Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Первый этап исследований был посвящен разработке методических подходов для комплексного анализа функционального изменений, происходящих в зоне фокальной ишемии в соматосенсорной коре с целью последующего использования этой экспериментальной системы для скрининга нейропротекторов при их эпипиальной аппликации. С этой целью нами были решены следующие залачи: (1) Разработаны и внедрены методики для широкополосной регистрации электрических сигналов с использованием многоканальных электродов на силиконовой подложке и регистрации внутренних оптических сигналов во время ишемической деполяризации и волн распространяющейся депресии. В частности, была разработана оригинальная методика электрофизиологической регистрации сверхмедленных процессов, которые характеризуют развитие ишемического повреждения, с использованием многоканальных электродов на силиконовой подложке. Эти методики были успешно апробированы на моделях аноксической деполяризации в соматосенсорной коре ин витро, распространяющейся депрессии, вызываемой повышенным калием и травматическим повреждением мозга ин виво, и при фокальной ишемии в соматосенсорной коре ин виво. (2) Охарактеризована фармакокинетика проникновения веществ в глубину коры головного мозга при их эпипиальной аппликации с использованием в качестве эталона блокаторов ионотропных рецепторов глутамата CNQX/APV и блокатора потенциалозависимых натриевых каналов лидокаина. Концентрационный и кинетический анализ блокирующего эффекта этих веществ после эпипиальной аппликации на спонтанную и сенсорно-вызванную активность в различных слоях соматосенсорной коры позволил определить время проникновения веществ и поправочные концентрационные коэффициенты, которые следует использовать при эпипиальной аппликации веществ для создания их эффективной концентрации внутри соматосенсорной коры. Эта информация является необходимой для скрининга нейропротекторов при их эпипиальной аппликации. (3) Внедрена модель фокальной ишемии в соматосенсорной коре, вызываемой путем эпипиальной апликацией вазоконстриктора эндотелина-1. С использованием электрофизиологической широкополосной многоканальной регистрации локальных полевых потенциалов и имаджинга внутренних оптических сигналов было охарактеризовано развитие функциональных изменений в соматосенсорной коре во время острой фазы локального ишемического инсульта, вызваемого эндотелином-1. В частности, показано двухфазное развитие ишемического ответа, с компенсаторным торможением активности нейронов во время первой фазы и последующий переход в фазу декомпенсации, предвестником которой является кратковременная вспышка активности, организованная в сетевые гамма осцилляции, и следующая за ней волна распространяющейся депрессии и сверхмедленный негативный сдвиг внеклеточного потенциала. Также показано необратимое подавление спонтанной и сенсорно-вызванной активности нейронов коры во время фазы декомпенсации и после отмывки эндотелина-1. Вместе с тем, приведены доказательства того, что таламокортикальные аксоны сохраняют свою функциональную активность в зоне ишемического поражения. Также с использованием имаджинга внутренних оптических сигналов показано развитие ишемического поражения в горизонтальной плоскости соматосенсорной коры с возникновением зоны ишемического очага и его расширением, посредством волн распространяющейся депрессии, в окружающей пенумбре. В совокупности, нами была в полной мере создана методическая база для электрофизиологического и имаджингового исследования ишемического поражения соматосенсорной коры при фокальной ишемии. Дальнейшие исследования будут направлены на апробацию и дальнейшее совершенствование этой модели.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Второй этап проекта был посвящен исследованию эффектов веществ, которые обладают нейропротекторными эффектами при ишемическом поражении мозга, в том числе блокатора НМДА подтипа рецепторов глутамата dAPVи хелатора активных форм кислорода Ацетилцистеина (N-ацетил-L-цистеин, NAC) на разработанной нами во время первого этапа проекта модели фокальной ишемии коры головного мозга крыс, вызываемой эпипиальной аппликацией вазоконстриктора эндотелина-1 с учетом фармакодинамики проникновения веществ внутрь коры при их эпипиальной аппликации. Было обнаружено, что оба агента уменьшают функциональные и гистологические нарушения, вызываемые эндотелином-1. В рамках этой задачи в качестве экспериментов сравнения нами также были охарактеризованы эффекты эпипиальной аппликации dAPV в контрольных нормоксических условиях, и была обнаружена критическая роль НМДА рецепторов в генерации поздней части соматосенсорно-вызванных ответов. Нами были также проведены исследования по использованию оптогенетических подходов для характеристики фукнциональных наружений в коре головного мозга при ишемическом поражении. Используя трангенных животных, в нейроны которых был встроен светочувствительный ионный канал Хронос, нами было выявлена диссоциация между подавлением сенсорных ответов и устойчивостью ответов, опосредованных оптостимуляцией, в участках ишемической пенубры в модели фокальной ишемии головного