Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Разработка новых соединений, методов и подходов для высокочувствительной диагностики и адресной терапии опухолевых заболеваний на сегодняшний день являются наиболее актуальными и активно развивающимися направлениями в биологии и медицине. Настоящий проект является продолжением успешно завершенного в 2016 году проекта с тем же названием и представляет собой многопрофильное исследование на стыке молекулярной иммунологии, биохимии, белковой химии и физико-химии наноструктур по созданию нового поколения соединений для высокоточной диагностики и эффективной терапии рака. Основной идеей тераностики, новой стратегии в медицине, основанной на объединении этих двух направлений, является создание мультифункциональных соединений направленного действия, позволяющих одновременно визуализировать очаг болезни, оказывать селективное терапевтическое воздействие на него, следить за кинетикой доставки лекарства к патологическому очагу и в процессе мониторинга лечения регулировать схему терапии. Целью настоящего проекта является разработка комплексного подхода к биоинженерии новых противоопухолевых соединений для тераностики, основу которых составляют адресные мультифункциональные рекомбинантные белки с различными механизмами действия, а также наночастицы, позволяющие применить разного рода физическое воздействие на опухолевую клетку (облучение, магнитное поле, нагрев). Такой комплексный подход в полной мере отвечает современным представлениям о необходимости множественного воздействия на опухоли с учетом молекулярного профиля заболевания и индивидуальных особенностей каждого онкологического пациента. Создаваемые гибридные мультифункциональные конструкции представляют собой пример интегральных соединений с качественно новыми свойствами, когда «целое больше, чем сумма составляющих его частей». В ходе выполнения проекта в 2017 г. коллективом были получены следующие результаты: Впервые для адресной фототермической терапии HER2-положительных опухолей получены гибридные мультифункциональные наноконструкции DARPin-GNP на основе золотых наночастиц диаметром 5 нм (GNP) и адресного модуля неиммуноглобулиновой природы DARPin, специфичного к распространенному опухолевому маркеру HER2. Установлено, что при облучении красным светом гибридные мультифункциональные наноконструкции DARPin-GNP обладают фотоиндуцированной цитотоксичностью в отношении HER2-положительных раковых клеток, снижая жизнеспособность опухолевых клеток вдвое в концентрации 240 нМ. На основании полученных экспериментальных данных предложен механизм цитотоксического действия DARPin-GNP. Благодаря высокой стабильности в физиологических условиях, селективному связыванию с HER2-положительными раковыми клетками и интернализации посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, полученные гибридные золотые наночастицы DARPin-GNPs являются перспективными агентами для фототермической терапии рака. Для фотодинамической терапии рака на глубине тканей были получены две гибридных наноконструкции на основе антистоксовых нанофосфóров (НАФ) и функционально активных белков. В этих гибридных конструкциях НАФ были использованы в качестве внутренних источников света, способных конвертировать внешнее излучение в ближнем ИК-диапазоне, проникающем вглубь биоткани, в УФ и видимый свет, необходимый для активации эндогенных фотосенсибилизаторов или фототоксичного белка в зависимости от состава гибридной конструкции. Так было показано цитотоксическое действие полученных адресных гибридных антистоксовых нанофосфóров НАФ/DARPin-mCherry на опухолевые клетки аденокарциномы молочной железы человека SKBR-3 при облучении ближним инфракрасным светом с длиной волны 975 нм в дозе 900 Дж/кв. см за счет индуцируемого ультрафиолетового возбуждения эндогенных фотосенсибилизаторов и генерации активных форм кислорода [Mironova et al., Nanoscale, 2017]. Показано, что гибридные нанофосфóры KillerRed-НАФ интернализуются при взаимодействии с клетками MDA-MB-231 рака молочной железы человека и проявляют цитотоксичность при облучении ближним ИК-светом (980 нм) за счет локальной активации посредством FRET фотосенсибилизатора KillerRed с последующим образованием активных форм кислорода, убивающих клетки [Liang et al., Acta Biomaterialia, 2017]. Для создания магнитных маркеров клеточных антигенов разработан простой двухстадийный метод синтеза, позволяющий получать