Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Домашние кошки находятся под пристальным ветеринарным надзором, благодаря которому удалось описать более 250 генетических заболеваний, аналогичных человеческим. Кошачьи инфекции являются естественными моделями для изучения смертельных человеческих заболеваний, включая кошачий вирус иммунодефицита (FIV), кошачьи вирусы саркомы и лейкемии. Наличие обширной ветеринарной литературы, посвященной кошачьим патогенам и заболеваниям, с учетом высокой степени консервативности предкового генома млекопитающих, превращает геном домашней кошки в крайне информативный ресурс, позволяющий решать самые разнообразные задачи как относящиеся к сферам биомедицины и физиологии, так и к изучению эволюции млекопитающих. В результате работы, проделанной научными коллективами, в том числе и нашей лабораторией, в настоящее время отсеквенировано и собрано 12 из 37 геномов представителей различных видов семейства кошачьих. Это геномы каракала, гепарда, домашней кошки, кота-рыболова, барханного кота, пиренейской рыси, ягуара, леопарда, бенгальской кошки, льва, пумы и тигра. Из четырех групп видов три группы (группы домашней кошки, бенгальской кошки и пумы) формируют группу близких друг к другу видов, в том время как группа больших кошек (Panthera) рассматривается как внешняя группа по отношению к ним. Для выполнения поставленных задач мы решили сосредоточиться на одной ветке кошачьих. Пума (Puma concolor), ягуарунди (Puma yagouaroundi) и африканский гепард являются представителями рода пумы (Puma), входящего в семейство кошачьих (Felidae). Несмотря на то, что в настоящее время гепарды встречаются только в Африке и Иране, имеется достаточно доказательств того, что представители рода пумы возникли от одного общего предка, который жил на территории Северной Америки на протяжении миоцена. Этот вывод основан на сравнительном анализе молекулярных маркеров митохондриальной и ядерной ДНК. Время разделения гепардов, пум и ягуарунди на отдельные виды оценивается в 6,7 миллионов лет тому назад. Палеонтологические следы существования гепарда можно встретить в Северной и Южной Америках, Европе и Азии вплоть до позднего плейстоцена (10 000 – 12 000 лет назад). Это время примерно соответствует периоду вымирания мегафауны, который затронул более чем 40 видов крупных млекопитающих, включая гепардов (Miracinonyx) и пум в Северной Америке. Богатая популяционная история этих видов и разнообразие специализированных адаптационных механизмов делают всех трех представителей крайне интересными объектами для изучения на уровне генома, в частности, в связи с возможностью обнаружения сигналов данных адаптаций, оставивших след в геноме. За последний год несколько групп, занимающихся генетикой кошачьих, начали применять новые методы секвенирования как предложенные в нашем проекте, так и другие. После всесторонней оценки плюсов и минусов доступных на рынке предложений, а также анализа результатов, полученных в других наших геномных проектах, нами была выбрана стратегия секвенирования на 2017 год. Изначально мы планировали использовать PacBio Sequel, однако сочетания стоимости и качества оказалось для нас неприемлем. Поэтому мы выбрали стратегию основанную на использование технологии 10X Genomics совместно с оптическими картами. Нами были собраны образцы и отправлены на секвенирование, поэтому в ближайшее время будут готовы геномные последовательности и сборки двух из трех выбранных видов. Одним из наиболее важных частей выполнения проекта является амбициозная цель по секвенированию и аннотации геномов всех 37 видов кошачьих. На настоящий момент собрано 12 геномов. В течение 2017 года мы успешно закончили сборку 3 видов кошачьих: каракала, кота-рыболова и бенгальской кошки. В течение следующего года благодаря сотрудничеству с другими группам, занимающимся геномами кошачьих, мы надеемся приблизиться к 20 из 37 геномам кошачьих. В течение 2017 года мы аннотировали 12 видов кошачьих, по этим данным сейчас подготавливается статья к публикации. Одновременно со сборкой и аннотацией 12 видов кошачьих мы продолжали работу над пятью инструментами для облегчения сравнительного анализа геномов кошачьих: 1) Chromosomer — инструмент для хромосомной сборки по близкому референсу; 2) Panthera — инструмент для аннотации генов с последующим анализом полученных результатов; 3) Надстройки над инструментом для множественного выравнивания Cactus для анализа множественных полногеномных выравниваний; 4) Lyrebird — инструмент для анализа качества сборки тандемных повторов в геномах как наиболее сложных частей генома. В течение всего 2017 года мы разрабатываем свою собственную компьютерную программу для поиска и аннотации генов (Panthera). У нас богатый опыт аннотации генов в различных геномах, и, к сожалению, все доступные инструменты не дают удовлетворительного для нас результата. Мы назвали нашу программу Panthera и используем для аннотации генов как в геномах кошачьих, так и в других наших геномных проектах. Так как мы не просто ищем гены, но и проводим их последующий анализ, то нами были добавлены ряд возможностей в Panthera, такие как: реконструкция филогенетического древа, оценка времени расхождения видов, поиск генов под позитивным отбором, анализ эволюции генных семейств (gene expansion and contraction). Одной из целью проекта была совместная работа с другими группами ученых по всему миру, занимающимися геномами кошек и природозащитной биологией в целом. Результаты нашей совместной работы над геномом ягуара были опубликованы в журнале Science Advances. В опубликованной работе мы представили сборку de novo и аннотацию генома ягуара (Panthera onca), собранный геном леопарда (Panthera pardus) и сравнительный анализ, охватывающий все живые виды пантер. Демографические реконструкции показали, что у всех этих видов наблюдаются переменные эпизоды снижения численности популяции во время плейстоцена, что в конечном итоге приводит к небольшим эффективным размерам популяции в настоящее время. Мы идентифицировали множественные следы видоспецифического положительного отбора, влияющие на гены, участвующие в развитии черепно-лицевых костей и костей конечностей, белковом обмене, гипоксии, размножении, пигментации и сенсорном восприятии. Значительным оказалось совпадение в сигнальных путях, обогащенных геномными сегментами, вовлеченными в межвидовую интрогрессию и в позитивный отбор. На основании полученных данных мы предположили, что эти процессы связаны. Мы протестировали эту гипотезу, разработав экзомные зонды, нацеленные на ~19000 генов пантер и использовав их для анализа геномов 30 пойманных ягуаров. Мы обнаружили по крайней мере два гена (DOCK3 и COL4A5, оба связанные с развитием зрительного нерва), несущие значительные сигналы межвидовой интрогрессии и внутривидового положительного отбора. Эти данные свидетельствуют о том, что примесь после видообразования внесла генетический материал, который способствовал адаптивной эволюции крупных линий кошек (Figueir et al. 2017). Другим важным вопросом является мотивация: зачем вообще нужно секвенировать геномы кошачьих. Для ответа на этот вопрос наша группа опубликовала статью в Journal of Heredity. В статье сделан акцент на то, что сокращение численности видов диких животных на планете стало причиной повышения интереса к этой проблеме и активизации усилий по сохранению исчезающих видов. Применение новых высокопроизводительных технологий секвенирования и анализа данных для решения этой проблемы значительно усилило нашу способность распознавать и предупреждать скрытые опасности, которые угрожают этим видам. Благодаря использованию геномных данных в сотнях подобных исследованиях мы получили новые знания о выживании, адаптации и эволюции видов млекопитающих. В проекте, выполняемом в рамках этого проекта, одним из видов для исследования нами выбран гепард. Гепард находится под угрозой исчезновения, и наша работа, позволит сохранить его и пролить свет на долгосрочную историю этого вида и поиск решений для его сохранения. Ранее при анализе генома гепарда мы обнаружили ряд генетически обусловленных дефектов. Мы надеемся, что три десятилетия исследований, интерпретации и противоречий и теперь наличие прочитанного генома предоставит убедительный инструментарий для оценки действий, нацеленных на сохранение и выживание гепарда и других видов животных, находящихся под угрозой (O'Brien