Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В 2017 году в рамках реализации гранта РНФ исполнителями была организована научно-исследовательская экспедиция в район тундры Долгано-Ненецкого округа полуострова Таймыр. В сложных климатических условиях Арктики в полевой лаборатории проводились работы по получению данных о репродуктивных особенностях северных оленей. С помощью местной бригады ненцев отлавливали самцов и получали сперму домашних северных оленей, оценивали её. Также отмечали экстерьерные признаки самцов-производителей (хоров). Таким образом было оценено 23 хора. Фотоотчет о полярной экспедиции представлен на сайте ВНИИГРЖ http://vniigen.ru/v-ramkax-realizacii-granta-rnf-sotrudnikami-vniigrzh-osushhestvlena-poezdka-na-poluostrov-tajmyr/. В результате проведённых исследований разработана методика получения спермы северного оленя с использованием седативных препаратов и без них. Предложены рекомендации по эффективному получению спермы северных оленей в условиях тундры. Так, наиболее предпочтительными препаратами для фиксации северных оленей можно считать комбинацию кетамина с детомидином , Золетил – 100 и миорелаксанты. Для фиксации агрессивных и диких самцов удобнее всего использовать инъекционное устройство для введения препаратов животным на расстоянии. Нами было установлено наиболее эффективным получение спермы без медикаментозной фиксации самца, в стоячем положении. От момента фиксации (привязывания к нартам пойманного животного), до получения эякулята проходило не более 5 минут. Данный метод менее травматичен для полудиких животных. В условиях Арктики во время гона температура падает до -10 ° C , что способно оказать негативное воздействие на качество получаемого эякулята. Для получении спермы методом электроэякуляции в условиях тундры нами был разработано новое устройство. Данный способ позволяет сохранять постоянную температуру получаемого образца, помогая избежать холодового шока, а, следовательно, получить объективную информацию о качестве спермы. По завершении экспедиции была продолжена обработка данных. Проведена сравнительная оценка образцов по объему, концентрации, подвижности, рН, морфологии, целостности мембран сперматозоидов северных оленей. Использовали стандартный статистический анализ этих показателей. Объем спермы северного оленя за одну эякуляцию колебался от 0,02 до 2 мл, а концентрация в ней клеток - от 0,25 до 1,2 млрд/мл. рН спермы северного оленя варьировала от 6,7 до 7,2. Общая и прогрессивная подвижность сперматозоидов колебались от 50 до 91 % и от 33 до 79 % соответственно. В среднем, обнаружено 80,0% клеток без морфологических изменений с колебаниями от 56,5 до 86,9%. Патологические нарушения распределились следующим образом: 6,4±0,83% - в области акросомы и 13,6±1,64% - в области хвоста и шейки. Количество клеток с неповрежденными мембранам колебалось от 65 до 85%, (в среднем 79,6 ±2,33%). Свежеполученную (нативную) сперму подвергали охлаждению и заморозке. Затем, проводили сравнительную оценку образцов по подвижности, морфологии, целостности мембран до и после замораживания. Таким образом были получены первые данные о криорезистентности сперматозоидов северного оленя. По сравнению с нативной спермой установлено резкое падение общей и прогрессивной подвижности сперматозоидов после замораживания в среднем на 60 %, а в некоторых случаях до полной потери подвижности. Также установлено снижение количества клеток с неповрежденными мембранами в среднем на 30%. Тогда как изменения по морфологическим показателям после замораживания были не так значительны. Так, количество клеток без повреждений уменьшилось всего на 5,2% (от 0,93 до 15,8%). Количество клеток с поврежденными акросомами увеличилось в среднем на 2,5% (от 0,6 до 8,3 %), а с повреждениями в области хвоста и шейки – на 2,6% (от 0,1 до 7,6%). Это может свидетельствовать о высокой криоустойчивости спермы северных оленей по морфологическим показателям. Таким образом, получены и оценены первые данные о физиологических и морфологических изменениях сперматозоидов северных оленей при охлаждении и замораживании. Дальнейшие исследования в этой области помогут разработать методику, обеспечивающую сохранность биологической полноценности спермы. По результатам проведённых исследований опубликованы тезисы, индексируемые в базе данных Web of Science ( Plemyashov K, Nikitkina E, Goncharov V, Krutikova A, Sergeeva O. Semen collection and evaluation in reindeer (Rangifer tarandus), Reproduction in domestic animals 2017. Т. 52. № S3. С. 178 ), подготовлена заявка на патент « Способ получения спермы северных оленей». Исполнители гранта приняли участие в следующих конференциях : 1. Международная конференция Европейского общества репродукции домашних животных(ESDAR), 24-26 августа, г. Берн, Швейцария; Постерный доклад – «Semen collection and evaluation in reindeer (Rangifer tarandus)» (Племяшов К.В., Никиткина Е.В., Крутикова А.А.); 2. Устный доклад на Международной конференции "Живая природа Арктики: сохранение биоразнообразия, оценка состояния экосистем" 30 октября-3 ноября 2017г, г. Архангельск, (доклад: " Использование репродуктивных технологий для сохранения популяций северного оленя", докладчики: Никиткина Е.В., Крутикова А.А.)

