Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В течение первого года работы над проектом запланированные работы выполнены в полном объеме. В рамках биологической части отработана методика локального избирательного облучения гиппокампа мышей. В ходе предварительного рассмотрения было принято решение проводить облучение мышей на аппарате «Novalis» (линейный ускоритель электронов с энергией тормозного фотонного излучения 6 Мэв, оснащенный микромноголепестковым коллиматором) («Varian» и «BrainLab»). Была апробирована система фиксации животных во время сканирования на компьютерном томографе и во время облучения. Облучение проводилось в виде одной фракции с дозой 5 Гр. Подведение дозы к гиппокампу осуществлялось с трех конформных статических пучков. Также была отработана методика укладки животных с навигацией по лазерам и при помощи рентгеновской навигации ExacTrac («BrainLab»). При сопоставлении мозга облученных и необлученных мышей были выявлены существенные различия. Однократное краниальное облучение мышей дозой 5 Гр приводило практически к полному прекращению деления клеток в нейрогенных зонах взрослого мозга через 24 ч после воздействия радиации. Подобранный режим облучения может быть в дальнейшем использован для осуществления поведенческих экспериментов. Через неделю после острого подавления деления предшественников нейронов дозой 5 Гр было выявлено его восстановление и реализация нормального нейрогенеза. Данные процессы будут исследованы при более длительном сроке наблюдения. Особенно интересна возможность обнаружения индукции делений стволовых клеток, так как механизмы запускающие деление стволовых клеток в целом малоизвестны. Настоящие экспериментальные условия могут являться уникальными для исследования механизмов деления главных предшественников нейронов – стволовых клеток. В рамках клинического раздела согласно сформулированным критериям были набраны участники основной (пациенты, проходящие лечение в течение работы над проектом) и дополнительной (пациенты, получившие лучевое лечение в предшествующие годы) клинических групп, а также группа здоровых добровольцев. В группы были включены 11, 10 и 30 человек, соответственно. По результатам предварительного сопоставления планов лучевого лечения менингиом хиазмально-селлярной области было выявлено, что при облучении в режиме стандартного фракционирования (длительное лечение в течение нескольких недель, которое применяется при опухолях большего размера) дозовые нагрузки на гиппокамп выше, чем при использовании более коротких режимов (гипофракционирования и радиохиругии). С учетом отсутствия точного представления о феноменологии возможных когнитивных последствий, на первом году было принято решение о преимущественно отборе в клинические группы пациентов с планируемым лечением в режиме стандартного фракционирования. Все отобранные пациенты проходили облучения на аппарате «Novalis». Из 21 пациента обеих клинических групп 20 получали лечение в режиме стандартного фракционирования (29-33 сеанса по 1,8 Гр), и в одном случае проводилось гипофракционированное облучение (5 сеансов по 5,5 Гр). Согласно существующим рекомендациям была отработана методика оконтуривания гиппокампом, что позволило оценивать дозовые нагрузки на структуру. Проводилась оценка дозы в 10%, 30% и 50% объема обоих гиппокампов вместе и по отдельности. Согласно заявленным планам в течение года были отработаны методы оценки когнитивной сферы и функционального состояния головного мозга. Ключевой технологией в данном исследовании стала методика оценки распределения зрительного внимания и состояния памяти в комплексе нейропсихологического тестирования с регистрацией движения глаз (авторская методика «Айтрекинг-Внимание-Память» - АВП). На экране монитора испытуемому предъявлялись наборы картинок с одновременной записью движений глаз испытуемого (айтрекинг). Через определенное время испытуемый должен был назвать изображения по памяти (свободное воспроизведение), а также при последующем просматривании картинок на мониторе отличить ранее виденный стимул от похожего или ранее не виденного. Вторым методом оценки стала электроэнцефалография (ЭЭГ), по результатам которой оценивалась электрическая активность мозга в фоновом режиме и при