et al. 2017). Третья статья, которая будет доступна в январе 2018 года в журнале Current Biology, касается носорогов — вида, также находящегося под угрозой исчезновения. Черные и белые носороги (Diceros bicornis и Ceratotherium simum) являются знаковыми африканскими видами, которые классифицируются как находящиеся под угрозой исчезновения и находящиеся под угрозой соответственно. Мы применили анализ, разработанный и апробированный ранее на геноме гепарда, сначала для создания генома на основе близкородственного генома с использованием программы Chromosomer и после этого для создания набора зондов для генетического типирования, которое значительно облегчает задачу контроля над популяцией, находящейся под угрозой исчезновения (Harper et al. 2018).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Домашние кошки находятся под пристальным ветеринарным надзором, благодаря которому удалось описать более 250 генетических заболеваний, аналогичных человеческим. Кошачьи инфекции являются естественными моделями для изучения смертельных человеческих заболеваний, включая кошачий вирус иммунодефицита (FIV), кошачьи вирусы саркомы и лейкемии. Наличие обширной ветеринарной литературы, посвященной кошачьим патогенам и заболеваниям, с учетом высокой степени консервативности предкового генома млекопитающих, превращает геном домашней кошки в крайне информативный ресурс, позволяющий решать самые разнообразные задачи как относящиеся к сферам биомедицины и физиологии, так и к изучению эволюции млекопитающих. В результате работы, проделанной научными коллективами, в том числе и нашей лабораторией, в 2018 году к 12 добавилось еще 5 геномов кошачьих, таким образом на настоящее время отсеквенировано и/или собрано 17 из 37 геномов представителей различных видов семейства кошачьих. Это геномы домашней кошки, барханного кота, черноногой кошки, бенгальской кошки, кота-рыболова, манула, пумы, ягуарунди, гепарда, пиренейской рыси, канадской рыси, каракала, льва, леопарда, ягуара, тигра и дымчатого леопарда. Из четырех видовых линий три линии (линия домашней кошки, линия бенгальской кошки и линия пумы) формируют группу близких друг к другу видов, в то время как линия пантеры (больших кошек) рассматривается как внешняя группа по отношению к ним. Для выполнения поставленных задач мы решили сосредоточиться на геномах линии пумы, которая включает пуму (Puma concolor), ягуарунди (Puma yagouaroundi) и африканского гепарда (Acinonyx jubatus). Несмотря на то, что в настоящее время гепарды встречаются только в Африке и Иране, имеется достаточно доказательств того, что представители рода пумы возникли от одного общего предка, который жил на территории Северной Америки на протяжении миоцена. Этот вывод основан на сравнительном анализе молекулярных маркеров митохондриальной и ядерной ДНК. Время разделения гепардов, пум и ягуарунди на отдельные виды оценивается в 6,7 миллионов лет тому назад. Палеонтологические следы существования гепарда можно встретить в Северной и Южной Америках, Европе и Азии вплоть до позднего плейстоцена (10 000 – 12 000 лет назад). Это время примерно соответствует периоду вымирания мегафауны, который затронул более чем 40 видов крупных млекопитающих, включая гепардов (Miracinonyx) и пум в Северной Америке. Богатая популяционная история этих видов и разнообразие специализированных адаптационных механизмов делают всех трех представителей линии пумы крайне интересными объектами для изучения на уровне генома, в частности, в связи с возможностью обнаружения сигналов данных адаптаций, оставивших след в геноме. За последний год несколько групп, занимающихся генетикой кошачьих, начали применять новые методы секвенирования как предложенные в нашем проекте, так и другие. После всесторонней оценки плюсов и минусов доступных на рынке предложений, а также анализа результатов, полученных в других наших геномных проектах, нами была выбрана стратегия секвенирования на 2017-2018 год. Изначально мы планировали использовать PacBio Sequel, однако сочетание стоимости и качества оказалось для нас неприемлемым. Поэтому мы выбрали стратегию основанную на использование технологии 10X Genomics совместно с методом HiC, вместо ранее