Аннотация результатов, полученных в 2017 году
К моменту предоставления отчета набрано 15 пациентов с длительным анамнезом ожирения с наличием/отсутствием СД 2 типа. Пациентам выполнен комплекс лабораторных исследований (биохимических, гормональных), выполнена оценка инсулинорезистентности (ИР), определен композиционный состав тела. Проведен предварительный сравнительный анализ данных показателей у пациентов с наличием/отсутствием СД 2 типа с целью выявления факторов риска развития нарушений углеводного обмена у лиц с длительным анамнезом ожирения. По результатам 1 года работы к основным предикторам развития СД 2 у пациентов с ожирением относятся: длительность ожирения, степень ИР, процент содержания висцеральной жировой ткани, гиперглюкагонемия. Данные результаты требуют уточнения в ходе расширения выборки в 2018-2019 гг. Одной из приоритетных задач работы является поиск молекулярно-клеточных факторов, которые могут быть ассоциированы с развитием СД2 у пациентов с выраженным ожирением, для чего собрана коллекция образцов пациентов с ожирением и наличием/отсутствием СД 2 типа. В ходе выполнения проекта в отчетном году научный коллектив начал формирование коллекции образцов биоптатов жировой ткани, а также выделенных МСК ЖТ пациентов с ожирением и наличием/отсутствием СД 2 типа. Выделенные МСК из подкожной и висцеральной жировых тканей способны к дифференцировкам в адипогенном и остеогенном направлениях. Выделенные МСК имеют иммунофенотип CD90+CD73+CD45-CD31-CD14-, что продемонстрировано методом проточной цитометрии. Согласно полученным результатам, фенотип выделяемых МСК полностью соответствует критериям International Society of Cellular Therapy Statement. На базе создаваемой коллекции получены первые научные результаты. На гистологических препаратах висцеральной жировой ткани пациентов с ожирением и наличием/отсутствием СД 2 типа выявлен повышенный уровень инфильтрации CD68+-клетками висцеральной жировой ткани пациентов с ожирением и наличием СД 2 типа. Показано, что выделенные МСК ЖТ пациентов с ожирением и наличием СД 2 типа хуже пролиферируют в ответ на добавление FBS (данные получены на 24, 48, 72 и 96 часов), а также при адипогенной дифференцировке формируют адипоциты большего размера с большим числом жировых капель («гипертрофического» типа). Данные получены в сравнении с МСК ЖТ пациентов с ожирением и отсутствием СД 2 типа. При анализе распределения клеток по фазам клеточного цикла для МСК подкожной жировой ткани отличий в числе метаболически активных клеток (S фаза + G2/M фаза) между группами пациентов с наличием и отсутствием СД 2 типа не выявлено, что соответствует данным по пролиферации на 24 часа инкубации с FBS. Данные анализа распределения клеток по фазам клеточного цикла для МСК висцеральной жировой ткани пока являются недостоверными из-за плохого разрешения пиков при использовании данного метода окраски. В дальнейшем планируется увеличение размера выборок и оптимизация метода анализа распределения клеток по фазам клеточного цикла. Проведена предварительная оценка экспрессии генов, участвующих в развитии нарушений углеводного обмена, статистически значимых результатов не получено, что может объясняться недостаточным размером проанализированной выборки.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Целью нашей работы является поиск факторов, препятствующих развитию СД 2 у лиц с длительно существующим ожирением. Для ответа на данный вопрос были набраны пациенты с сопоставимой длительностью и выраженностью ожирения и разделены на группы с и без СД 2. По нашим результатам пациенты с СД 2 имели меньшие показатели секреции инсулина (по уровню индекса инсулиногенности), а также более выраженную ИР (по результатам гиперинсулинемического эугликемического клэмп-теста) по сравнению с лицами без нарушений углеводного обмена при схожем ИМТ. Данные клэмп-теста легли в основу оценки интегрального показателя - индекса утилизации глюкозы (ИУГ), отражающего степень поглощения глюкозы тканями. В нашем исследовании у пациентов с СД 2 ИУГ был