функциональной нагрузке в виде запоминания изображений методики АВП. В качестве третьей методики использовалась функциональная магниторезонансная томография (фМРТ), которая также оценивала активность при демонстрации картинок для запоминания от методики АВП. У пациентов основной клинической группы перед лучевым лечением проводилось обследование по методике АВП (проведено у всех пациентов), ЭЭГ (проведено у 8 из 11 пациентов), фМРТ (проведена у 8 из 11 пациентов). В конце лучевого лечения запланированные обследование по методике АВП и ЭЭГ выполнены у 8 пациентов (3 еще не закончили лечение). Все 10 пациентов дополнительной группы прошли обследование согласно методике АВП. В группе здоровых добровольцев выполнены следующие обследования: все прошли обследование согласно методике АВП, 10 испытуемых прошли ЭЭГ, из них 8 – фМРТ. При анализе результатов исследований в группе здоровых добровольцев был выявлен ряд закономерностей. Были получены данные, показывающие, как фактор возраста достоверно неспецифически ухудшает результаты свободного воспроизведения у здоровых добровольцев и пациентов старше 50 лет. На ЭЭГ у молодых испытуемых была установлена большая вовлеченность в процессы зрительного внимания и памяти задних, теменно-затылочных отделов мозга. В группе пожилых испытуемых наблюдалось превалирование функциональной активности фронтальных отделов. Ещё одной связанной с возрастом особенностью выполнения методики АВП было сужение объёма зрительного внимания, которое проявлялось в виде ухудшения запоминания изображений, расположенных в боковых областях. В основной клинической группе общее число ошибок узнавания ранее виденных объектов имело тенденцию уменьшаться от начала к концу лечения. Число ошибок различения похожих изображений было несколько большим у ранее облученных пациентов (дополнительная клиническая группа) по сравнению с пациентами которые еще не получили лучевое лечение (основная клиническая группа), что может быть отдаленным эффектом проведенного лечения. Полученные на текущем этапе качественные (локализация) и количественные (объёмы) показатели зон функциональной активации по данным фМРТ свидетельствуют о высокой индивидуальной вариабельности мозгового обеспечения мнестических процессов, вовлечении в процессы запоминания нескольких долей обоих полушарий мозга. Одной из задач дальнейшего исследования будет прослеживание отдалённых последствий лучевой терапии с угнетением функциональной активности гиппокампов в данной группе пациентов. По биологическому и клиническому направлениям работы, подготовлены и сделаны 7 докладов на отечественных и международных конгрессах, опубликованы 3 тезисов, 1 статья в сборнике конференции, подана на рецензию 1 статья на английском языке в сборник материалов международного конгресса по медицинской информатике MIE 2018.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Клиническая часть проекта была посвящена исследованиям больных основной группы в третьей (через 6 месяцев после окончания лучевого лечения) и четвёртой (через 12 месяцев после окончания лечения) временных точках, больных дополнительной клинической группы и здоровых испытуемых. В исследованиях использована методика АВП, включавшая регистрацию движений глаз испытуемых в заданиях на зрительное внимание и память, ЭЭГ и фМРТ с блоковой парадигмой, а также в режиме исследования нейрональных сетей покоя. Была создана пополняемая база данных, в которой, в частности, для каждого пациента основной клинической группы мы сохраняли структурные характеристики мозга и объемного образования, электрофизиологические данные, данные фМРТ и когнитивных тестов в разных временных точках после лучевого воздействия. Не было выявлено статистически значимой взаимосвязи между топографо-анатомическими характеристиками опухоли и прилежащих структур и показателями свободного воспроизведения и узнавания (p > 0,05) объектов. Таким образом, нельзя исключить взаимосвязь когнитивных изменений у пациентов при продольном наблюдении с непосредственным радиационным воздействием на мозг. У больных с менингиомами хиазмально-селлярной области свободное воспроизведение стимулов, расположенных в правом поле зрения, было хуже, чем расположенных в левом поле зрения (р=0,038). А при узнавании