Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Полученные в ходе реализации основной части проекта РНФ № 14-15-00772 «Клеточные и молекулярные основы патогенеза хромосомных болезней» линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) от пациентов с впервые описанными нами реципрокными хромосомными микроделециями и микродупликациями 3p26.3, затрагивающими единственный ген CNTN6 (Kashevarova et al., Mol Cytogenet. 2014), стали основой для проведения дальнейших исследований, направленных на установление особенностей изменения активности гена, экспрессирующегося в нейронах, при разнонаправленных вариациях в числе копий его кодирующих последовательностей. В ходе работ по проекту было установлено, что несмотря на увеличение числа копий CNTN6 при хромосомной дупликации уровень его экспрессии в нейронах оказался существенно сниженным, по сравнению с активностью аллеля дикого типа (Gridina et al., Mol Neurobiol, в печати). Данный факт позволяет в некоторой степени объяснить общность фенотипических проявлений, отмечаемую у пациентов с новым классом хромосомных заболеваний – синдромами реципрокных хромосомных микроделеций и микродупликаций. Вместе с тем, он ставит и ряд новых вопросов для объяснения данного феномена. Какова структура хромосомной микродупликации, в какой ориентации и в каком хромосомном регионе она локализована, каким образом она влияет на активность гена? Влияют ли хромосомные перестройки, затрагивающие число копий единственного гена на активность, как минимум, рядом колокализованных генов того же семейства, что и контактин-6 – CNTN4 и CHL1? Если такое влияние имеет место, то каковы его физические границы, как далеко оно распространяется по хромосоме? Влияют ли хромосомные перестройки, затрагивающие число копий единственного гена, на активность других генов, в том числе локализованных и на других хромосомах? Если так, то это могло бы объяснить множественность фенотипических проявлений хромосомного дисбаланса, наблюдаемых у наших пациентов и выходящих далеко за пределы нервной системы. На поиск ответов на эти ключевые вопросы и были направлены исследования, получившие поддержку гранта РНФ на продолжение работ в 2017-2018 гг. В ходе отчетного периода, в соответствии с планом исследований, наши работы были сфокусированы на следующих ключевых направлениях: - секвенирование генома пациентов для картирования точек разрыва при хромосомных перестройках, установления структуры и координат, а также ориентации хромосомных перестроек, исключения других патогенетически значимых микроструктурных хромосомных и генных мутаций. - валидация впервые выявленного нами эффекта неравной экспрессии аллелей разного родительского происхождения гена CNTN6 в клетках с нормальным кариотипом в дополнительных линиях нейронов, дифференцированных из ИПСК от других здоровых доноров; - анализ активности генов CNTN4 и CHL1, локализованных вблизи изучаемых хромосомных микроделеций и микродупликаций 3p26.3 и непосредственно не затронутых данными микроструктурными хромосомными аберрациями; - развитие исследований по функциональному анализу хромосомных мутаций на тканевом и организменном уровне с использованием мышиных моделей, созданных в том числе с использованием технологий редактирования генома, а также с использованием новой технологии получения церебральных органоидов, позволяющей воспроизвести ключевые этапы развития некоторых отделов головного мозга человека в условиях in vitro. Основные полученные итоги проведенных в 2017 году исследований можно обобщить следующим образом: С помощью массового параллельного секвенирования проведено высокоразрешающее картирование точек разрывов в хромосомном субсегменте 3p26.3 у пациентов с хромосомной микроделецией и микродупликацией, затрагивающей единственный ген CNTN6. Определены координаты хромосомных перестроек, а также локализация и ориентация дуплицированного участка хромосомы. Установлено, что границы делеции в геноме оказываются фланкироваными двумя однонаправленными Alu-повторами, рекомбинация между которыми могла стать наиболее вероятной причиной возникновения хромосомной перестройки. Делеция практически полностью удаляет ген CNTN6: ее начало находится в первом интроне гена, а конец – в межгенном регионе, на расстоянии 120 т.п.н. за пределами гена. Нормальный аллель гена не имеет ни структурных перестроек, ни точковых мутаций, нарушающих его функционирование. Что касается микродупликации, то ее уточненный размер составил 943 993 п.