Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Ишемическая болезнь коронарных артерий, ИБС, стабильно является одной из ведущих причин смерти в мире. Внутрисосудистая имплантация металлических и полимерных стентов позволила увеличитить продолжительность жизни пациентов с обструктивными формами этого заболевания. При этом, молекулярно-клеточные события в зоне стента развиваются таким образом, что часто приводят к развитию неоатеросклероза, рестенозу и тромбозу. Моноциты-макрофаги (МН-МФ) играют ключевую роль в развитии атеросклеротической бляшки на фоне хронической гиперхолестеролемии (ГХс) при ИБС. ГХс рассматривается как эпигенетический фактор, который может определять репрограммирование миелоидных предшественников МН, процессы дифференцировки в сосудистом русле и функциональные фенотипы МН-МФ в тканях и, в частности, в сосудистой стенке. Маркерами этих эпигенетических перестроек могут быть изменения в антигенном спектре циркулирующих МН (Rothe et al., 1996; Ziegler-Heitbrock et al., 2010; Maharaj et al., 2017; Guła et al., 2017; Urbanski et al., 2017). По уровню экспрессии определенных антигенов циркулирующие МН при атеросклерозе делят на несколько субпопуляций. Например, в соответствии с номенклатурой Weber (2016) выделяют 3 субпопуляции МН (классические МН CD14++CD16–; промежуточные МН CD14++CD16+; неклассические МН CD14+CD16++). При этом использование других поверхностных АГ позволяет «разделить» циркулирующие МН на большее количество субпопуляций (Rothe et al., 1996). Цитологический анализ клеточной популяции МН выявляет еще более высокий уровень гетерогенности: в наших исследованиях на цитологических препаратах было выделено 9 размерных классов – 9 субпопуляций, которые различались по размерам, морфологическим особенностям, активности гистохимических реакций. В ступенчатом градиенте перколла исходная популяция МН была разделена на 6 субпопуляций, различающихся по плавучей плотности. Выделенные субпопуляции характеризовалась определенными цитологическими особенностями (размеры клеток, морфология ядра, степень развития мембранных систем) и специфическим уровнем экспрессии СD64 (Fcγ1-рецептор) и CD11b (c3bi-рецептор), соотношением экспрессии СD64/CD11b, характером распределения АГ на поверхности мембраны. В исследовании выявлено, что на фоне длительной ГХс у больных ИБС субпопуляционная структура циркулирующих МН подвергается значительным перестройкам, которые выражаются в изменении количественных соотношений между различными популяциями, активности экспрессии СD64 и CD11b. На системном уровне эти перестройки реализуются в изменении динамики адгезии МН на культуральном пластике, увеличении эффективности трансформации МН в липид-нагруженные МФ (при воздейтвии иммунных комплексов, ИК) у больных ИБС, по сравнению с МН здоровых доноров. Увеличение эффективности трансформации МН в липид-нагруженные МФ может быть связано с выявленным увеличением активности экспрессии CD11b на МН больных ИБС. Известно, что CD11b-сигналинг связан с процессами М1- поляризации и трансформации МН в пенистые клетки, и ГХс приводит к увеличению уровня экспрессии CD11b уже на уровне миелоидных предшественников. Выявлено, что увеличение активности экспрессии CD11b, эффективности трансформации в липид-нагруженные МФ у больных ИБС сопровождалось снижением активности аденилат-циклазной системы: базальный и индуцированный ИК уровень цАМФ в МН-МФ больных ИБС был значительно ниже, чем в МН-Мф здоровых доноров. Полученные результаты позволяют предполагать, что в условиях длительной ГХ эпигенетическое репрограммирование систем аденилат-циклазного сигналинга может активировать процессы трансформации МН в липиднагруженные МФ. Целенаправленная функционализация поверхности сосудистого стента позволит не только ускорить процессы локальной реэндотелиализации, но и сформировать определенные фукнциональные клеточные фенотипы, которые не позволят реализоваться последовательности молекулярно-клеточных событий, приводящих к развитию ре-стеноза. Для целей разработки