мозга, вызываемой эпипиальной аппликацией ЭТ-1. Данная диссоциация свидетельствует о значительном подавлении синаптической передачи, но с сохранением мембранного потенциала нейронами в зоне пенумбры, а также указывает на информативность данного подхода для определения зон некроза и пенумбры. В части проекта, посвященной функциональным проявлениям ишемического поражения соматосенсорной коры в модели кислородно-глюкозной депривации (КГД) на срезах коры головного мозга ин витро нами были исследованы возрастные изменения в ишемических ответах с помощью электрофизиологических и имаджинговых подходов. Было выявлено, что наряду с более длительной временной задержкой в возникновении аноксической деполяризации (АД) у новорожденных животных, амплитуда АД была значительно меньше, а увеличение светопроницаемости во время АД было намного больше у новорожденных животных. Также внутренние оптические сигналы у новорожденных животных демонстрировали 2 фазы, первая из которых соответствовала электрофизиологической распространяющейся депрессии (РД), а вторая соответствовала собственно АД. Это свидетельствует о том, что в отличие от взрослых животных, у которых РД и АД наступают одновременно, у новорожденных животных эти два процесса разобщены во времени. В дополнение к этим запланированным исследованиям по возрастной зависимости ишемического ответа в срезах мозга, в ходе этих работ нами был довольно неожиданно обнаружен очень яркий феномен перемещения тканевой массы и расширения объема срезов вследствие АД. Было обнаружено, что непосредственно после возникновения АД границы среза начиинают расширяться, а поверхность среза начинает смещаться вверх, что отражает увеличение объема среза за счет отека. Динамика развития этого постишемического отека была оценена нами как 1% увеличения объема в минуту. Более того, обработка отекших срезов гиперосмолярным раствором (что наиболее часто используется для лечения постишемического отека мозга в клинике) частично снимала постишемический отек среза ин витро. Описанные нами постишемические изменения объема среза имеют много общего с развитием ишемического отека мозга и в перспективе данная модель может стать перспективной для исследования механизмов ишемического отека мозга и для оценки терапевтического потенциала противоотечных препаратов. Наконец, нами были исследованы функциональные изменения в активности кортикальных колонок соматосенсорной коры ин виво во время нормоксической РД. Было обнаружено, что на фазе возникновения РД, вызываемой эпипиальной аппликацией KCl, активность в соматосенсорной коре характеризуется волной возбуждения, которое организовано в короткоживущими гамма осцилляции. Эта волна гамма-возбуждения возникала в поверхностных слоях коры и спускалась вглубь коры, предшествуя фронту последующей РД. В 5 слое коры гамма осцилляции имели большую длительность, чем в других слоях, и состояли из 2 фаз – первой фазы гамма-возбуждения, наведенного из 2/3 слоев коры и второй фазы локальных гамма осцилляций. Аналогичная фаза гамма-возбуждения была также обнаружена непосредственно перед возникновением АД, вызываемой ЭТ-1. Нами также было охарактеризовано подавление сенсорно-вызванных ответов во время РД и кинетика восстановления сенсорной и спонтанной активность после РД. Эти данные проливают свет на мехнизмы изменений в сетевой активности по время РД и АД, и представлют интерес для понимания патофизиологии не только ишемических поражений, но также нарушения функций при других патологиях, которые сопровождаются РД, как, например, позитивных и негативных галлюцинаторных симптомов во время ауры мигрени.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Третий этап проекта был посвящен продолжению исследования эффектов потенциальных нейропротекторов (вазодилятатора CGRP, агониста А1 аденозиновых рецепторов циклопентил-аденозина (ЦПА)) при их эпипиальной аппликации на зону ишемии, а также локальной гипотермии на разработанной нами во время первого этапа проекта модели фокальной ишемии коры головного мозга крыс, вызываемой эпипиальной аппликацией мощного вазоконстриктора эндотелина-1 (ЭТ-1). Данная модель фокальной ишемии клинически релевантна ишемии, возникающей при субарахноидальных кровотечениях. Было обнаружено, что CGRP не вызывает каких-либо достоверных изменений, вызываемых ЭТ-1, как в степени функционального поражения в различных слоях коры, которые оценивались по нескольким параметрам, характеризующим спонтанную и сенсорно-вызванную электрическую активность, так и гистологического поражения, которая оценивалась по размерам ишемического очага. В то же время другой потенциальный нейропротектор - ЦПА, помимо своего мощного тормозного эффекта в контрольных условиях (вероятно связанного с активацией пресинаптических А1 аденозиновых рецепторов на окончаниях аксонов глутаматергических нейронов и с активацией калиевых каналов), значительно увеличивал степень восстановления функциональной активности в коре после транзиентной ишемии, вызванной ЭТ-1, и вызывал трехкратное уменьшение объема ишемического очага. В исследовании нейропротекторных эффектов локальной гипотермии использовалась локальное охлаждение поверхности коры в зоне ишемии