КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 17-15-01512

НазваниеТ-клеточный ответ на иммунодоминантные минорные антигены гистосовместимости после аллогенной трансплантации гемопоэтичечких стволовых клеток

РуководительЕфимов Григорий Александрович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2017 г. - 2019 г.

Конкурс№18 - Конкурс 2017 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-108 - Иммунология

Ключевые словагеномные полиморфизмы, аллореактивность, аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток, минорные антигены гистосовместимости, высокопроизводительное секвенирование, реакции трансплантат против опухоли, РТПО, реакция трансплантат против хозяина, РТПХ, главный комплекс совместимости, MHC-мультимеры, репертуары Т-клеточных рецепторов

Код ГРНТИ34.15.33

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) на сегодняшний день считается наиболее эффективным способом лечения для ряда тяжелых форм злокачественных заболеваний крови. Эффективность алло-ТГСК во многом объясняется антиген-специфичным аллореактивным иммунным ответом клеток донора, направленным против клеток кроветворной системы пациента, включая раковые клетки, выжившие после курса предтрансплантационной химиотерапии. В то же время, аллореактивный иммунный ответ может повреждать, кроме кроветворной, и здоровые ткани организма хозяина, что вызывает развитие реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ), которая является одним из основных осложнений алло-ТГСК. Мишенями Т-клеточного иммунного ответа, включая аллореактивный, являются пептиды, представленные на поверхности клеток в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (гены, кодирующие эти белки у человека называются HLA, human leukocyte antigens). В случае, если донор и реципиент различаются по аллелям HLA, могут развиваться тяжелые формы РТПХ. В настоящее время большая часть пересадок осуществляется от HLA-идентичного сиблинга или HLA-совместимого донора, подобранного с использованием банков доноров костного мозга. При HLA-совместимости мишенями аллореактивного ответа после аллогенной трансплантации являются пептиды, представленные на клетках пациента и чужеродные для донора. Они получили название минорные антигены гистосовместимости (МАГ). Появление таких пептидов вызвано существованием несинонимичных полиморфизмов в геноме человека: трансляция и последующая протеасомная деградация вариантных белков ведет к формированию различных наборов пептидов, презентируемых в молекулах главного комплекса гистосовместимости на клетках различных людей. В таком случае пептиды, представленные только в иммунопептидоме реципиента будут чужеродными для донорских клеток при пересадке. В настоящее время известно всего около 50 иммуногенных несинонимичных однонуклеотидных полиморфизмов (нсОНП), то есть вызывающих появление минорных антигенов гистосовместимости. И хотя некоторые из них уже были использованы как мишени в экспериментальной таргетной терапии злокачественных заболеваний крови, вопрос иммуногенности нсОНП остается крайне слабо изученным. Если учитывать только уже описанные МАГ, то каждая пара донор-реципиент будет иметь в среднем одно или два несовпадения, однако экспериментальные данные, полученные масс-спектрометрическим анализом иммунопептидомов говорят о том, что донор и реципиент различаются как минимум по нескольким десяткам пептидов. Кроме того, в каждой паре существует значительное количество уникальных или крайне редких нсОНП, чей вклад в аллореактивный иммунный ответ до сих пор не изучался. Для определения иммуногенности различных нсОНП и оценки вклада индивидуальных и редких полиморфизмов необходимо детально изучить специфичные мишени аллореактивного иммунного ответа в достаточном количестве пар донор-реципиент. На данный момент не изучено, насколько для аллореактивного иммунного ответа характерен феномен иммунодоминантности, то есть на сколько минорных антигенов одновременно развивается ответ после алло-ТГСК. Неизвестно также, какие факторы определяют иммунодоминантность и можно ли предсказать иммуногенные антигены in silico или в ходе лабораторных тестов in vitro. В рамках данной работы мы планируем детально изучить аллореактивный ответ в нескольких парах донор-реципиент, проходящих процедуру трансплантации стволовых клеток крови, включая специфичный ответ на известные МАГ и достаточное количество иммуногенных минорных антигенов, предсказанных in silico (в том числе кодируемых редкими и индивидуальными нсОНП). Ранее, проводимые исследования аллореактивного ответа при алло-ТГСК были сфокусированы на поиске и исследовании новых распространенных в популяции минорных антигенов, которые потенциально применимы в иммунотерапии. Данная работа направлена на изучение фундаментальных характеристик аллореактивного иммунного ответа и его количественного аспекта. Установление факторов, влияющих на формирование аллореактивного ответа, и точное предсказание иммунодоминантных антигенов для пары донор-реципиент могут быть в дальнейшем использованы для повышения эффективности алло-ТГСК.