персонифицированного экспресс-скрининга материалов для использования в сердечно-сосудистой хирургии в качестве стентов, а также их покрытий, в рамках проекта синтезированы и исследованы пять типов биоразрушаемых материалов, из группы микробных полигидроксиалканоатов, ПГА, различных мономерных составов. Все типы материалов обладали удовлетворительной биосовместимостью и имели индивидуальный рельеф поверхности, что обусловлено включением определенных мономеров. Проанализировано влияние нано-рельефа поверхности бионаноматериалов ПГА, на соотношение морфотопов МН-МФ у пациентов с ИБС, подлежащих мини-инвазивному лечению ишемии миокарда, и получающих стандартную терапию. Отмечено различие в количественных соотношениях морфотипов Мн-Мф до и после процедуры стентирования. В результате исследований установлено, что специфические соотношения морфотипов МФ адекватно отражают особенности взаимодействия поверхностного рельефа и функционального фенотипа клеток in vitro.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Было показано, что на поверхности пленок сополимеров на основе полигидроксиалканоатов бактериального происхождения, формируется микро-наноразмерный рельеф. Вариабельность поверхностного рельефа (соотношение микро- и нанопаттернов, значения Ra и Rq) зависела от качественного и количественного состава сополимеров. По результатам МТТ теста (оценка жизнеспособности клеток) для изучения нерецепторных эффектов поверхностного рельефа было выбрано 5 вариантов биополимерных подложек. Изучение нерецепторных эффектов на уровне клеточной морфологии показало, что соотношение морфологических классов в популяции МН-МФ (моноциты-макрофаги) на 6-е сутки культивирования значительно варьировало в зависимости от особенностей поверхностной топографии биополимерных подложек. Эта вариабельность существенно отличалась для МН-МФ полученных «до и после стентирования». Для варианта «до стентирования» численность удлиненных клеток (подвижные формы) на низких рельефах была выше, чем на более высоких рельефах. Для варианта «после стентирования» выявлялась совершенно иная зависимость (∩-образная) между величиной Rq и численностью подвижных клеток. Численность многоядерных МФ, которые формируются в результате слияния клеток, снижалась на высоких рельефах (с увеличением Rq) и это снижение было выражено в значительно большей степени для варианта «после стентирования». Это позволяет предполагать, что подложки с высоким рельефом более устойчивы к биодеградации. Особенности поверхностной топографии влияли и на активность внутриклеточного накопления липидов: численность липид-нагруженных МФ – ПК (пенистые клетки) с большим количеством ЛК (липидные комплексы) в цитоплазме. ПК наблюдались в морфологическом классе округлых неподвижных клеток (одноядерных и многоядерных), и в различных морфотипах подвижных удлиненных клеток. Численность субпопуляции ПК с очень высоким содержанием ЛК значительно варьировала на подложках с различным профилем поверхности и эта вариабельность изменялась «после стентирования». Дополнительная наноструктуризация поверхностного рельефа биополимерных подложек (кратковременная обработка щелочью) модифицировала нерецепторные эффекты. На модифицированных подложках увеличивалась активность слияния клеток: формировались огромные синцитии из большого количества клеток. Это позволяет предполагать, что увеличение относительного содержания нанопаттернов в поверхностном рельефе повышает активность биодеградации. На модифицированных поверхностных рельефах уменьшалась численность подвижных клеток (морфологический класс удлиненных клеток) и численность субпопуляции ПК с очень высоким содержанием ЛК (в 2-7 раз), по сравнению с немодифицированными рельефами. Нерецепторные эффекты модифицированных подложек варьировали в зависимости от типа подложки и варианта «до стентирования» и «после стентирования». Эффекты ИК (иммунные комплексы) и АцЛНП (ацетилированные липопротеиды низкой плотности) на процессы трансформации МФ в ПК были неоднозначными. На культуральном