ранее (данные отчета 2014-2016 г.г.) для икры, эмбриональное развитие которой проходило в аквариальных (лабораторных) условиях, свидетельствуют о наличии генетически детерминированных и эволюционно закрепленных биохимических адаптациях хода оплодотворения и раннего развития. Различия в динамике отдельных показателей биохимического метаболизма (особенно липидных) на определенных этапах развития связаны главным образом с температурой. Окончательные заключения о динамике биохимического статуса в эмбриогенезе лососевых рыб будут сделаны по результатам исследования, которое завершится в мае 2018 года. При выполнении работ по проекту были сконструированы и апробированы гнезда–инкубаторы для наблюдений за эмбриональным развитием икры (начиная со стадии глазка) непосредственно в природном водоеме на естественных НВУ. 3. Изучены особенности формирования биохимической разнокачественности молоди лососевых рыб на ранней стадии трансформации личинок в пестряток, до момента их расхождения по различным биотопам. На этой стадии происходит выбор стратегии дальнейшего развития исследуемых рыб. Сразу после выклева, при размерном единообразии, личинки характеризовались большим индивидуальным разбросом биохимических параметров. Индивидуальные различия могут также частично объясняться разновременностью нереста, разнокачественностью икры и глубиной ее закладки, в силу чего расселение личинок пролонгировано во времени и длится 6-8 дней. Полученные в отчетном году результаты исследований подтверждают выявленную нами ранее т.н. "бимодальность" распределения личинок от одной пары производителей в период, пока они не разошлись по микробиотопам. Это косвенно свидетельствует о наличии генетической разнокачественности молоди, которая обуславливает биохимическую, благодаря которой личинки либо остаются в главном русле, где нерестились производители, либо мигрируют в приток с лучшими стартовыми возможностями для последующего роста и развития. Таким образом, индивидуальная биохимическая разнокачественность морфологически сходных сеголеток лосося становится очевидна на личиночной стадии. Последующая реализация генетической программы развития по тому или иному пути при определенном влиянии внешних факторов приводит к бимодальности в распределении индивидуальных признаков (размерных и биохимических), что выражается в дискретном наборе признаков у лососей двух пространственных группировок – ручьевой и пороговой. К возрасту 1+ различия между группировками сглаживаются. В 2018 г. эти исследования будут продолжены на личинках лосося и кумжи сразу после выклева (май-июнь 2018 г.) икры, развитие которой в настоящее время проходит в условиях форелевого хозяйства ООО "Янисъярви",а в марте - и в нерестовых гнездах на реке Улмасен-йоки. 4. На Выгском рыбоводном заводе (Республика Карелия) в бассейнах (№1 - контроль, естественное освещение; №2 - искусственный свет 16 часов, 8 - темнота; №3 – искусственный свет 24 часа) был поставлен эксперимент по влиянию фотопериода на рост и состояние двухлеток (1+) и сеголеток (0+) атлантического лосося. Введение дополнительного освещения бассейнов на выживаемость рыб не повлияло, но увеличило темп роста молоди лосося в осенний период, когда темп роста обычно падает в силу естественных причин (снижения температуры воды). Показано, что двухлеткам потребовался некоторый период приспособления к новым условиям освещения, а мальки (0+) оказались более пластичными, и положительный эффект круглосуточного освещения на прирост их массы обнаружился практически сразу. Искусственные световые режимы изменяли динамику роста молоди (0+) лососей, причем наиболее высокой скоростью роста характеризовалась группа № 3. Можно полагать, что дополнительные 2-3 месяца роста в условиях дополнительного искусственного освещения положительно скажутся на итоговом приросте молоди рыб в конце выростного периода. Предварительные результаты анализа биохимических изменений у молоди лосося, выращиваемой при разных световых режимах, свидетельствуют об их различиях по уровню аэробного обмена, степени использования углеводов в гликолизе, уровню активности кальцийзависимых протеиназ. Эксперимент продолжается, и при получении дополнительных результатов в 2018 году будут сделаны выводы о роли биохимических изменений в этих процессах и предложены практические рекомендации по использованию световых режимов в выращивании молоди лосося. Следует отметить, что помимо получения новых фундаментальных знаний о механизмах развития лососевых рыб, результаты биохимических и ихтиологических исследований по проекту могут иметь и практический выход для рыборазведения, прогноза готовности молоди к смолтификации, а также для природоохранной деятельности в области оценки благополучия популяции лососевых рыб и отдельных ее особей, которых часто рассматривают в качестве важнейших индикаторов оценки состояния пресноводных экосистем и степени их изменения. Дополнительные материалы по проекту размещены на сайте лаборатории экологической биохимии ИБ КарНЦ РАН, отдельной странице проекта - http://biochemistry.krc.karelia.ru/section.php?plang=r&id=1282, созданной для освещения работ по гранту.