Ожидаемые результаты
В ходе данной работы будет исследовано количество аллореактивных клеток, клональность аллореактивного ответа и его вариативность в нескольких парах донор-пациент, как методам in vitro, так и in vivo, после процедуры трансплантации стволовых клеток крови. Это позволит, с одной стороны, получить верхнюю оценку количества антигенных мишеней (количество Т-клеточных клонов, активированных аллогенными клетками), с другой, определить количество клонов, прошедших существенную экспансию (в ответ на иммунодоминантные антигены), а с третьей, оценить вариативность этих параметров между парами. Эти фундаментальные свойства аллореактивного иммунного ответа, ранее детально не исследованные, могут быть связаны с выраженностью эффектов РТПХ и РТПО. Одна из главных особенностей предлагаемого проекта – сравнение результатов аллореактивных тестов in vitro и in vivo. Будет получено пересечение репертуаров как полных аллореактивных ответов in vivo/in vitro, так и пересечения антиген-специфичных репертуаров на примере уже известных минорных антигенов. Ожидается, что последовательности клонов, прошедших наибольшую экспансию, будут повторяться. Эти данные позволят ответить на крайне актуальный вопрос - возможно ли предсказать аллореактивные in vivo клоны заранее, до трансплантации, основываясь только на лабораторных тестах с кровью донора и пациента. Если аллореактивность можно предсказывать, в дальнейшем такие тесты могли бы лечь в основу протокола деплеции клеток, специфичных к наиболее иммуногенным мишеням, из трансплантата. Следующим важным результатом будет оценка вклада уникальных для пары нсОНП в формирование аллореактивного ответа. Ранее, при исследовании публичных данных полногеномного секвенирования, нами было предсказано, что редкие МАГ должны составлять большую часть мишеней аллореактивного ответа. В данном проекте, путем синтеза и проверки иммуногенности предсказанных in silico индивидуальных МАГ в парах донор-реципиент, проходящих трансплантацию, мы планируем впервые подтвердить эти результаты на практике. Ранее, исследования МАГ были направлены исключительно на поиск распространенных в популяции МАГ, что объясняется практическим значением, связанным с широкой применимостью этих данных. Однако исследование индивидуальных МАГ не только представляет собой важную фундаментальную задачу, но также имеет потенциальное практическое применение, в дальнейшем индивидуальные МАГ возможно использовать для проведения индивидуальной иммунотерапии - чтобы увеличить количество мишеней аллореактивного ответа для повышения эффективности РТПО, или же в случае, когда несовпадения по уже изученным МАГ отсутствуют в данной паре. Полученные в ходе работы данные о репертуарах антиген-специфичных ответов in vivo на множество антигенов и секвенирование полного референсного репертуара ТКР донора позволят выявить, есть ли зависимость между иммуногенностью эпитопов (пролиферацией лимфоцитов in vivo) и количеством наивных антиген-специфичных клеток в исходном репертуаре донора. Эта гипотеза была ранее подтверждена на примере мышиных моделей аллореактивности. Ее подтверждение для человека будет иметь как фундаментальную ценность, так и практическое применение. Дополнительным результатом данной работы может стать обнаружение новых клинически значимых минорных антигенов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