пластике внесение ИК и АцЛНП приводило к дополнительному увеличению численности ПК с высоким содержанием ЛК на 9-е сутки культивирования только в варианте «до стентирования». На биополимерных подложках 1 и 4 численность этой субпопуляции ПК после внесения ИК и АцЛНП снижалась в вариантах «до и после стентирования», по сравнению с соответствующими контролями (культивирование на чистой среде DMEM). Этот феномен может быть связан с появлением в популяции МН-МФ клеток, от поверхности которых отделяются везикулы разного размера. Такие везикулы формируют и ПК, у которых в состав везикул включаются ЛК. Возможно, что нерецепторные эффекты поверхностного рельефа реализуются в активации обратного транспорта липидов при внесении агентов, которые в общепринятых модельных системах индуцируют увеличение численности ПК. Анализ содержания цитокинов в культуральном фильтрате (6-е сутки культивирования) показал, что уровень ИЛ-6 (маркер М1-поляризации) значительно превышал уровень ИЛ-10 (маркер М2-поляризации). Уровень ИЛ-10 был одинаковым при культивировании на различных подложках для вариантов «до стентирования» и «после стентирования». Вариабельность содержания ИЛ-6 зависела от типа подложки и варианта «до стентирования» и «после стентирования». При этом активность продукции ИЛ-6 значительно возрастала «после стентирования» на всех типах подложек, по сравнению с вариантом «до стентирования». На 6-е сутки культивирования содержание ЛТВ4 (лейкотриены группы В4) и ПГЕ2 (простагландины группы Е2), сАМФ (циклические АМФ), активность индуцибельной NO-синтазы были одинаковыми «до и после стентирования» для всех вариантов подложек. Внесение ИК приводило к значительному увеличению продукции ПГЕ2 и ЛТВ4 на всех подложках в вариантах «до и после стентирования» (по сравнению с соответствующими контролями, культивирование на чистой среде DMEM). Но при этом после внесения ИК содержание ПГЕ2 и ЛТВ4 было одинаковым для всех вариантов подложек «до и после стентирования». Содержание ФНО (фактор некроза опухолей), ИЛ-6, ИЛ-10, сАМФ после внесения ИК было низким и достоверной вариабельности для различных подложек не наблюдалось. Комбинированное воздействие ИК и Эверолимуса не влияло на содержание цитокинов и сАМФ, по сравнению с вариантом, когда в среду вносили только ИК. Единственным биохимическим параметром, для которого был показан высокий уровень вариабельности для различных поверхностных рельефов в различных условиях культивирования (внесение ИК, комбинированное внесение ИК+Эверолимус), была активность включения BrdU, параметр, по которому оценивали активность индуцированной пролиферации МФ. Отсутствие вариабельности большинства исследованных биохимических параметров для различных типов подложек может быть связано с высоким уровнем морфологической гетерогенности популяции МН-МФ на 6- и 9 сутки культивирования: клетки различались по степени плоидности, содержанию ЛК, подвижности. Наличие множества морфологических субпопуляций определяет существование многочисленных морфо-функциональных клеточных фенотипов МФ. Так, степень элонгации клеток (морфотипы веретеновидных, палочковидных и нитевидных клеток) определяет силы натяжения в системе цитоскелета и деформации (уплощение и вытягивание в длину) ядра. Известно, что деформации клеточного ядра индуцируют перестройки эпигенома через системы механо-химического сигналинга. Выбранные биохимические методы «усредняют» функциональную активность разнообразных эпигеномных вариантов МФ. Это определяет более высокую значимость вариабельности морфологических параметров в скрининге нерецепторных эффектов поверхностных рельефов. Для дальнейшего анализа будет обосновано определение активности белков/факторов, связанных с изменениями в структуре цитоскелета моноцитов-макрофагов.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Морфологический анализ эритроцитов в различных вариантах кратковременного культивирования invitro выявил следующие закономерности. 