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проведены исследования раннего развития лосося Salmo salar и кумжи Salmo trutta в регионе Республики Карелия на реках Беломорского бассейна и Северного Приладожья, а также на рыбоводном хозяйстве ООО «Янисъярви» и Выгозерском рыбоводном заводе (Беломорский р-н). Экспериментальные исследования биохимического статуса молоди и эмбрионов лосося и кумжи включали определение около 80 показателей метаболизма: общих липидов ОЛ, запасных-триацилглицеринов ТАГ и эфиров холестерина ЭХС, структурных - фосфолипидов ФЛ и их фракций (ФИ, ФС, ФЭА, ФХ, ЛФХ, СФМ), холестерина ХС, значений индексов ТАГ/ФЛ, ХС/ФЛ, 40 жирных кислот, в том числе мононенасыщенных МНЖК, полиненасыщенных ПНЖК семейств n-3 и n-6, свободных жирных кислот СЖК, а также соотношений ЖК (18:3(n-3)/18:2(n-6), 16:0/18:1(n-9)); активности ферментов углеводного и энергетического обмена - цитохромоксидазы ЦО, лактатдегидрогеназы ЛДГ, альдолазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Г6ФДГ, 1-глицерофосфатдегидрогеназы 1-ГФДГ, а также индикаторов мышечного роста - уровня экспрессии мРНК генов транскрипционных факторов регуляции миогенеза и их паралогов (MyoD1b, MyoD1c, MyoD1a, Myf5, миогенина), тяжелой цепи миозина (MyHC) и паралогов миостатина (MSTN1b, MSTN1a, MSTN2a); активности ферментов внутриклеточного протеолиза (кальцийзависимых протеиназ - кальпаинов и протеасомы), содержание белка. Результаты исследований эмбрионального развития атлантического лосося и кумжи в заводских лотках форелевой фермы ООО «Янисъярви» свидетельствуют о стадиоспецифичности изменений биохимических показателей метаболизма, связанных с интенсивностью потребления кислорода и температурой инкубации эмбрионов. Динамика изменений биохимического статуса у исследованных лососевых рыб свидетельствует о нормально (без отклонений и аномалий) протекающих процессах эмбриогенеза. Для кумжи и лосося характерна сходная динамика изменений биохимического статуса. Обнаруженные количественные различия в уровне биохимических показателей у этих рыб отражают прежде всего особенности вида, обусловленные спецификой местообитаний и дальнейшей стратегией развития молоди. Не обнаружено изменений в динамике биохимических показателей у эмбрионов, развивающихся в инкубационных заводских лотках и в аквариальных условиях (данные проекта 2014-2016 г.г.). Не выявлено существенных различий у сеголеток 0+ кумжи из заводских лотков-инкубаторов и из искусственных гнезд – инкубаторов, помещенных в реку Улмасен-йоки оз. Янисъярви (бас.Ладожского оз.). Некоторые количественные различия показаны только для личинок из гнезд, расположенных в р. Улмасен-йоки и в р.Собачий ручей (бас.Белого моря), что может быть связано как с температурой среды, так и с кормовой базой (в Собачьем ручье сравнительно бедная кормовая база). Следует заключить, что прослеживается биохимическая консервативность эмбриогенеза , ассоциированная с определенным этапом развития исследуемых рыб, слабо зависящая от того, в каких условиях (аквариальных или заводских) идет развитие. Отсутствие дефектов (аномалий) эмбрионального развития лосося и кумжи, заложенной на инкубацию в заводских условиях , обусловлено скорее всего тем, что эффективный нерест рыб в естественных условиях проходил при сравнительно низких температурах (температура воды 12 октября 2017 г. была в диапазоне +8 – +9 ºС). Климатические условия года способствовали выравниванию температурного оптимума нереста лосося и кумжи на значительном пространстве Северо-Запада. Результаты исследований биохимического статуса икры лосося и кумжи в эмбриогенезе, развивавшейся в нормальных условиях при оптимальных температурах и нормоксии могут быть использованы как тестовые при выявлении возможных аномалий эмбрионального развития лососевых рыб, которые могут возникнуть в результате тёплого хода летних температур, нарушающих сроки созревания производителей, что может вызвать кислородное голодание самок и вызывать патологию развития ястыков и икринок. Результаты экспериментов по изучению ряда физиологических показателей молоди рыб (силы тяги, частоты дыхательных движений - ЧДД и частоты сердечных сокращений - ЧСС), имеющих значение для освоения молодью микробиотопов, свидетельствуют о различной стратегии пестряток и смолтов. Сила тяги пестряток выше, чем у смолтов в 5-6 раз. Это означает, что пестрятки выдерживают