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках реализации проекта в 2018 году была организована экспедиция на полуостров Таймыр. Задействовали бригаду оленеводов с 1,5-тысячным стадом на правом берегу Енисея. Важно отметить, что за последние 50 лет это первое стадо домашних северных оленей, пришедших на пастбища именно правого берега Енисея. Основная цель посещения Таймыра – в массовый период гона произвести отбор спермы домашних северных оленей ненецкой породы разных возрастов для последующей ее оценки и замораживания. Также получена сперма из семенников разновозрастных животных после кастрации и отстрела (постмортальная оценка). В полевых условиях тундры проведена оценка подвижности, морфологии, целостности мембран, дыхательной активности и фрагментации ДНК сперматозоидов. Произвели замораживание спермы. Дополнительно получена и заморожена сперма самцов северных оленей ненецкой породы частного зоопарка Санкт-Петербурга. В 2018 году продолжилась оценка качества спермы, полученной в 2017 г. и хранящейся в криобанках Всероссийского НИИ генетики и разведения с/х животных (Санкт-Петербург) и НИИ сельского хозяйства и экологии Арктики (г. Норильск). Впервые в мире проведена оценка по дыхательной активности и фрагментации ДНК сперматозоидов северного оленя. Стимуляция дыхания 2,4-ДНФ в нативной сперме составила от 1,0 до 1,7; клеток с фрагментированной ДНК – от 3,3 до 23,5 %. В результате оценки образцов 2017-2018 гг. получены первые данные об изменениях сперматозоидов северного оленя при криоконсервации. После оттаивания сперматозоиды от 42 % эякулятов теряли более 50 % общей подвижности; 25 % эякулятов теряли менее 20 % подвижности. Количество клеток с повреждениями хвоста и шейки увеличилось в среднем на 4,2 ± 1,0 5%, а акросом – на 2,5 ± 0,35 %. При анализе повреждений плазматических мембран сперматозоидов наблюдалась высокая изменчивость – 0,13-45 %. Не выявлено значительных изменений в стимуляции дыхания 2,4-ДНФ – степень стимуляции или совсем не изменялась, или изменялась незначительно. В среднем число клеток с фрагментированной ДНК увеличилось на 0,9 %. В нативной сперме северных оленей, как эякулированной, так и эпидидимальной наблюдался повышенный процент (в сравнении с другими видами животных) сперматозоидов со сморщенной или отсутствующей акросомой – в среднем 6,9 ± 0,76 %. Изучалось влияние возраста самцов северных оленей на качество спермы. Получение эякулированной спермы у самцов в возрасте 1,5-2,5 года было затруднительным. Однако сперма молодых хоров обладала высокой криоустойчивостью. Подвижность после замораживания практически не изменялась и оставалась на том же уровне. Достоверного влияния возраста на морфологические показатели качества спермы северных оленей не наблюдалось. Также изучалось влияние периода гона на качество спермы. При замораживании спермы в конце гона зафиксировано резкое падение общей и прогрессивной активности – в среднем на 50 %, в то время как в начале и середине гона подвижность падала в среднем на 32 %. В начале гона наблюдалось повышенное содержание клеток с нарушениями в области хвоста и шейки 22,7 ± 5,87 по сравнению с серединой и концом гона (10,5 ± 1,56 и 10,8 ± 0,66 %; P < 0,01). В ходе выполнения проекта в 2018 году был подобран разбавитель для криоконсервации спермы северных оленей. При замораживании в подобранном разбавителе снижение общей подвижности сперматозоидов составляло в среднем на 15,7 ± 3,7 %, а прогрессивной на 9,5 ± 2,84 %. В некоторых эякулятах изменения прогрессивной подвижности после криоконсервации не наблюдалось. Результаты исследований опубликованы в журналах, индексируемых Web of Science и РИНЦ. Зарегистрирована заявка на изобретение. Ход реализации проекта и основные результаты освещались в сети Интернет, проект имеет собственный аккаунт в Instagram - rscf_reindeer_grant.