Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Для изучения гибкости и наличия изгибов в коротких участках двухцепочечной ДНК разработаны экспериментальные протоколы и создан набор биотинилированных флуоресцентно-меченых ДНК-конструкций, отличающиеся по длине и нуклеотидной последовательности. Эти конструкции обеспечивают изучение методом spFRET микроскопии гибкости молекул ДНК по их способности к петлеобразованию (циркуляризации). Методами компьютерного моделирования созданы молекулярные модели кольцевых коротких ДНК различной длины и последовательности, выполнен расчет энергий циклизации, разработаны алгоритмы оценки вероятности спонтанной циклизации короткой ДНК. Разработана программа анализа времен регистрации отдельных фотонов для расчета эффективности spFRET, которая обеспечивает изучение суб-милисекундной структурной динамики исследуемых объектов во время их диффузии через фокус лазерного луча под микроскопом (5-8 мс). Новый способ анализа данных spFRET микроскопии в сочетании с методами молекулярного моделирования может быть применен для изучения структурной динамики нуклеосом и их комплексов с белковыми факторами. Методом spFRET микроскопии получено экспериментальное подтверждение разных типов связывания глобул линкерных гистонов Н1 (off-dyad) и Н5 (on-dyad) с нуклеосомами в идентичных условиях в растворе. Разработаны модели комплексов нуклеосом с глобулярными доменами линкерных гистонов Н1 и Н5 и предсказана конформация линкерных участков ДНК в этих комплексах с учетом данных spFRET микроскопии. Методами биоинформатики предсказан тип связывания с нуклеосомой (on-dyad или off-dyad) для ряда известных вариантов линкерного гистона. Методом моделирования по гомологии построена модель комплекса нуклеосомы с вариантом гистона H1.0 человека. Методом компьютерного моделирования был произведен выбор наиболее информативных положений метки Cy5 (на гистоне H2A в комбинации с меткой Cy3 на нуклеосомной ДНК в положениях +13 п.н. и +57 п.н.), с помощью которых можно будет различить различные гипотетические модели механизма разворачивания нуклеосомы белковым комплексом FACT. Начаты работы по созданию экспериментальных мононуклеосом с флуоресцентными метками в выбранных положениях. Методом spFRET микроскопии было показано, что для полного АТФ-независимого раскручивания нуклеосомной ДНК комплексом FACT необходим пятикратный молярный избыток субъединицы Nhp6 над субъединицами Spt16/Pob3. Необходимость избытка Nhp6 свидетельствует о том, что связывание нескольких молекул Nhp6 с одной нуклеосомой является ключевым фактором, необходимым для раскручивания нуклеосомы комплексом FACT. В свою очередь, формирование комплекса FACT из субъединиц Spt16/Pob3 и Nhp6 может происходить либо непосредственно на нуклеосоме, предварительно связавшей Nhp6, либо в растворе до связывания с нуклеосомой. Методами футпринтинга ДНК определена структура элонгационного комплекса ЭК(+24), формирующегося в положении +24 п.н. от входа в нуклеосому при наличии разрыва нематричной цепи ДНК в положении +12 нт. С учетом данных футпринтинга и криоэлектронной микроскопии с помощью вычислительных методов построены атомистические модели структур ЭК(+24) с разрывом и без него. Определены основные структурные отличия интермедиатов транскрипции интактного и поврежденного хроматина. С использованием мононуклеосомной экспериментальной системы воспроизведен регуляторный нуклеосомный барьер, наблюдаемый in vivo для +1 нуклеосомы гена. Полученные данные позволяют заключить, что основу регуляторного барьера в +1 нуклеосоме формируют ДНК-гистоновые взаимодействия, не требующие участия дополнительных белковых факторов. В экспериментах по выяснению роли субъединиц дрожжевого yFACT в облегчении транскрипции нуклеосом РНК-полимеразой 2 (РНКП2) установлено, что субъединица Nhp6 преимущественно влияет на остановку РНКП2 в положении +(11÷15) п.н., а комплекс Spt16-Pob3 - на остановку в положении +(45÷48) п.