значимо ниже, чем у пациентов без нарушений углеводного обмена. Снижению ИУГ у лиц с СД 2 влияли как повышение ИР, так и снижение секреторной функции β-клеток. Наиболее вероятно, что в сохранение нормального углеводного обмена у лиц с ожирением без СД 2 больший вклад вносит именно достаточная для преодоления инсулинорезистентности секреция инсулина, что подтверждается высоким индексом утилизации глюкозы. Изменения гормонального профиля заключались в том, что пациенты с СД 2 имели значимо более высокий уровень глюкагона как базально, так и в постпрандиальном периоде; СД 2 характеризовался уменьшением секреции инкретиновых гормонов (ГПП-1 и ГИП), повышением уровня грелина и адипокинов с продиабетогенной активностью по сравнению с лицами без нарушений углеводного обмена. Данные изменения секреции гормонов у больных СД 2 способствуют развитию и поддержанию гипергликемии. Группа пациентов с СД 2 типа также характеризовалась увеличением площади висцерального жира по сравнению с пациентами без нарушений углеводного обмена по результатам оценки композитного состава тела. Дальнейшие исследования были посвящены оценке морфологии и иммунофенотипа различных видов жировой ткани (подкожной и висцеральной), а также секретома и протеома мезенхимной стромальной клетки жировой ткани. В отчетном году был выполнен гистологический анализ суммарной инфильтрации жировой ткани пациентов макрофагами, показана усиленная инфильтрация макрофагами как висцеральной, так и подкожной жировых тканей пациентов с СД 2 по сравнению с пациентами с нормальной толерантностью к глюкозе. Более того, по данным анализа иммунофенотипа данных макрофагов, было показано, что иммунофенотип макрофагов жировой ткани пациентов с СД 2 смещен в провоспалительном направлении. Данные результаты ассоциированы с гипертрофией жировой ткани пациентов с СД 2, что позволяет предполагать роль гипертрофии жировой ткани в развитии латентного воспаления жировой ткани и инсулиновой резистентности. В нашей работе был проведен анализ секреции МСК ЖТ цитокинов адипонектина и TNFalpha, однако данные цитокины не были детектированы в их секретоме. Анализ экспрессии секретируемых факторов ИЛ-1бета, ИЛ-8 и TNFalpha не показал значимых различий уровня мРНК у пациентов с СД 2 по сравнению с пациентами с нормальной толерантностью к глюкозе. Тем не менее, при анализе экспрессии ряда внутриклеточных провоспалительных факторов (COX-2, iNOS, IDO1/2) было показано, что экспрессия данных маркеров в МСК подкожной жировой ткани практически не зависит от наличия СД 2, в то время как экспрессия iNOS и IDO1/2 значительно повышена в МСК сальниковой жировой ткани пациентов с СД 2, что, в совокупности с результатами гистологических исследований, позволяет предполагать важную роль сальниковой жировой ткани в развитии СД 2. Также в отчетном году был выполнен анализ протеомов МСК сальниковой и подкожной жировых тканей пациентов с ожирением и наличием/отсутствием СД 2. В ходе биоинформатического анализа результатов масс-спектрометрии идентифицировано 406 белков, достоверно изменяющих свою экспрессию, общих для всех пациентов с ожирением и наличием/отсутствием СД 2. В результате сопоставления данных об изменении общих идентифицированных белков было показано, что достоверно сходно изменяли свою экспрессию при СД 2 12 белков для МСК подкожной жировой ткани и 27 белков МСК сальниковой жировой ткани. Среди идентифицированных белков встречаются регуляторы окислительного стресса, реорганизации актинового цитоскелета, везикулярного транспорта и апоптоза. Результаты протеомного анализа позволили идентифицировать группы конкретных внутриклеточных процессов, которые могут быть ответственны за нарушения физиологии МСК ЖТ при СД 2. Для определения генетических предикторов защиты от развития СД 2 у лиц с длительным анамнезом ожирения проводилось обнаружение микроРНК со значительной разницей экспрессии в группах пациентов с помощью NGS-анализа для последующего поиска их мишеней. Было обнаружено, что в группе без нарушений углеводного обмена снижена экспрессия