в 5-6 раз больше скорость потока чем смолты. Физиологическое состояние исследованной реофильной молоди лосося тесно связано с ЧДД: чем выше дыхательный ритм, тем больше интенсивность ЧСС. Совпадающая ритмичность обоих показателей оптимально проявлялась в диапазоне температур активной жизнедеятельности +12– +18°С. Характер двигательной нагрузки пестряток лосося (необходимость удерживаться в быстром потоке, противостоять течению, развивать большую силу тяги, осваивать участки реки с большими скоростями течения) определяет высокий уровень и энергозатратность их двигательной активности, которая обеспечивается за счет ускоренного метаболизма, интенсивность которого зависит от стадии жизненного цикла и стратегии поведения молоди лососевых рыб в потоке. Получены новые результаты биохимических исследований, свидетельствующие о видоспецифичности метаболических процессов у смолтов лосося и кумжи в период смолтификации. Это касается размерно-весовых различий, специфики кормовой базы, а также особенностей в развитии гонад у смолтов исследуемых рыб с разной степенью их готовности к скату в море, что может предопределять продолжительность озерного или морского нагула. Смолты лосося отличаются от кумжи более высоким уровнем общих липидов, в том числе энергетических липидов и отдельных фракций структурных липидов, разной степенью активности системы ферментов элонгации/десатурации, которая играет ключевую роль в конвертации 18:2(n-6) в 20:4(n-6) и 18:3(n-3) в 22:6(n-3) кислоты и может лимитироваться присутствием повышенного уровня диетарных ПНЖК n-6 и n-3 семейств. Также обнаружены различия в соотношениях жирных кислот (индексов 18:3(n-3)/18:2(n-6), 16:0/18:1(n-9)), в том числе физиологически активных. При этом степень конвертации пищевой линоленовой 18:3(n-3) кислоты в докозагексаеновую 22:6(n-3) кислоту выше у смолтов кумжи. Данный аспект связан с массовостью, доступностью и эффективностью усвоения определенных видов пресноводных кормовых объектов, наиболее богатых этими кислотами. У лосося смолтификация тесно связана с достижением особями пороговой величины и массы, достаточные размеры необходимы для успешного перехода молоди из пресной среды в соленую и способности к конкурентной борьбе, внутри- и межвидовой. В связи с этим, у лосося рост-ассоциированные механизмы после запуска программы смолтификации направлены на усиление роста и накопление белка (повышение синтеза структурных белков мышц и снижение их деградации). Иную стратегию смолтификации, выражающуюся в повышении уровня кальпаин-зависимого протеолиза мышечных белков при переходе от стадии пестрятки к смолту, демонстрирует кумжа. Ее существенно отличает от лосося отсутствие порогового размера для вступления в смолтификацию, а сигналом к физиологической перестройке служит внешний фактор – обедненная кормовая база нерестово-выростных участков. Трансформация в смолта может быть обратимой и отложенной во времени, если на пути миграции в море (который для кумжи гораздо продолжительнее, чем для лосося) кумжа встретит кормные участки, или даже полностью прекращена для конкретной особи, перешедшей к резидентному обитанию в пресном водоеме достаточной кормности. Растянутость смолтификации во времени, обитание в переходных по значениям солености биотопах, предваряющих переход к полносоленой морской среде, позволяют предположить наличие у кумжи системы частных и селективных соленостных физиолого-биохимических адаптаций, связанных, в том числе, с использованием продуктов гидролиза белка для поддержания осмотического давления в клетках. Разновозрастная и субпопуляционная структура вида лососевых рыб северных водотоков во многом определяется силой взаимодействиями в системе «генетически детерминированная программа развития – экологические условия НВУ и местообитания». Впервые получены результаты биохимических исследований липидного, углеводного, энергетического статуса атлантического лосося в процессах роста и развития в условиях искусственного выращивания при изменении фотопериода. Были сформированы три группы лосося (сеголетки 0+ и двухлетки 1+), выращиваемые в садках с проточной речной водой: 1) в условиях освещения завода 2) при искусственном освещении продолжительностью 16 ч/сут и 8 ч/сут. полной темноты (LD,16:8), 3) при искусственном освещении в течение 24 ч/сут. (LL,24:0). Анализ кривой роста лососей 0+ показал заметное преимущество в скорости роста молоди, выращиваемой при постоянном свете (LL) относительно других групп, в течение всего периода наблюдений (с июля по октябрь), тогда как в возрасте 1+ первый месяц (июль-август) воздействия разных световых режимов отрицательно сказывался на приросте (по массе) лосося экспериментальных групп 16:8 и 24:0, что связано, вероятно, с акклимацией к искусственному