стимулов феноменология когнитивных изменений, напротив, выраженно ассоциировалась с левым полем зрения, в котором узнавание у больных было значимо хуже, чем свободное воспроизведение у них же (р=0,020), и чем узнавание у здоровых испытуемых (р=0,022). Аналогичных эффектов у здоровых испытуемых выявлено не было. Данные айтрекинга при выполнении методики АВП позволили выделить эффективные и неэффективные стратегии рассматривания стимулов. Хорошо сгруппированные в важных смысловых частях изображений зрительные фиксации (цепкий, пристальный взгляд), как правило, приводили к успешному воспроизведению и узнаванию стимулов. Напротив, большое количество поисковых движений глаз, остановки взора на пустых местах экспозиции с высокой вероятностью приводили к неполному запечатлению стимулов, вплоть до игнорирования периферийной визуальной информации. В старшей возрастной группе выявлено сужение объёма зрительного внимания: точно запоминался только центральный стимул триплета. Эффективные стратегии рассматривания в старшей возрастной группе присутствовали лишь в центре зрительного поля. При этом узнавание центрального стимула осуществлялось так же, как у молодых испытуемых. Узнавание же латеральных стимулов у пожилых здоровых испытуемых было значимо хуже, чем в молодой выборке. Непроизвольно формирующиеся стратегии распределения зрительного внимания, регистрируемые уже в фазе глазодвигательной активности субъекта, могут отражать компенсаторные (адаптивные) процессы функционирования мозга при нормальном старении. Изменение когерентности ЭЭГ по диапазонам физиологических ритмов у молодых испытуемых (запоминание в методике АВП в сравнении с фоном) характеризовалось вовлечением активирующей системы мозга и возрастанием межполушарных связей. В той же ситуации, у пожилых испытуемых запоминание обеспечивалось усилением когерентности в лобных отделах мозга, активацией альфа-ритма в задних отделах правого полушария и минимальными межполушарными связями. Данные ЭЭГ позволили выдвинуть гипотезу о необходимости более высокой степени произвольного контроля у пожилых испытуемых по сравнению с молодыми, об изменении стратегии непосредственного запечатления стимулов, присутствующей у молодых испытуемых, стратегией категоризации и опосредования стимулов через ассоциативный процесс. У хорошо запоминавших стимулы испытуемых наблюлалось усиление когерентности межполушарных связей, особенно на низких частотах, и диффузное снижение когерентности ЭЭГ в тета-диапазоне, акцентированное в правом полушарии. У испытуемых с плохим запоминанием стимулов наблюдалась гиперсинхронизация в альфа-диапазоне в теменно-височно-затылочных отделах правого полушария и исчезновением межполушарных связей на низких частотах. По сравнению со здоровыми испытуемыми, у больных запоминание визуальных стимулов сопровождалось усилением внутриполушарной синхронизации (более выраженной в правом полушарии) и редукцией межполушарной реактивности. Анализ височных КогЭЭГ тета-диапазона как вероятных маркеров активности гиппокампа выявил их достоверное межполушарное ослабление у больных основной группы по сравнению со здоровыми испытуемыми. При анализе индивидуальных результатов фМРТ были выявлены зоны активации на низких значениях порога без применения фильтра массовых сравнений. При этом в 70% случаев в динамике (от первой точки к третьей) совпадения локализации участков активации, индивидуально, у каждого больного, выявлено не было. В целом по группе распределение локусов активности мозга во время запоминания стимулов соответствовало фрагментам нейрональных сетей покоя. В большей степени локусы активности напоминали сеть DMN. Полученные данные привели к изменению нашего протокола исследования в части, касающейся записи фМРТ. Особенности распределения зрительного внимания при возникновении специфической ошибки «pattern separation» были проанализированы для стимула, у которого центральная область не содержала смыслоразличительных элементов, а периферическая (окаймляющая) была характерной - у испытуемых младшей (моложе 50 лет) и старшей (50 и более лет) возрастных групп. У всех испытуемых, допустивших ошибки «pattern separation» в тесте на узнавание, независимо от возраста, зрительное внимание было сконцентрировано на