При аллогенной полностью HLA-совместимой трансплантации гемопоэтических стволовых клеток между донором и пациентом имеются тысячи несинонимичных однонуклеотидных замен несоответствий, некоторые из которых приводят к образованию полиморфных пептидов, презентируемых в контексте MHC, известных как минорные антигены гистосовместимости (МАГ). Поскольку эти пептиды иммунологически чужие донорским иммунным клеткам, они могут стимулировать аллогенный иммунный ответ, вызывая как реакцию «трансплантат против хозяина», так и благоприятный эффект «трансплантат против опухоли». Однако из-за явления иммунодоминантности некоторые из МАГ гораздо более иммуногенны, чем другие. В рамках первого года проекта, было выбрано семь полностью HLA-совместимых пар донор-реципиент, проходящих процедуру аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, и проанализирован in vitro аллогенный иммунный ответ на ранее описанные МАГ. С этой целью был впервые разработан метод быстрого мультиплексного генотипирования иммуногенных несоответствий по МАГ между донором и пациентом на основе ПЦР в реальном времени с флуоресцентными зондами. Пары донор-пациент были генотипированы по панели полиморфизмов, кодирующих МАГ, презентируемых в частых аллелях HLA-A, для каждой пары были выявлены потенциально иммуногенные несоответствия. Затем из моноцитов периферической крови доноров были дифференцированы дендритные клетки, которые нагружались синтетическими антигенными пептидами и ко-культивировались с аутологичными наивными Т-клетками методом предельного разведения, что позволило рассчитать частоты встречаемости антиген-специфичных наивных Т-клеток. Кроме того, с помощью магнитной сортировки активированных клеток были выделены антигенспецифические CD8 + Т-лимфоциты, клонированны и секвенированных вариабельные фрагменты альфа- и бета-цепей их Т-клеточного рецептора (ТКР). Доминантные клоны также тестировались на антиген-специфические эффекторные функции. Было продемонстрировано, что частоты наивных Т-клеток, специфичных для иммунодоминантных антигенов (HA-2, HA-1, LB-ADIR), значительно выше, чем для субдоминантного антигена (ACC-1Y), а вариабельность между антигенами значительно выше, чем между донорами. Различие в частотах наивных Т-клеток, специфичных для различных МАГ, могут объясняться либо свойствами антигенных пептидов, либо влиянием отрицательного отбора на исходный репертуар Т-клеток. ACC-1Y имеет альтернативный аллельный вариант (ACC-1C), представленный в тимусе, что приводит к элиминации всех кросс-реактивных клонов, тогда как альтернативный аллельный вариант HA-2, HA-1 и LB-ADIR иммунной системе не представляется (HA-2 расщепляется протеасомой, другие два пептида имеют низкую аффинность к аллели HLA-A * 02). Полученные данные свидетельствуют о том, что явление иммунодоминантности МАГ может быть продиктовано частотами МАГ-специфичных Т-клеток, различающихся, в свою очередь, под влиянием негативного отбора в тимусе. Анализ ТКР-последовательностей клонов МАГ-специфичных клеток показал, что альфа-цепь ТКР, по всей вероятности, играет первостепенную роль в распознавании антигена HA-2. Антиген-специфические клоны были существенно обогащены TRAV21 и TRAJ42. Ранее опубликованные HA-2 специфические последовательности ТКР также преимущественно используют эти V и J генов альфа-цепи. Было продемонстрировано, что МАГ-специфичные Т-клетки при стимуляции клетками, презентирующими несовпадающий МАГ, экспрессируют гамма-интерферон и могут опосредовать цитотоксичность клеток-мишеней, в то время как аутологичные клетки (представляющие пептид с одной аминокислотной заменой в своих MHC) защищены от цитотоксичности. Это указывает на то, что в МАГ-специфичных культурах Т-клеток, разрастаются только клетки, которые не встречали врожденный антиген в тимусе, то есть не происходит срыва толерантности. Таким образом, эти клетки могут использоваться для Т-клеточной терапии после МАГ-несовместимых трансплантаций. Дополнительно, в течение первого года проекта была накоплена ценная коллекция образцов клеток от пар донор-реципиент, которые будут использоваться в течение второго и третьего года проекта.