1. Эритроциты пациентов с атеросклерозом были нестабильны в системе invitro: на 3-и сутки культивирования в среде DMEM и в аутологичной плазме на культуральном пластике и на различных ПГА-подложках нормоциты, классические двояковогнутые эритроциты, либо отсутствовали, либо их численность составляла несколько процентов. 2. На культуральном пластике в среде DMEM и в аутологичной плазме, до и после стентирования наблюдались 4 аномальных морфотипа: эхиноциты, акантоциты, плоские эритроциты, эритроциты с везикулами. 3. На немодифицированных подложках на среде DMEM и в аутологичной плазме, до и после стентирования, наблюдались те же самые аномальные морфотипы: эхиноциты, акантоциты, плоские эритроциты, эритроциты с везикулами. 4. На модифицированных подложках на среде DMEM и в аутологичной плазме, до и после стентирования, наряду с вышеупомянутыми 4-мя морфотипами наблюдался 5-й аномальный морфотип – стоматоциты. 5. При культивировании в среде DMEM, до и после стентирования, на исследованных ПГА-подложках (немодифицированные и модифицированные варианты) численность эритроцитов с везикулами была значительно выше, чем на культуральном пластике в тех же самых условиях культивирования. Это свидельствует о влиянии поверхностного рельефа исследованных ПГА-подложек на активность образования микровезикул на мембране эритроцитов (активации этого процесса). 5. При культивировании в аутологичной плазме, до и после стентирования, на исследованных ПГА-подложках (немодифицированные и модифицированные варианты) численность эритроцитов с везикулами достоверно не отличалась от варианта на культуральном пластике в тех же самых условиях культивирования. Это свидетельствует об отсутствии влияния поверхностного рельефа исследованных ПГА-подложек на активность образования микровезикул на мембране эритроцитов в аутологичной плазме. 6. Вариабельность количественных соотношений различных аномальных морфотипов эритроцитов зависела от: - функционального статуса выделенных эритроцитов (до или после стентирования); - среды культивирования (DMEM или аутологичная плазма крови); - соотношения нано- и микропаттернов в составе поверхностного рельефа немодифицированных и модифицированных ПГА-подложек. Полученные результаты позволяют рассматривать эритроциты в кратковременной культуре invitro как очень чувствительную модельную систему для изучения мембранотропных эффектов поверхностных рельефов ПГА-пленок. Морфологический анализ тромбоцитов в различных вариантах кратковременного культивирования invitro выявил следующие закономерности. 1. Особенности поверхностного рельефа ПГА-подложек определяют вариабельность активности адгезии тромбоцитов, количества и размеров агрегатов, активности слияния агрегированных тромбоцитов в синцитии. 2. Дополнительная наноструктуризация поверхностного рельефа модифицирует биологическую активность ПГА-подложек: их адгезивность для тромбоцитов значительно возрастает, по сравнению с немодифицированными рельефами. 3. Биологическая активность поверхностного рельефа invitro не является «однозначным» внутренним свойством самого рельефа, но может значительно варьировать в зависимости от исходного функционального состояния тромбоцитов (до и после стентирования) и наличия паракринного сигналинга (ко-культивирование с эритроцитами). Для оценки функционального состояния эритроцитов и тромбоцитов в различных условиях культивирования на ПГА-подложках использовали МТТ-тест. Было показано, что: 1. Активность восстановления МТТ в эритроцитах и тромбоцитах варьирует в зависимости от особенностей поверхностного рельефа. Характер этой вариабельности существенно различается для вариантов до и после стентирования. 2. Увеличение активности восстановления МТТ свидетельствует о включении элементов поверхностного рельефа в индукцию окислительного стресса в эритроцитах и тромбоцитах. Было показано, что эндотелиальные клетки пуповинной вены не пролиферируют на подложках из немодифицированных и модифицированных ПГА-пленок: активность включения BrdU в вариантах на подложках была очень низкой (на уровне фонового неспецифического связывания).