miR-204-5p. MiR-204-5p напрямую регулирует экспрессию рецептора ГПП-1 и снижение ее экспрессии приводит к увеличению экспрессии ГПП-1, нормализации углеводного обмена, увеличению синтеза цАМФ и инсулина, что может являться защитным фактором против развития СД 2. Текущее исследование имеет клиническое значение, поскольку выявляет факторы, обеспечивающие защиту от метаболических осложнений у лиц с давно существующим ожирением. Обнаружение таких защитных факторов может служить основой для определения потенциальных целей для лекарственного средства для профилактики СД 2. Понимание основ различий позволяет выбрать группы с высоким или низким риском развития осложнений ожирения, и определить когорту людей, требующих наиболее интенсивного наблюдения и лечения.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2019 году закончен набор клинического материала (пациенты с ожирением и СД2 и без СД2). Итоговый межгрупповой анализ направленный на определение различий в уровнях инсулинорезистентности, активности поджелудочной железы, работе инкретиновой системы, композитном составе тела, представлен в итоговом трехгодовом отчете по данному проекту. В отчетном году в коллекции клеточных культур и гистологических образцов пациентов с ожирением и наличием/отсутствием СД 2 содержится биологический материал от 57 пациентов. В ходе работы этого года была проведена оценка бежевой дифференцировки адипоцитов, которая показала существенное снижение активации экспрессии UCP-1 при бежевой дифференцировке. Тем не менее, согласно результатам анализа сигнальной активации липолиза/липогенеза и анализа экспрессии генов липолиза/липогенеза, доступность субстратов термогенеза в виде свободных жирных кислот в бежевых адипоцитах одинакова у пациентов с ожирением и наличием/отсутствием СД 2. Анализ экспрессии генов ЭТЦ и систем оксидативной защиты в бежевых адипоцитах показал отсутствие различий по данным показателям у пациентов с ожирением и наличием/отсутствием СД 2. Однако, бежевые адипоциты, полученные из МСК ЖТ пациентов с ожирением и наличием/отсутствием СД 2, характеризовались накоплением митохондриальных АФК, что в совокупности с нарушением термогенеза свидетельствует об нарушениях в активности бежевых адипоцитов при СД 2. Анализ инсулиновой чувствительности и сигнализации зрелых адипоцитов, дифференцированных из МСК ЖТ пациентов с ожирением и наличием/отсутствием СД 2, показал отсутствие существенных различий в инсулин-зависимом транспорте глюкозы и состоянии активационных фосфорилирований инсулиновой сигнализации. Тем не менее, оценка базальных состояний инсулиновой и mTOR-зависимой сигнализаций показали ассоциацию между уровнями фосфорилирований pAS160-S318 и pSGK-S422 и состоянием углеводного обмена у пациентов: так снижение фосфорилирования pAS160-S318 в сочетании с повышением фосфорилирования pSGK-S422 было ассоциировано с нарушением углеводного обмена и развитием СД 2. Полученные в отчетном году научные результаты свидетельствуют о нарушении функции бежевых адипоцитов при СД 2, а также позволяют выявить биомаркеры диабетических нарушений в подкожной жировой ткани среди участников инсулиновой и mTOR-зависимой сигнализаций. Были обнаружены 7 дифференциально экспрессирующихся микроРНК с уровнем значимости <0,1 после поправки на множественность сравнений. Пять из них имели повышенный уровень экспрессии в группе пациентов СД 2 с ожирением - miR-204-5p, miR125b-5p, miR-125a-5p, miR320a, miR-99b, а две имели повышенный уровень экспрессии в группе пациентов СД 2 без ожирения - miR-23b-3p, and miR197-3p. Эти семь микроРНК нацелены на две группы генов: матричные металлопротеиназы и гены сигнального пути TGFβ. По результатам транскриптомного анализа основное отличие пациентов с СД 2 от НТГ заключалось в регуляции адипогенеза и фиброза матричными металлопротеиназами и сигнальным каскадом SMAD4-RUNX2. Основываясь на данных о транскрипционных профилях обеих групп, мы предположили, что процесс фиброза у пациентов с ожирением и СД 2 более выражен, чем у пациентов с ожирением и НТГ.