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2019 году сперму получали методом электроэякуляции от 3-х самцов 2-х частных зоопарков Санкт-Петербурга. Также сперму получали из 25 семенников домашних и диких северных оленей после кастрации и отстрела на Таймыре и Ямале. Успех получения спермы методом электроэякуляции зависел от периода гона. В начале и конце гона требовалось больше времени для получения эякулята, в некоторых случаях сперма получена не была. В пик гона, длившегося примерно 2 недели сперму от каждого хора получали с первой попытки. Семенники от 20 животных были доставлены в г. Норильск не позднее чем, через 5 часов после отстрела (10 диких и 8 домашних оленей) или кастрации (2 домашних). Семенники от 5 самцов были доставлены с Ямала в Санкт-Петербург через 2 суток после отстрела через месяц после окончания гона. В 2019 году впервые в мире проведена оценка повреждений мембран сперматозоидов северного оленя флуоресцентным методом до и после замораживания. Среднее количество клеток с поврежденными мембранами было 19,9±1,99 (2,75–39,4) %, после замораживания 34,3±3,79 (4,9-62,7) %. Так же впервые в мире изучались физиологические, морфологические и биохимические изменения в сперматозоидах северного оленя при охлаждении и замораживании. Наибольшим изменениям при действии низких температур на сперму северных оленей подвергается подвижность клеток и целостность мембран сперматозоидов как в эпидидимальной, так и эякулированной сперме. Наблюдалась высокая вариабельность по снижению подвижности сперматозоидов после замораживания. В некоторых образцах наблюдалась резкое падение как общей (70%, в среднем 22,2±2,7%), так и прогрессивной подвижности (55 %, в среднем 18,9±2,6 %). Максимальное увеличение повреждений мембран в эякулированной сперме было на 39% , в эпидидимальной на 21 %. Скорее всего, поврежденные мембраны нарушают работу митохондрий и двигательный аппарат сперматозоидов. При этом небольшое снижение стимуляции дыхания 2,4 ДНФ после криоконсервации указывает на то, что в клетках северного оленя преобладает гликолиз, как в сперматозоидах быков и баранов. Однако, проведенный корреляционный анализ показал высокую, достоверную связь (p<0,01) между значениями стимуляции дыхания 2,4 ДНФ в клетках до замораживания и общей (r=0,62) и прогрессивной подвижностью (r=0,65) после замораживания. Высокая стимуляция дыхания 2,4 ДНФ может служить маркером хорошей криоустойчивости спермы. Основными факторами, влияющими на изменения сперматозоидов в ходе криоконсервации, помимо охлаждения, замораживания и оттаивания, являются возраст самца, состав разбавителя и индивидуальная криорезистентность спермы. Усовершенствован разбавитель для криоконсервации спермы северных оленей. В результате при разбавлении в TRISm наблюдалась лучшая сохранность мембран после криоконсервации как в эпидидимальной, так и в эякулированной сперме. Количество клеток с поврежденной мембранной при разбавлении в TRIS после криоконсервации увеличилось на 12,8±1,99 (0 – 39,5) %, а в TRISm на 9,4±1,82 (0 - 36,5)%. Также при использовании TRISm наблюдалась лучшая сохранность подвижности после замораживания-оттаивания. Опубликовано 9 работ и принята к публикации одна статья, из них 7 индексируются в Web of Science Core Collection и Scopus. Получен патент « Устройство для сбора спермы северных оленей в полевых условиях» - Свидетельство о государственной регистрации 2018140358, приоритет от 15.11.2018. Исполнители проекта представляли результаты на международных конференциях в России, Швеции, США, Финляндии и Австралии. 8 устных докладов, из них 4 на английском языке и 8 постеров. Ход реализации проекта освещался в СМИ: https://vk.com/sgnorilsk?z=video-157892940_456240924%2Fccd2cfbe36a1d9ac10%2Fpl_wall_-157892940 и на сайте ВНИИГРЖ vniigen.ru. Проект имеет свой Instagram аккаунт - @rscf_reindeer_grant.