Публикации

1. А. С. Вдовин, Н. А. Быкова, Г. А. Ефимов Т-ЛИМФОЦИТЫ С МОДИФИЦИРОВАННОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ В ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, том 51, No 6, с. 1–17 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.7868/S002689841706012X

2. Быкова Н.А., Малька Д.Б., Ефимов Г.А. DISCREPANCY BETWEEN IN SILICO PREDICTIONS AND EXPERIMENTAL ESTIMATION OF DOMINANT/CODOMINANT RATIO OF POTENTIAL MINOR HISTOCOMPATIBILITY ANTIGENS Human Immunology, 78 (2017) 1–50 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1016/j.humimm.2017.06.036

3. Кучмий А.А., Шитиков С.А., Романюк Д.С., Постовская А.М., Филькин С.Ю., Быкова Н.А., Ефимов Г.А. IMMUNOGENICITY OF MINOR HISTOCOMPATIBILITY ANTIGENS MAY BE DEPENDENT ON THE FREQUENCIES OF NAIVE PRECURSOR CELLS IN THE DONOR REPERTOIRE Human Immunology, 78 (2017) 51–254 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1016/j.humimm.2017.06.088

4. Кучмий А.А., Шитиков С.А., Романюк Д.С., Постовская А.М., Филькин С.Ю., Быкова Н.А., Ефимов Г.А., Савченко В.Г. Highly Variable Frequencies of Donor Antigen-Specific Naive Cells May Dictate the Immunogenicity of Minor Histocompatibility Antigens after Hematopoietic Stem Cell Transplantation Blood, - (год публикации - 2017)

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе выполнение второго года проекта нами были уточнены частоты наивных предшественников, распознающих минорные антигены гистосовместимости (МАГ), для этого нами были применены два независимых метода: NGS-секвенирование репертуаров рецепторов Т-лимфоцитов из антиген-специфичных экспансий, а также метод предельного разведения и статистического подсчета антиген-специфичных клонов. Было показано, что частота предшественников для различных МАГ различается на несколько порядков. Это означает, что при предсказании новых МАГ необходимо учитывать не только константу связывания пептида с MHC и процессинг пептида протеасомой но также и потенциальную частоту наивных предшественников в репертуаре. Были получены 149 последовательностей, кодирующие Т-клеточные рецепторы, специфичные к пяти минорным антигенам гистосовместимости и проанализирована степень их гомологии. Было показано, что альфа-цепи ТКР, специфичных к минорному антигену HA-2, имеют высокий уровень аминокислотной гомологии, позволяющий предсказывать специфичность вновь секвенируемых клонов. В то же время для других исследованных минорных антигенов такой гомологии обнаружено не было. С помощью антиген-специфичной экспансии и последующего секвенирования репертуаров ТКР был детектирован ответ на минорные антигены HA-1 и HA-2 ин виво в пациентах после аллогенной трансплантации. Было показано, что количество циркулирующих в крови антиген-специфичных клеток не позволяет детектировать антиген-специфичные клоны напрямую ex vivo. Было показано, что ответ на оба эти антигена ин виво поликлонален, что согласуется с высокой частотой предшественников, обнаруженных у доноров. Было выявлено, что пациенты после трансплантации имею значимо увеличенную популяцию цитотоксических лимфоцитов, экспрессирующих одновременно ко-стимуляционные маркеры, так и маркеры истощения. Доля клеток подобного фенотипа при этом достоверно растет с течением времени от момента трансплантации. Было проведено полноэкзомное севенирование 3х пар донор-реципиент и предсказаны полиморфизмы, которые наиболее вероятно могут кодировать неизученные ранее минорные антигены. Наиболее перспективные полиморфизмы были выбраны для анализа на 3-ем году. Был отработан метод получения антиген-специфичных экспансий на минорные антигены с помощью аутологичных дендритных клеток, трансфицированных РНК, кодирующей тандемные минигены. Ранее подобны метод был описан только для проверки иммуногенности неоантигенов.

Публикации

1. Быкова Н.А., Малько Д.Б., Ефимов Г.А. In Silico analysis of the Minor histocompatibility antigen landscape Based on the 1000 genomes Project Frontiers in Immunology, August 2018 | Volume 9 | Article 1819 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01819

2. Пилунов А.М., Кучмий А.А., Шитиков С.А., Филькин С.Ю., Романюк Д.С., Розов Ф.Н., Ефимов Г.А. МОДИФИКАЦИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ РЕЦЕПТОРОМ, СПЕЦИФИЧНЫМ К МИНОРНОМУ АНТИГЕНУ ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ ACC1-Y Молекулярная биология, - (год публикации - 2019)

3. Шитиков С. А., Кучмий А.А., Быкова Н.А., Филькин С.Ю., Романюк Д.С., Ефимов Г.А. In silico анализ последовательностей Т-клеточных рецепторов, специфичных к минорному антигену гистосовместимости HA-2 Российский иммунологический журнал, - (год публикации - 2019)

4. Быкова Н.А, Романюк Д.С., Конова З.В., Ефимов Г.А. Discovery of a new minor histocompatibility antigen presented in HLA-B*13:02 allele Bone Marrow Transplantation, - (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1038/s41409-018-0354-7