покрытые кремнием магнитные и магнитно-флуоресцентные наночастицы с карбоксигруппами на поверхности сразу после завершения реакции Штобера за счет предварительной стабилизации магнитных наночастиц карбоксиполимером. Синтезированы и охарактеризованы физическими методами магнитные и маг¬нитно-флуоресцентные частицы с заданным набором функ¬циональных свойств (магнетизм, флуоресценция, контролиру¬емые поверхностные свойства). Для экспериментов на клетках и в живом организме отобраны агрегационно и седиментационно устойчивые наночастицы, с магнитными характеристиками, оптимизированными для детекции с применением оригинальной технологии MPQ, разработанной на предыдущем этапе проекта, с низким пределом детекции этим методом до 2.7 нг в 20 мкл раствора [Zelepukin I.V. et al., Acta Naturae, 2017]. В 2017 году было продолжено исследование адресных токсинов, полученных ранее в рамках данного проекта на основе миниантител и полипептида DARPin, специфичных к разным эпитопам опухолевого маркера HER2, и токсичных белков с разным механизмом действия (различные варианты фрагмента РЕ40 псевдомонадного токсина А; белковый фотосенсибилизатор miniSOG). Был прояснен механизм действия адресного токсина 4D5scFv-PE40 на HER2-положительные опухолевые клетки [Sokolova E.A. et al., Oncotarget, 2017]; проведен углубленный анализ влияния адресного токсина DARPin-PE40 на динамику роста ксенографтных опухолей у мышей [Соколова Е.А. и др., Acta naturae, 2017]; получен и охарактеризован новый гибридный HER2­специфичный адресный токсин DARPin-LoPE, представляющий значительный интерес для дальнейшего изучения in vivo в качестве тераностического агента для терапии HER2­положительных опухолей, благодаря очень высокой селективной цитотоксичности в отношении HER2­положительных опухолевых клеток человека, а также ожидаемой низкой иммуногенности [Прошкина и др., Молекулярная биология, 2017]; показано, что цитотоксичность адресных токсинов 4D5scFv–miniSOG и DARPin–miniSOG, специфичных к разным эпитопам опухолевого маркера HER2, определяется скоростью их интернализации в опухолевые клетки, то есть зависит от времени нахождения фототоксина в липидном бислое клеточной мембраны, где его повреждающее действие оказывается максимальным [Шилова О.Н. и др., ДАН, 2017]. Проведена оценка значимости p21-активируемых киназ I группы (PAK1/2/3) в качестве потенциальных мишеней для терапии злокачественных опухолей оболочек периферических нервов. Показано увеличение уровня фосфорилирования этих белков в тканях злокачественных опухолей по сравнению с уровнем фосфорилирования этих белков в тканях доброкачественных опухолей (нейрофибром) и в тканях нормальных периферических нервов человека. Показано, что воздействие специфических ингибиторов на эти мишени, а также их генетический нокдаун снижает пролиферативную и инвазивную способность клеток злокачественных опухолей оболочек периферических нервов [Semenova G. et al., Oncogene, 2017; Semenova G. et al., Biochimie, 2017]. Задачи проекта на 2017 год полностью выполнены. Результаты работ по созданию бифункциональных гибридных наноструктур на основе адресных полипептидов и наночастиц различной природы (нанозолото, апконвертирующие нанофосфóры, магнитные наночастицы) в качестве модулей, обеспечивающих визуализацию и различное повреждающее воздействие на раковые клетки, полученные авторами в рамках настоящего проекта РНФ, суммированы в обзоре [Деев С.М., Лебеденко Е.Н., Молекулярная биология, 2017] и представлены на сайте ИБХ РАН http://www.ibch.ru/structure/groups/molimmunol (закладка "Достижения").

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Настоящий проект является продолжением успешно завершенного в 2016 году проекта с тем же названием и представляет собой многопрофильное исследование на стыке молекулярной иммунологии, биохимии, белковой химии и физико-химии наноструктур по созданию нового поколения соединений для высокоточной диагностики и эффективной терапии рака. Основу создаваемых противоопухолевых соединений составляют адресные мультифункциональные рекомбинантные белки с различными механизмами действия, а также наночастицы, позволяющие применить разного рода физическое воздействие на опухолевую клетку (облучение, магнитное поле, нагрев). В 2018 году была продолжена работа по созданию гибридных адресных наноструктур для тераностики рака, а также исследование механизмов действия и цитотоксического (in vitro) и