запланированного использования оптических карт. Выбранные методы позволили нам в 2018 году собрать геном гепарда до псевдо-хромосомного уровня, дополнительно к псевдо-хромосомам пумы. Для генома ягуарунди нами были получены биообразцы для секвенирования методом 10X Genomics, результаты которого были получены в начале декабря 2018 года. Таким образом на конец 2018 года мы имеем высококачественные сборки для геномов трех представителей линии пумы. Одним из наиболее важных частей выполнения проекта является амбициозная цель по секвенированию и аннотации геномов всех 37 видов кошачьих. На настоящий момент собрано 17 геномов. В течение 2018 года мы успешно закончили сборку 2 видов кошачьих: барханной кошки (Felis margarita) и дымчатого леопарда (Neofelis nebulosa). В 2019 году мы планируем продвинуться еще дальше в сборе биообразцов, секвенирование, сборке и аннотации недостающих геномов кошачьих. Одновременно со сборкой и аннотацией 17 видов кошачьих мы продолжали работу над четырьмя инструментами для облегчения сравнительного анализа геномов кошачьих: 1) Chromosomer 2 — инструмент для хромосомной сборки по близкому референсу; 2) Panthera — инструмент для аннотации генов с последующим анализом полученных результатов; 3) Надстройки над инструментом для множественного выравнивания Cactus для анализа множественных полногеномных выравниваний; 4) Lyrebird — инструмент для анализа качества сборки тандемных повторов в геномах как наиболее сложных частей генома. Одной из целью проекта была совместная работа с другими группами ученых по всему миру, занимающимися геномами кошек и природоохранной биологией в целом. Результаты нашей совместной работы по геномам тигров были опубликованы в журнале Current Biology. В опубликованной работе мы представили анализ 32 отсеквенированных геномов тигров из шести различных групп, мы показали что время до ближайшего общего предка современных тигров составляет 110 kya, мы показали что поток генов ограничен в диапазоне, поддерживающем внутривидовое различие, а ген ADH7 показывает влияние отбора у суматранских тигров, вероятно, связанный с адаптацией (Liu et al., 2018). Другая наша совместная работа посвящена популяционной генетики горных львов. Горные львы предоставляют редкую возможность изучить потенциал восстановления разнообразия методами популяционной геномики, и возможность наблюдать долгосрочные последствия транслокации. Так результаты нашей совместной работы обеспечивают основу для анализа всего генома горного льва, а полученные данные можно применять для управления небольшими и изолированными популяциями в природоохранных целях (Saremi et al., 2018). Третья наша совместная работа касалась адаптивной геномной эволюции у ранних млекопитающих. Используя интегративные сравнительные геномные и филогенетические методы над семейством фоторецептивных генов опсина у 154 млекопитающих. Мы показали, что млекопитающие обладают геномными структурами, согласующимися с ночным происхождением. Потеря опсинов RH2, VA, PARA, PARIE и OPN4x у всех млекопитающих привела нас к предложению гипотезы глобального ночного узкого горлышка, которая объясняет потерю этих генов в возникшей линии (>> 215,5 миллионов лет тому назад). Кроме того, анализ предоставил убедительные доказательства ночного образа жизни предковых млекопитающих и наличия у них чувствительного к ультрафиолету зрения с низкой остротой и низкой конвергенцией орбиты (то есть, панорамного зрения) (Borges et al., 2018). Четвертая статья, принятая в 2017 году, была опубликована 2018 года в журнале Current Biology, касается носорогов — вида, также находящегося под угрозой исчезновения. Черные и белые носороги (Diceros bicornis и Ceratotherium simum) являются знаковыми африканскими видами, которые классифицируются как находящиеся под угрозой вымирания и угрожаемые, соответственно. Мы применили анализ, разработанный и апробированный ранее на геноме гепарда, сначала для создания генома на основе близкородственного генома с использованием программы Chromosomer и после этого для создания набора маркеров для генотипирования, которое значительно облегчает задачу контроля над популяцией, находящейся под угрозой исчезновения (Harper et al. 2018).