н., снижая барьер для транскрипции в соответствующем положении. Показано, что во взаимодействии yFACT с нуклеосомами во время транскрипции существенное значение имеют С-концевые участки субъединиц Spt16 и Pob3, а также М-домен субъединицы Spt16. Получены данные, которые позволяют предположить одновременное взаимодействие С-концов субъединиц Spt16 и Pob3 с двумя разными мишенями (скорее всего, с обоими димерами Н2А/Н2В) в нуклеосоме. Показано, что взаимодействие N-концевого участка гистона Н2В с yFACT является важной частью механизма активации транскрипции хроматина РНКП2. Методом spFRET микроскопии установлено, что ни производное кураксина CBL0137, ни человеческий hFACT по отдельности не вызывают значительных структурных изменений нуклеосомной ДНК. В то же время, совместно CBL0137 и hFACT вызывают значительное раскручивание витков нуклеосомной ДНК, которое обратимо для большей части нуклеосом, подвергшихся структурной перестройке. Такая структурная перестройка может происходить при кураксин-зависимом связывании hFACT с гетерохроматином, показанном ранее в экспериментах in vivo. Детально охарактеризован механизм остановки РНК-полимеразы на внутринуклеосомных петлях ДНК и определено влияние белковых факторов GreB, FACT и последовательности нуклеотидов на эффективность остановки. Методом просвечивающей электронной микроскопии с негативным окрашиванием образцов исследованы структуры элонгационных комплексов, остановленных в положении +39 п.н. от входа в нуклеосому (ЭК(+39)), и комплексов нуклеосом с дрожжевым FACT. После концентрирования ЭК(+39) на аффинном монослое липидов, переноса комплексов на подложку-сетку и негативного окрашивания, было собрано более 5000 отдельных проекционных изображений ЭК(+39). Структура ЭК(+39), полученная в результате предварительной реконструкции, является двух-доменной, а объемные размеры доменов сравнимы с размерами РНК-полимеразы и нуклеосомы, известными по данным рентгеноструктурного анализа. Полученная структура позволяет предположить формирование предсказанной ранее внутринуклеосомной петли ДНК малого размера. Комплекс FACT-нуклеосома был очищен с помощью нативного полиакриламидного геля. Получены несколько вариантов структур комплекса FACT-нуклеосома, которые предположительно соответствуют различным стадиям взаимодействия FACT с нуклеосомой. Полученные структуры позволяют предположить, что в комплексе FACT-нуклеосома структура нуклеосом значительно изменена.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Используя spFRET микроскопию и методы интегративного моделирования, проведены исследования по изучению гибкости ДНК, фактора, который играет важную роль в процессах коммуникации в хроматине. Методом spFRET-микроскопии получены экспериментальные данные, свидетельствующие о существовании новой изогнутой конформации фрагмента центромерной ДНК дрожжей в растворе. Данная конформация может играть ключевую роль для выполнения центромерной ДНК ее биологической функции – взаимодействия с белками кинетохора и распределения хромосом по дочерним клеткам после деления. Установлено, что в зависимости от нуклеотидной последовательности гибкость двуцепочечных олигонуклеотидов длиной около 100 п.н. меняется не менее чем в 2,3 раза, введение одноцепочечного разрыва увеличивает гибкость и жестких, и гибких олигонуклеотидов в ~2,5 раза, а взаимодействие с цисплатином увеличивает их гибкость - в 5 раз. Проведены экспериментальные и теоретические исследования влияния изменения последовательности ДНК и гистонов на структуру и динамику нуклеосом. Показано, что наличие линкерного участка ДНК только с одной стороны нуклеосомы приводит к дестабилизации ее структуры по сравнению со структурой нуклеосом с двумя линкерами или без них. Показано, что динамическое отворачивание до 35 п.н. ДНК от октамера гистонов в присутствии различных концентраций ионов может происходить обратимо без потери гистонов и сопровождаться образованием двух новых конформационных состояний нуклеосом. Установлено, что в составе комплекса нуклеосом с гистоном H1.0 из X. laevis линкерные фрагменты ДНК принимают единственную конформацию, а структурирующий эффект гистона Н1.0 распространяется вдоль линкерной ДНК на расстояние не менее 25 п.