н. Дупликация оказалась тандемной, находящейся в правильной ориентации – «голова к хвосту», и содержащей единственный ген CNTN6. Точка стыка двух копий находится в межгенных промежутках и не нарушает известные регуляторные последовательности гена CNTN6. Анализ уровня экспрессии двух генов CHL1 и CNTN4, фланкирующих ген CNTN6, вовлеченный в исследуемые хромосомные перестройки, не выявил изменений в активности генов в нейронах, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных от пациента с микродупликацией 3p26.3, по сравнению с контрольными линиями нейронов, полученных при дифференцировке ИПСК от здоровых доноров с нормальным кариотипом. Показано, что в отличие от CNTN6, экспрессия аллелей материнского и отцовского происхождения происходит на одинаковом уровне в нейрональных клетках, полученных при дифференцировке ИПСК как от здоровых доноров, так и от пациента с хромосомной микродупликацией. Апробирован новый протокол нейральной дифференцировки ИПСК человека в условиях ингибирования сигнальных путей TGF-бетта и BMP, позволяющий детально изучать прохождение дифференцирующихся клеток всех основных стадий нейрогенеза. В результате были получены нейрональные линии с нормальным кариотипом и микроделецией 3p26.3, но не с гомозиготной делецией, созданной с помощью редактирования аллеля дикого типа. Несмотря на то, что мы подтвердили образование нейроэпителиальных клеток в культуре с гомозиготной делецией, клетки уже после первого пассажа активно вступали в апоптоз. Полученные данные поддерживают появившиеся недавно в литературе данные о том, что контактин-6 в комплексе с белком латрофилином-1 может быть вовлечен в регуляцию апоптоза в нейрональных клетках (Zuko et al., 2016). Апробирована новая технология получения церебральных органоидов, которая позволяет реконструировать временную и трехмерную цитоархитектонику некоторых отделов головного мозга человека в условиях in vitro (Lancaster et al., 2013). Данный подход предоставляет абсолютно уникальную возможность воссоздавать начальные этапы развития головного мозга человека и исследовать нервные клетки в условиях, максимально приближенных к in vivo. На следующем этапе исследования данная технология будет использована для изучения процессов дифференцировки нейронов с хромосомными аберрациями. С помощью CRISPR/cas9 технологии получено жизнеспособное потомство мышей с хромосомными делециями, дупликациями и инверсиями, также затрагивающими единственный ген Cntn6 (Korablev et al., BMC Genetics. 2017). Полученные линии мышей могут быть использованы для изучения эффектов мутаций Cntn6 на тканевом и организменном уровне, принимая во внимания факт множественности поражения различных систем органов у пациентов с хромосомными микроделециями и микродупликациями, затрагивающими единственный ген CNTN6, экспрессирующийся преимущественно в ЦНС.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Научные исследования по проекту РНФ «Клеточные и молекулярные механизмы патогенеза хромосомных болезней» за отчетный период проводились по трем основным направлениям: 1) анализ генной экспрессии в нейронах, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с реципрокными хромосомными микроделециями и микродупликациями 3p26.3, затрагивающими единственный ген CNTN6, ответственный за формирование синаптических взаимодействий; 2) получение и характеристика церебральных органоидов, моделирующих начальные этапы развития головного мозга человека в условиях, максимально приближенных к условиям in vivo; 3) создание и характеристика модельной линии мышей с моногенными микроделециями и микродупликациями Cntn6 с использованием технологии редактирования генома. Основные научные результаты, полученные в 2018 году, можно обобщить следующим образом: 1. Установлено, что хромосомная микроделеция 3p26.3, захватывающая единственный ген CNTN6, закономерно снижает уровень его экспрессии в нейронах, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациента с гетерозиготным носительством микроделеции. Наличие данной хромосомной перестройки не сказывается на активности двух соседних фланкирующих ее генов CHL1 и CNTN4, входящих в единое с CNTN6 семейство генов иммуноглобулиновых мембранных белков, вовлеченных в формирование межклеточных взаимодействий при развитии центральной нервной системы. В то же время, в дифференцированных нейрональных клетках хромосомная микродупликация, затрагивающая CNTN6, приводит как к снижению уровня экспрессии самого гена контактина-6, так и влияет на снижение активности соседних генов CHL1 и CNTN4. Не исключено, что наблюдаемый эффект микродупликации может быть связан с ремоделированием гетерохроматиновых областей вблизи хромосомной перестройки в ходе клеточной дифференцировки, влияющим на активность рядом расположенных генов. Полученные нами результаты позволяют объяснить сходство неврологической и нейропсихической картины, наблюдаемой у пациентов с делециями и дупликациями CNTN6, за счет снижения уровня экспрессии гена в нейрональных клетках, регистрируемого при обоих типах мутаций. 