терапевтического (in vivo) эффекта создаваемых бифункциональных адресных токсинов. Особое внимание при продолжении проекта в 2018 году уделено оптимизации физиологических характеристик создаваемых конструкций с целью увеличения времени их циркуляции в кровяном русле, минимизации нежелательного накопления в почках, печени и других органах, а также разработке новых методов неинвазивного мониторинга циркуляции, накопления (выведения) наноагентов в организме животного. Такой комплексный подход в полной мере отвечает современным представлениям о необходимости интегрального воздействия на опухоли с учетом их молекулярного профиля и индивидуальных особенностей каждого онкологического пациента. В ходе выполнения проекта в 2018 г. коллективом были получены следующие основные результаты: Разработан метод получения малых (80-90 нм в диаметре) моноламеллярных протеолипосом, содержащих большие количества (до 2 тысяч молекул белка на липосому) токсина PE40. Разработана методика функционализации поверхности протеолипосом адресным модулем DARPin. В опытах in vitro показано, что дарпинизированные протеолипосомы, нагруженные PE40, обладают высокой и селективной токсичностью по отношению к HER2-положительным раковым клеткам человека и индуцируют их апоптоз [Deyev et al., Eur. J. Pharm. Biopharm., 2018; Kiseleva et al., Tumor Biology journal, 2018]. Разработана методика синтеза золотых наностержней, позволяющая получать частицы с заданным максимумом поглощения, и показано, что конъюгация наностержней с адресным модулем DARPin не влияет на спектральные характеристики частицы. Изучена фототермическая цитотоксичность конъюгатов наностержней GNRs с адресным модулем DARPin в фотодинамической терапии in vitro в отношении HER2-положительных клеток человека. Установлено, что наиболее перспективным агентом для опытов in vivo являются адресные наностержни GNR-DARPin с максимумом поглощения при 805 нм. Для экспериментов по фармако-кинетике и биораспределению наночастиц синтезированы наночастицы магнетита с различным вариантами покрытия (декстран, карбоксиметилдекстран, их смесь в соотношении 1:1, низкомолекулярный цитрат-анион, полимер молочно-гликолевых кислот, глюкуроновая кислота). Деградация синтезированных частиц, время их циркуляции в кровотоке и биораспределение изучены in vivo на мышах. Установлено, что время циркуляции наночастиц магнетита в кровотоке уменьшается в ряду наночастиц со следующими полимерными покрытями: глюкуроновая кислота > карбоксиметилдекстран > полистеринсульфонат > полиэтиленгликоль-фосфат; полиакриловая кислота. Показано преимущественное поглощение наночастиц магнетита печенью и селезенкой, вне зависимости от покрытия и свойств этих наночастиц, а также меньшее поглощение частиц в тканях легких при увеличении по модулю ζ-потенциала поверхности. Применение физических неинвазивных методов исследования для детекции наночастиц (MPQ-детекция, магнитно-резонансная томография) позволило использовать в экспериментах минимальное число животных без вовлечения технических погрешностей, связанных с забором крови, препарированием животного и пр. [Зелепукин и др. XXX Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва 12-15 февраля 2018 г. Доклад.] Изучено влияние вводимой дозы наночастиц магнетита на время их выведения из кровотока; обнаружено замедление поглощения частиц макрофагами при дозах свыше 600 мкг на мышь весом 20-22 г. Изучено влияние размера, поверхностного заряда и состава покрытия наночастиц магнетита на время их циркуляции в кровотоке. Показано увеличение времени циркуляции наночастиц магнетита в кровотоке при уменьшении их размера, а также более продолжительное время циркуляции отрицательно заряженных наночастиц по сравнению с положительно заряженными. Установлено, что время циркуляции наночастиц магнетита в кровотоке уменьшается в ряду наночастиц со следующими полимерными покрытями: глюкуроновая кислота > карбоксиметилдекстран > полистеринсульфонат > полиэтиленгликоль-фосфат; полиакриловая кислота [Зелепукин и др. XXX Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва 12-15 февраля 2018 г. Доклад]. Для продления времени циркуляции малых доз терапевтических наночастиц предложен метод неспецифичной блокировки макрофагов высокими дозами низкотоксичных частиц магнетита. Показано увеличение времени циркуляции второй малой дозы (300 мкг) коммерческих наночастиц магнетита при блокировке макрофагов высокими дозами (от 1,25 мг до 10 мг) тех же наночастиц. Показано, что эффективность блокировки растет с увеличением дозы блокирующих наночастиц; максимально удалось увеличить время циркуляции наночастиц магнетита в 8,5 раз. Для разработки методов генной терапии изучены полученные на предыдущем этапе генно-инженерные конструкции, напрвляющие экспрессию адресных белковых токсинов в клетках млекопитающих под контролем опухолеспецифичных промоторов. На панели опухолевых клеток млекопитающих с различным уровнем онкомаркера HER2 определена цитотоксичность конструкций, кодирующих адресный анти-HER2-токсин DARPin9.29-РЕ40 под контролем опухолеспецифичных промоторов сурвивина (плазмида pCAG-ЕТА) и теломеразы (плазмида pTERT-ЕТА). Показано, что в отличие от неселективной и крайне высокой цитотоксичности плазмиды pCAG-ЕТА цитотоксичность плазмиды pTERT-ЕТА зависит от условий трансфекции и уровня активности TERT-промотора в конкретной линии опухолевых клеток. Выживаемость клеток с низким уровнем активности TERT-промотора (линия НЕК293) вдвое выше выживаемости клеток с высоким уровнем активности TERT-промотора (линия 3Т3). Показано, что опухолевые клетки, трансфицированные как плазмидой pCAG-ЕТА, так и pTERT-ЕТА, не проявляют какого-либо обнаруживаемого «эффекта свидетеля» (bystander effect) in vitro. Исследование опухолесупрессивной активности плазмиды pCAG-ETA на модели карциномы молочной железы у мышей (клетки D2F2/E2) in vivo показало, что трехкратные внутриопухолевые инъекции комплекса сконструированной плазмиды (pTERT-ETA или pCAG-ETA) с полиэтиленимином привели к значительному замедлению роста опухоли (в ~2 раза при 6-недельном сроке наблюдения), тогда как однократной инъекции комплекса плазмиды с полиэтиленимином не достаточно для оказания терапевтического действия. В 2018 году было также продолжено исследование адресных токсинов, полученных ранее в рамках данного проекта на основе полипептидов, специфичных к разным эпитопам опухолевого маркера HER2 (миниантитела и инновационные полипептиды DARPins), и токсичных белков с разным механизмом действия (различные варианты фрагмента РЕ40 псевдомонадного токсина А; белковый фотосенсибилизатор miniSOG). Сравнительное исследование общей токсичности DARPin-LoPE и его исходного варианта DARPin-PE40 на здоровых иммунокомпетентных мышах показало значительно меньшую общую токсичность и низкую иммуногенность адресного токсина DARPin-LoPE по сравнению с DARPin-PE40 [Шилова и др., доклад на XXX Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2018]. Благодаря очень высокой селективной цитотоксичности в отношении HER2­положительных опухолевых клеток человека, а также низкой общей токсичности и иммуногенности, адресный токсин нового состава DARPin-LoPE представляет значительный интерес для дальнейшего изучения in vivo в качестве тераностического агента для терапии HER2­положительных опухолей. Выяснен механизм угасания флуоресценции адресных фототоксинов 4D5scFv-miniSOG и DARPin-miniSOG при связывании с HER2-положительными клетками и последующей интернализации, показано, что значимый вклад в изменение флуоресцентных свойств вносит не деградация белка, а экранирование и поглощение флуоресценции miniSOG флуорофорами клетки, в том числе, цитохромом с [Кузичкина и др., ДАН, 2018; Кузичкина и др., Acta naturae, 2018]. Важным моментом таргетной терапии является идентификация опухолевого маркера – мишени терапевтического воздействия. Для радионуклидной визуализации онкомаркера HER2 проведено сравнительное исследование адресного полипептида DARPin2.29, меченного радиоактивным изотопом иод-125 и аквакарбонильным комплексом технеция-99m. Установлено, что радиоактивный иод-125 является предпочтительной меткой для адресного пептида DARPin9_29, поскольку обеспечивает более высокое соотношение опухоль:органы по сравнению с технецием-99m и не вызывает высокого неспецифического накопления радионуклида в органах [Vorobyeva et al., Contrast Media Mol. Imaging. 2018]. Намечен новый подход к противоопухолевой терапии путем направленной доставки белка HSP70 и его С-концевого фрагмента HSP70/16 на поверхность опухолевых клеток с помощью супрамолекулярных конструкций на основе пары барназа:барстар и противоопухолевого миниантитела [Сапожников и др., Acta naturae, 2018]. Задачи проекта на 2018 год полностью выполнены. Результаты работы в 2018 году представлены на сайте ИБХ РАН http://www.ibch.ru/structure/groups/molimmunol