режиму освещения. Впоследствии темп роста лососей 1+ в группах 16:8 и 24:0, напротив, был более высоким, так что за последующие два месяца они сравнялись в размерах с контрольной группой. Темп роста лососей всех групп отражал естественные сезонные изменения регионального климата, которые включают не только длину светового дня, но и вариации температуры воды. Искусственные световые режимы изменяли динамику роста лососей по разным механизмам. При режиме 24:0 у двухлеток (1+) лосося установлены наибольшие изменения липидного профиля, свидетельствующие о значительной степени их готовности к смолтификации и миграции в морскую среду (повышение 22:6(n-3) и 20:4(n-6) ЖК, которые типичны для морских рыб; рост коэффициента 16:0/18:1(n-9), характеризующего интенсивность обмена, снижение запасных ТАГ и ЭХС, а также МНЖК (18:1(n-9), 16:1(n-7), 20:1(n-9), 22:1(n-11)), которые активно используются на процессы смолтификации. Отмеченные изменения содержания отдельных липидных классов, особенно при непрерывном освещении (24:0), могут указывать на более активные метаболические процессы у рыб в этих условиях. Подобные изменения показателей липидного обмена были установлены ранее у смолтов 3+ лосося при изучении липидного и ЖК профиля молоди лосося из рек Кольского п-ва. Сравнительно высокие значения активности ЦО и ЛДГ в мышцах у сеголеток 0+, выращиваемых при режиме освещения 24:0 свидетельствуют о том, что уровень аэробного и анаэробного обмена выше в этих условиях и он коррелирует с более высоким приростом массы сеголеток. Показаны различия в механизмах регуляции мышечного роста у рыб в зависимости от режима освещения. Уровень экспрессии мРНК генов миогенина и миозина и транскрипционных факторов регуляции миогенеза в осенний период мышцах сеголеток 0+ был выше у рыб из бассейнов с дополнительным освещением (16:8 и 24:0). Дополнительное освещение оказывает положительный эффект на прирост мышечной массы у сеголеток лосося и способствует более продолжительному росту даже в осенний период при снижении температуры воды. Сезонное повышение в уровне экспрессии мРНК MyHC было согласовано с увеличением экспрессии мРНК MyoG у особей в группах с дополнительным освещением, и мРНК гена myf5 в контрольном бассейне. Для обеих групп повышение уровня экспрессии генов миозина и факторов миогенеза в октябре сопровождался высоким уровнем экспрессии мРНК миостатина – (MSTN1b), что, вероятно, является необходимым механизмом регуляции, чтобы ослабить процессы гиперплазии и гипертрофии и тем самым предотвратить бесконтрольный рост мышц. Для двухлеток (1+) различия между особями из разных бассейнов были не столь сильно выражены. В адаптационный период после введения дополнительного освещения у особей из бассейна с режимом 16:8 наряду со снижением массы снижался уровень экспрессии гена MyoG. Помимо влияния на уровень синтеза структурных белков скелетных мышц, интенсивность роста сказывалась на уровне белкового обмена, в частности, в изменении активности внутриклеточных протеиназ, отвечающих как за контроль качества синтезируемых белков, так и за процессы формирования скелетно-мышечных элементов. Можно полагать, что продолжительное (вплоть до постоянного) воздействие света будет стимулировать рост у искусственно выращиваемого лосося за счет прямой стимуляции гипоталамо-гипофизарной системы с последующим повышением продукции гормона роста и инсулин-подобного ростового фактора, а также стимуляции пищевого поведения. Учитывая, что при искусственных режимах освещения вне периода акклимации темп роста лососей был выше, чем при естественном освещении (при прочих равных условиях), можно рекомендовать его более длительное применение, сразу после окончания подледного периода (с апреля) вместе с началом кормления рыб. Предположительно, дополнительные 2-3 месяца роста в условиях искусственного освещения положительно скажутся на итоговом приросте рыб в конце выростного периода. Результаты работы подтвердили возможность использования показателей биохимического статуса молоди в качестве индикаторов степени готовности молоди лосося к смолтификации в сроки сопоставимые с природными популяциями. Непрерывный режим освещения 24:0 оказался лучшим для готовности мальков к смолтификации, что достоверно повышает адаптивные возможности выпускаемой молоди. Полученные результаты дополняют фундаментальные представления о регуляции роста организмов при действии абиотических факторов и могут быть использованы в дальнейших НИР при разработке методологии усовершенствования повышения продуктивности искусственного выращивания молоди лосося в условиях северо-запада. В результате, к моменту выпуска рыб в реки можно будет получить более крупных особей, выживаемость и жизнеспособность которых в естественной среде будет выше.