до 28-20° C с помощью элементов Пельтье, либо путем локальной перфузии. В контрольных условиях гипотермия оказывала десинхронизирующий эффект на сетевую активность, уменьшала мощность осцилляций в диапазоне 0.5-90 Гц (дельта, тета, альфа и гамма) во всех слоях коры и в целом снижала частоту нейрональной спайковой активности. Нейропротекторные эффекты гипотермии исследовались в 3 сериях экспериментов, в которых охлаждение коры начиналось либо одновременно с аппликацией ЭТ-1, либо с задержкой 10 минут и 60 минут после аппликации ЭТ-1. Последние два условия имитировали клинически возможные задержки в использовании гипотермии при ранней и задержанной диагностики и начала лечения ишемического инсульта, соответственно. Было обнаружено, что гипотермия, начатая одновременно и через 10 мин после аппликации ЭТ-1 вызывала достоверное и выраженное восстановление активности, что также сопровождалось значительным снижением размера ишемических очагов при гистологическом исследовании срезов головного мозга. Мощный нейропротекторный эффект локальной гипотермии планируется исследовать в продолжении данного гранта более детально, а также планируется его верификация в других моделях фокальной ишемии (блокирование МСА микрофиламентом и фотооклюзией). Помимо эпипиальной аппликации нейропротекторов, мы также исследовали возможность их доставки непосредственно в ишемическую зону через кровеносные сосуды. С этой целью были проведены эксперименты с использованием тангенциальных срезов коры головного мозга с сохраненными ветками МСА. Было показано, что микроинъекция красителя в сохранившиеся ветки МСА эффективно их заполняет во всем объеме среза, что свидетельствует о мозможности доставки веществ в зону ишемии посредством внутрисосудистой микроперфузии. Также была показана эффективная доставка красителя при микроперфузии с помощью каротидного катетера ин виво. В продолжение данного проекта планируется совершенствование внутрисосудистой перфузии в методике блокирования МСА микрофиламентом, в которой микрофиламент будет заменен на гибкую силиконовую трубку и будет использоваться как для окклюзии, так и для доставки нейропротекторов. В части проекта, посвященной микроструктурным нарушениям при ишемии, были исследованы микроструктурные изменения и проявления тканевого отека при эндотелин-1 – вызванной ишемии коры головного мозга ин виво и кислородно-глюкозной депривации в срезах головного мозга ин витро с использованием электронной микроскопии. Было обнаружено, что в обеих моделях наблюдаются ультраструктурные изменения, характерные для различной степени повреждения нейронов, в том числе неровные, прерывистые контуры нервных отростков, электронно-прозрачные области с признаками внутриклеточного отека, расширение каналов шероховатой эндоплазматической сети, нечеткие контуры кариолеммы и появление ядерных пор, и различные формы ишемического поражения митохондрий. При этом в условиях кислородно-глюкозной депривации в срезах ин витро помимо признаков клеточного отека были также значительно более выражены проявления тканевого отека со значительным увеличением межклеточного пространства. В рамках исследования распространяющейся депрессии (РД), вызываемой пароксизмальной гиперактивностью, было охарактеризовано проведение РД по слоям кортикальных колонок и ее роль в подавлении эпилептической активности коры головного мозга в модели генерализованных судорог, вызываемых ингаляцией флуротила, а также исследованы свойства пароксизмальной активности, вызываемой флюротилом, и ее влияние на развитие на ишемического поражения в эндотелин-1 модели ишемии. Было обнаружено, что РД наблюдается примерно в половине иктальных разрядов, причем ее зарождение всегда происходит в поверхностных слоях коры. Далее РД распространяется в глубину, либо останавливаясь на границе слоев 4/5, либо проводится через всю толщину коры. При этом эпилептическая активность подавлялась в слоях, охваченных РД, но сохранялась в слоях, располагающихся ниже надвигающегося фронта РД. Таким образом, было показано, что РД является частным спутником эпилептической активности, и что вертикальное проведение РД по слоям кортикальной колонки является важным фактором, влияющим на генерацию эпилептической активности в коре головного мозга. Также было обнаружено, что в условиях коморбидности эпилепсии (флуротиловая модель) и ишемии (фокальная аппликация ЭТ-1), наблюдается существенное снижение мощности эпилептических разрядов во время ишемии, а также происходит компартментализация эпилептической активности в глубокие слои коры с практически полным ее подавление в верхних слоях. Схожий электрографический портрет имеет судорожная активность и в уже сформированном ишемическом очаге, что согласуется с преимущественным поражением верхних слоев коры при ишемии, вызываемой эпипиальной аппликацией ЭТ-1. В то же время, нами не было обнаружено существенного отягощения функционального поражения и увеличения размеров ишемического очага при гистологическом исследовании у животных с флуротиловыми судорогами во время и после транзиентной ишемии, вызываемой ЭТ-1. По результатам исследований было опубликовано 4 публикации в журналах, индексируемых WoS.