неспецифической центральной области, и практически не распространялось на периферическую. В целом, в старшей возрастной группе, в отличие младшей, наблюдалось смещение фокуса внимания с периферической части исследуемого стимула на центральную (p < 0,05), что также сопровождалось и большим процентом ошибок «pattern separation» в тесте на узнавание (p < 0,05). Наши результаты согласуются с гипотезой об особенностях распределения зрительного внимания, предшествующих возникновению ошибок «pattern separation», а также с гипотезой о различиях в пространственном распределении зрительного внимания у здоровых испытуемых разных возрастных категорий. В рамках биологической части проекта были исследованы эффекты краниального облучения на нейрогенез в гиппокампе и поведение взрослых мышей. В ходе этих экспериментов было показано, что облучение головы мышей 5 Гр рентгеновского излучения через сутки приводит к гибели практически всех созревающих нейронов, число которых не восстанавливается через неделю, и даже через 3 мес после облучения. Хотя через неделю после радиационного воздействия наблюдались признаки восстановления деления клеток-предшественников, их пролиферация в гиппокампе через 3 мес все равно была практически полностью подавлена. Полученные данные свидетельствуют либо о сложной динамике восстановления нейрогенной ниши гиппокампа после краниального облучения рентгеновским излучением в дозе 5 Гр, либо об отсутствии ее регенерации как таковой, по крайней мере до 3 мес срока. Также была проведена апробация двух поведенческих моделей различения схожих паттернов у животных: (1) основанной на распознавании нового объекта и (2) основанной на распознавания нового местоположения объекта, или т.н. модели объектного разделения паттернов. Данные модели были описаны сравнительно недавно и были максимально приближены к дизайну эксперимента, проводимого на людях. К сожалению, обе модели оказались недостаточно чувствительными для того, чтобы зарегистрировать у животных различение схожего объекта или местоположения, и, возможно, данные методы требуют гораздо большей экспериментальной выборки, что сделает их крайне трудоемкими. В качестве неожиданного результата, у животных, облученных 3х5 Гр, по сравнению с контрольными животными и облученными однократно 5 Гр, была выявлена гиперактивность, связанная с помещением их в новую обстановку и исчезающая у них, в случае, когда обстановка становится знакомой.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
КЛИНИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ПРОЕКТА В течение третьего (2019) года Проекта в клинической части было продолжено динамическое наблюдение за больными основной группы. На момент написания отчета 27 пациентов основной группы прошли исследования в первой (до начала лучевого лечения) и второй (после окончания терапии) точках наблюдения. Из них 24 человека были обследованы в трёх точках (третья точка - через 6 месяцев после лечения), 17 человек были обследованы в четырёх точках (четвертая точка – через 12 месяцев после окончания лечения), 7 человек – в пяти точках (пятая точка – через 24 месяца после лучевой терапии). Дополнительную группу (катамнез) составили 27 человек с однократным исследованием в разные сроки (до 11 лет) после лечения. Комплексные исследования пациентов в основной и дополнительной группах проводили по утверждённому протоколу, при этом блоковая парадигма фМРТ была заменена исследованием фМРТ-покоя (resting-state fMRI) с целью изучения сетей покоя и функциональной включенности в них гиппокампа до и после латерализованного воздействия радиации (обоснование замены представлено в отчете о выполнении проекта за 2018 год). Ключевой технологией являлась методика оценки распределения зрительного внимания и состояния памяти в комплексе нейропсихологического тестирования с регистрацией движения глаз (авторская методика «Айтрекинг-Внимание-Память» - АВП), а в рамках данной методики - генерация ошибок pattern separation, гипотетически (по литературным данным) связываемая со снижением функционального состояния гиппокампа. Сопоставлялись данные в двух подгруппах основной группы – с левосторонним и с правосторонним расположением опухоли. Базовые, в том числе клинические характеристики (возраст, пол, уровень образования, доминантность полушария, средний объем опухоли, средние объемы гиппокампов, механическое воздействие опухоли на височную долю, гиппокамп и ствол мозга, нарушения зрения и глазодвигательные расстройства) у пациентов двух этих подгрупп оказались сопоставимы. Лучевая нагрузка на гиппокамп и мягкие ткани при проведении лучевого лечения в группах левостороннего и правостороннего расположения опухоли также значимо не различались. Результаты методики АВП показали, что у больных с правосторонним расположением опухоли от первого ко второму исследованию значимо возросло число ошибок узнавания в левом поле зрения. Причем подавляющее число ошибок при узнавании было связано с ошибками по типу трудностей дифференциации признаков (pattern separation disturbances), когда похожий рисунок опознавался не похожим, а идентичным с запоминавшимся. Однако противоположная тенденция наблюдалась в отношении расположенных справа стимулов. Их узнавание улучшилось, т.е. при узнавании стимулов у больных с правосторонним расположением опухоли наблюдалась разнонаправленная динамика: ухудшение узнавания в левой части зрительного поля и улучшение – в правой. У больных с левосторонним расположением опухоли каких-либо статистически значимых изменений узнавания стимульного материала от первого ко второму исследованию ни в левой, ни в правой частях триплета не наблюдалось. Контрольная группа здоровых испытуемых, дважды участвовавших в той же экспериментальной процедуре, каких-либо изменений в показателях тестов не продемонстрировала. Данные айтрекинга показали, что нарастание ошибок pattern separation в контрлатеральной патологическому процессу части триплета напрямую не связано ни с продолжительностью зрительных фиксаций в этой области, ни с глазодвигательными нарушениями. Кроме того, разработка магистральной гипотезы поддерживалась многочисленными заданиями нейропсихологического и психофизиологического тестирования. Все они прошли обработку для первых двух точек наблюдения и продемонстрировали, что в первой точке наблюдения полушарная специфичность в распределении ошибок выглядит отчетливо, но во второй и последующих точках – постепенно нивелируется. Запись ЭЭГ, сопровождавшая процесс запоминания в Методике АВП, позволила установить, что по сравнению с состоянием покоя с открытыми глазами, состояние запоминания зрительно предъявляемых стимулов у здоровых испытуемых характеризуется генерализованным ослаблением когерентности ЭЭГ, наиболее выраженно – в тета и альфа1 полосах. Параллельно наблюдаются изменения альфа 3 и бета 1 ритмах в лобных областях. Когерентности во всех поддиапазонах альфа ритма более выраженно изменяются у здоровых испытуемых в лобно-височных отделах правого полушария. Полученные данные можно рассматривать в качестве эталонных для процесса активизации зрительного запечатления, поскольку литературные данные для аналогичных задач отсутствуют. У пациентов основной группы в первой точке исследований переход от состояния покоя с открытыми глазами к состоянию зрительного запечатления стимулов характеризовался «обеднённостью» перестроек когерентностей ЭЭГ по сравнению со здоровыми испытуемыми: меньшим числом реактивных связей, особенно межполушарных, более слабым откликом лобных отделов. В третьей точке наблюдения реактивность мозга при переходе от состояния покоя к состоянию зрительного запоминания начинает приближаться к нормативным показателям, причем тенденция к нормализации когерентных связей, сопровождающих состояние зрительного запечатления, наиболее выраженно проявляется у пациентов с левосторонним расположением опухоли. Результаты анализа фМРТ – покоя у здоровых людей показали, что в заданной сети покоя коннективность присутствовала практически между всеми областями при максимальных значениях высокодостоверных связей между симметричными областями зрительной коры, медиальными отделами лобных областей, правым и левым гиппокампом. Большее число функциональных связей формировалось с передними областями левого полушария. фМРТ покоя у пациентов с левосторонним расположением опухолей в первой точке наблюдения характеризовалась редуцированными (наиболее отчетливо в передних отделах) межполушарными связями и практически отсутствующими