н. от кор-нуклеосомы. Показано, что удаление N-концевого хвоста гистона Н2В вызывает дестабилизацию структуры линкерной ДНК нуклеосомы. Это указывает на важную роль взаимодействий «хвостов» коровых гистонов с линкерными фрагментами ДНК, приводящих к сближению ДНК-линкеров, необходимому для правильной упаковки нуклеосом в фибриллы. Методами интегративного моделирования на основании данных spFRET микроскопии построена модель, описывающая конформацию линкерных участков нуклеосомной ДНК в присутствии и отсутствии двух вариантов линкерного гистона H1.5 человека. Охарактеризовано влияние различных доменов гистона H1.5 на конформацию линкерной ДНК. Рассчитаны различия в энергии деформации ДНК для моделей комплексов нуклеосомы с гистоном H1, связанного на диадной оси и со смещением от нее. Проведен перебор всех возможных последовательностей участков линкерной ДНК, взаимодействующих с гистоном H1, на предмет энергетической выгодности ее деформации. Определены последовательности ДНК способствующие альтернативным способам связывания гистона H1 (на диадной оси и со смещением от нее). Экспериментально подтверждена гипотеза о том, что разворачивание нуклеосомы дрожжевым фактором yFACT сопровождается дестабилизацией взаимодействия ДНК с димерами гистонов H2A-H2B и удержанием последних в составе комплекса фактором yFACT или тетрамером H3/H4. Определены функциональные домены субъединиц Spt16-Pob3 и нуклеосом, участвующие во взаимодействии между этими супрамолекулярными комплексами; в частности, показано, что yFACT с отрезанными у белков Spt16 и Pob3 С-концами не способен разворачивать нуклеосомы, и что мутация M62E в гистоне H2B в составе октамера гистонов нарушает связывание комплекса FACT с нуклеосомой. На основании полученных данных построена уточненная модель комплекса yFACT с развёрнутой нуклеосомой. Методом футпринтинга ДНК определены структуры двух ключевых комплексов, формирующихся при транскрипции нуклеосом РНК полимеразой, в том числе ключевого комплекса, отвечающего за сохранение нуклеосом при транскрипции (ЭК(+39)), а также комплекса, контролирующего высоту регулярного нуклеосомного барьера (ЭК(-9)). Определены роли различных доменов фактора FACT человека (hFACT) в транскрипции хроматина и реорганизации нуклеосом. Установлен механизм ингибирования FACT-зависимой транскрипции хроматина противоопухолевыми препаратами кураксинами in vivo и in vitro: кураксины вызывают перераспределение фактора hFACT с транскрибируемых генов на другие участки генома, и таким образом ингибируют транскрипцию. Показано, что реорганизация нуклеосомы, вызванная hFACT в присутствии кураксинов является симметричной и происходит по принципу «все-или-ничего», т.е. имеет ту же природу, что и реорганизация, опосредованная дрожжевым yFACT. Получены новые данные о механизме остановки РНК-полимеразы на внутринуклеосомных петлях ДНК. Предложена модель механизма влияния белкового фактора FACT и последовательности нуклеотидов на эффективность остановки фермента. Разработан оригинальный метод двустадийной очистки и концентрирования элонгационного комплекса РНК полимеразы с нуклеосомой на гепариновой смоле и аффинных сетках с иммобилизованным монослоем липидов для изучения с помощью электронной микроскопии. На основе данных криоэлектронной микроскопии и молекулярного моделирования рассчитана трехмерная модель элонгационного комплекса ЭК(+39), которая показала наличие в составе ЭК(+39) Ø-петли (петли нулевого размера), образованной нуклеосомной ДНК, и позволила прояснить структурные особенности данного комплекса. С помощью просвечивающей электронной микроскопии и анализа на основе преобразований Фурье визуализирована структура двумерных кристаллов ДНК-связывающего гистоноподобного белка Dps с ДНК и установлено, что ориентация Dps в кристаллах зависит от длины взаимодействующей ДНК.