2. Эффект хромосомной микродупликации 3p26.3 распространяется и на характер экспрессии длинных некодирующих РНК (lncRNA), локализованных в пределах последовательности гена CNTN6, приводя к снижению их транскрипции в ИПСК от пациента с микродупликацией. В то же время в дифференцированных нейрональных клетках для большей части lncRNA не отмечено влияния микродупликации на уровень экспрессии, тогда как для гена LOC105376923, локализованного в интроне 2 CNTN6, напротив, зарегистрировано повышение уровня его транскрипционной активности. 3. Полнотранскриптомный микроматричный анализ генной экспрессии в нейронах, дифференцированных из ИПСК пациентов с микроделецией и микродупликацией гена CNTN6, показал, что нарушение копийности единственного гена влияет на изменение активности в нейрональных клетках целого ряда других генов, непосредственно не вовлеченных в хромосомную перестройку. В ходе проведенного исследования нами впервые выделено 4 группы транскрипционных эффектов реципрокных CNV (Copy Number Variation), представленных микроделециями и микродупликациями 3p26.3: 1) снижение экспрессии ряда генов при делеции и при дупликации (402 дифференциально экспрессирующихся гена); 2) повышение экспрессии ряда генов при делеции и при дупликации (25 генов); 3) снижение экспрессии ряда генов при делеции, но повышение их экспрессии при дупликации (эффект «прямой» дозовой зависимости от перестройки) (49 генов); 4) повышение экспрессии ряда генов при делеции, но снижение их экспрессии при дупликации («обратная» дозовая зависимость от перестройки) (51 ген). Несмотря на значительные различия в количестве дифференциально экспрессирующихся генов между клеточными линиями с полярными изменениями в числе копий одного и того же хромосомного субсегмента, а также принимая во внимание вклад отличий по генотипам между исследуемыми клеточными линиями, полученными от разных пациентов, отмечается общая тенденция к снижению экспрессии генов, продукты которых вовлечены в ключевые для развития мозга биологические процессы: регуляцию синаптической передачи, рост и функционирование нервной системы и нейронов, нейрогенез, а также в регуляцию морфогенеза. 4. В ходе проведения настоящего исследования впервые получены церебральные органоиды с гетеро- и гомозиготными делециями гена CNTN6, позволяющими воссоздавать начальные этапы развития головного мозга человека и исследовать свойства нейрональных клеток с мутациями в условиях, максимально приближенных к условиям in vivo. С использованием данной модели выявлены отличия в морфологических характеристиках церебральных органоидов с хромосомными микроделециями, по сравнению с органоидами с нормальным кариотипом. В частности, на 10 день дифференцировки мутантные церебральные органоиды имеют сглаженную поверхность, в отличие от структурированной формы при нормальном кариотипе, а к 20 дню общие размеры гомозиготных по делеции органоидов уменьшаются относительно гетерозигот и нормального кариотипа. Кроме того, на 20 день дифференцировки происходит резкое снижение числа особых морфологических структур – петель или лупов (от англ - loops), моделирующих центры организации переднего мозга. В нормальных и гетерозиготных линиях на один органоид приходится от 3 до 10 подобных структур, в то время как в гомозиготных мутантных линиях среди 20 проанализированных клеточных комплексов было обнаружено только два церебральных органоида, содержащих по единственному лупу. Уменьшение числа клеточных структур в церебральных органоидах, полученных из линии ИПСК с нуллисомией CNTN6, может быть связано со снижением пролиферативного потенциала клеток, а также с увеличением уровня апоптоза. 5. С использованием технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 на стадии зиготы впервые получены модельные линии мышей, несущие протяженные хромосомные микроделеции (1137 п.о.) и микродупликации (2374 п.о.), которые могут быть использованы для изучения эффектов хромосомных перестроек на организменном уровне и для оценки их влияния на репродуктивные показатели. По данным FISH-анализа и Саузерн-блот гибридизации, делетированные при редактировании генома фрагменты ДНК не выявлены у носителей искусственно полученной делеции, что свидетельствует об отсутствии их реинтеграции в геном. Суммарные изменения последовательности ДНК вблизи сайтов для направляющих РНК при направленной индукции масштабных хромосомных микроделеций и микродупликаций незначительны и варьируют у носителей дупликации от мутаций единичных нуклеотидов до небольших делеций, протяженностью до 172 п.о.