межгиппокампальными связями. «Обеднённость» коннективных связей была более выражена в правом полушарии. фМРТ покоя у пациентов с правосторонним расположением патологического процесса в первой точке наблюдения также, как и у пациентов с левосторонним расположением опухоли, характеризовалась отсутствием межгиппокампальных связей и обеднённостью коннективности передних отделов мозга. В этой группе были усилены по сравнению с нормой межтеменные связи и редуцированы функциональные связи левого полушария. Особенности топографии фМРТ коннективности покоя коррелируют с особенностями функциональной реактивности когерентных связей ЭЭГ и подтверждают тенденции, выявленные в когнитивной сфере пациентов. В исследовании продемонстрирована возможность обнаружить специфические изменения когнитивной сферы, потенциально являющиеся следствием проводимого ранее лучевого лечения, с помощью целенаправленного применения специально разработанных методик и мультимодальной оценки наблюдаемых эффектов (данные нейропсихологического тестирования, айтрекинга, ЭЭГ, фМРТ). БИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ПРОЕКТА На заключительном этапе проекта были исследованы эффекты краниального облучения в дозе 5 Гр на деление клеток и нейрогенез в гиппокампе на отставленные сроки – 7 дней и 3 мес. Анализ проводили при помощи тройного нуклеотидного мечения, а также маркирования молодых нейронов. Через 7 дней после облучения популяции как стволовых, так и дочерних клеток-предшественников восстанавливали способность к делениям, поскольку различий между контролем и облученными животными по числу делящихся клеток выявлено не было. Оценка доли повторно делящихся стволовых и дочерних клеток также не выявила различий между облученными и необлученными животными. Несмотря на восстановление процессов деления клеток-предшественников, продукция самих новых нейронов через 7 суток после облучения восстановлена не была. Аналогичные результаты были получены через 3 мес после облучения. Таким образом, после краниального облучения в дозе 5 Гр происходит достаточно раннее восстановление пула делящихся клеток, однако при этом развивается длительная блокада нейрогенеза. Объяснение механизмов такого неполного восстановления требует дополнительных экспериментов. Также были исследованы эффекты краниального облучения в дозе 25 Гр на поведение взрослых мышей. Через месяц после облучения у облученных животных не было выявлено эффектов в тестах на общую активность и тревожность. Через 3 мес после воздействия облученные мыши отставали в обучении от контрольной группы в пространственной версии лабиринта Морриса. Тем не менее, при переучивании мышей в реверсивной версии лабиринта и в версии с маячками и распознаванием схожих задач облученные животные не отличались от контрольных. Через год после облучения дозой 25 Гр наблюдались более выраженные отставания как во время обучения в пространственной версии лабиринта Морриса, так и во время переучивания в реверсивной версии. В версии с маячками облученные мыши отставали от контрольных только в первый день переучивания. Выраженность эффектов через год после облучения могла быть связана с накладыванием действия радиации на естественное старение мышей. Таким образом, краниальное облучение терапевтическими дозами радиации имеет выраженный отсроченный эффект на пространственное обучение и когнитивную гибкость мышей, однако, отсутствие выраженных эффектов в моделях, когда новое обучение интерферирует с предыдущим, на фоне сниженного нейрогенеза, указывает на то, что изменения в поведении скорей всего связаны с иными, чем нарушенный нейрогенез причинами. Наконец, была разработана и апробирована поведенческая модель для оценки когнитивной гибкости животных на основе автоматизированной системы мониторинга поведения животных IntelliCage. Животные в условиях ограничения доступа к воде в питьевых устройствах, эффективно меняли структуру поведенческих актов в зависимости от наложенных ограничений для достижения основной цели – удовлетворения суточной потребности в получении воды. Животные также демонстрировали успешную динамику пространственного обучения и переучивания, что позволяет использовать в дальнейшем разработанную модель для оценки эффектов радиации на поведение.