5. Романюк Дмитрий Сергеевич, Постовская Анна Михайловна, Вдовин Александр Сергеевич, Ефимов Григорий Александрович, Савченко Валерий Григорьевич Способ идентификации иммуногенных несоответствий ДНК в парах донор-пациент при планировании трансплантации гемопоэтических стволовых клеток -, - (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Было предсказано 19 новых минорных антигенов гистосовместимости. С использованием синтетических пептидов было подтверждено, что все предсказанные антигены способны связываться с MHC. Анализ эндогенного процессинга пептидов протеасомой и их способности вызывать иммунный ответ проводился с помощью ко-культивации наивных CD8+ лимфоцитов доноров с дендритными клетками, экспрессирующие изучаемые антигены. Для этого были сконструированы тандемные минигены, кодирующие предсказанные антигены, окруженные аминокислотами из материнских белков. Для трех предсказанных минорных антигенов было подтверждено, что они процессируются протеасомой и способны вызывать иммунный ответ, таким образом являются новыми описанными минорными антигенами. Еще на четыре минорных антигена иммунный ответ развивался при добавлении синтетических антигенных пептидов. В то же время большинство исследуемых пептидов оказались неиммуногенными. Что, вероятнее всего, связано с крайней низкой частотой антиген-специфичных лимфоцитов. Антиген-специфичные лимфоциты были отсортированы методом проточной цитометрии, после чего последовательности, кодирующие Т-клеточный рецептор были отсеквенированы с помощью NGS. Все полученные рецепторов имели достаточную низкую вероятность сборки, что согласуется с их низкой иммуногенностью ин витро. Рецептор к одному из антигенов был клонирован в лентивирусный вектор. Было подтверждено, что трансдуцированные лимфоциты специфично связывают антиген.

Публикации

1. Романюк Д.С., Постовкая А.М., Хмелевская А.А., Малько Д.Б., Ефимов Г.А. Rapid Multiplex Genotyping of 20 HLA-A*02:01 Restricted Minor Histocompatibility Antigens Frontiers in Immunology, - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01226

2. Романюк Д.С., Хмелевская А.А., Постовская А.М., Малько Д.Б., Кузьминова Е.П., Хамаганова Е.Г., Ефимов Г.А. КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ МИНОРНЫЕ АНТИГЕНЫ ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ ДЛЯ РОССИЙСКИХ ПАЦИЕНТОВ, ПОЛУЧАЮЩИХ ТРАНСПЛАНТАЦИЮ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КРОВИ Медицинская иммунология, Т. 21, No 5, стр. 847-860 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.15789/1563-0625-2019-5-847-860

3. Конова З.В., Быкова Н.А., Вагида М.С., Кузьмина Л.А., Дроков М.Ю., Ефимов Г.А., Паровичникова Е.Н., Савченко В.Г. T-cell subpopulation, specific for patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation Bone Marrow Transplantation, 54 S, 491-492 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1038/s41409-019-0559-4

4. Романюк Дмитрий Сергеевич, Постовская Анна Михайловна, Вдовин Александр Сергеевич, Ефимов Григорий Александрович, Савченко Валерий Григорьевич СпособидентификациииммуногенныхнесоответствийДНКвпарахдонор-пациентприпланировании трансплантации гемопоэтических стволовых клеток -, 2 675 597 (год публикации - )

5. - Российские медики выяснили, как улучшить пересадку костного мозга РИА НОВОСТИ, - (год публикации - )

6. - Создан способ найти отличия между клетками донора костного мозга и пациента Газета.Ru, - (год публикации - )

7. - Найден способ быстрого обнаружения различий в ДНК донора и реципиента при пересадке костного мозга RT (Russia Today), - (год публикации - )

8. - Новый метод анализа генетической совместимости повысит эффективность пересадки при лейкозе ТАСС, - (год публикации - )

9. - В НМИЦ гематологии нашли быстрый способ определения различий в генетике донора и пациента МЕДВЕСТНИК, - (год публикации - )

10. - Российские иммунологи разработали новый метод выявления генетических различий Indicator, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
Разработанный метод генотипирования полиморфизмов, кодирующих минорные антигены гистосовместимости может быть использован в клинике для предсказания исхода трансплантации