Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Целью проекта является выявление молекулярных механизмов редокс-регуляции Na,K-АТФазы в норме и патологии, обусловленных редокс-модификациями фермента, приводящими к изменению его свойств и взаимодействия с белками-партнерами. Na,K-АТФаза поддерживает градиент ионов натрия и калия, необходимый для жизнеспособности клеток животных, а также является единственным рецептором для кардиотонических стероидов, поэтому нарушение ее функции является критичным для жизнеспособности и нормального функционирования клеток. Изменение функционирования Na,K-АТФазы лежит в основе целого ряда патологий, связанных с нарушением редокс-статуса клеток, в частности, является критичным при ишемии и онкотрансформации клеток. Нами было показано, одной из главных причин изменения рецепторной и транспортной функции Na,K-АТФазы при нарушении редокс-статуса клеток являются редокс-модификации каталитической субъединицы фермента – глутатионилирование и нитрозилирование. Ранее нами было показано, что каталитическая субъединица Na,K-АТФазы подвергается регуляторному и базальному глутатионилированию. Регуляторное глутатионилирование происходит при быстром изменении редокс-статуса клетки, в частности, при острой гипоксии и приводит к ингибированию активности белка. Базальное глутатионилирование происходит в процессе синтеза белка, и его уровень увеличивается только при длительном нарушении редокс-статуса клетки, например, при длительной гипоксии. В ходе данного этапа проекта нами было установлено, как воздействия на клетки, индуцирующие возрастание базального глутатионилирования, а именно, длительная гипоксия и инкубация с производными глутатиона, влияют на функционирование Na,K-АТФазы. Показано, что длительная гипоксия, а также инкубация с этил-глутатионом (et-GSH) и нитрозоглутатионом (GSNO) приводят к длительному возрастанию регуляторного глутатионилирования Na,K-АТФазы и изменению уровня ее базального глутатионилирования, а эффект проникающего аналога окисленного глутатиона менее выражен (tetGSSG). Мы оценили активность Na,K-АТФазы и ее константу ингибирования уабаином после этих воздействий в присутствии и отсутствии восстановителя дитиотреитола (ДТТ), который позволяет снимать регуляторные редокс-модификации. Было установлено, что Na,K-АТФаза по-разному отвечает на острую и длительную гипоксию. Острая гипоксия (до нескольких часов) приводит к возрастанию глутатионилирования альфа субъединицы и ингибированию активности фермента, которое снимается в присутствии ДТТ. В то же время инкубация клеток в условиях длительной гипоксии приводит к возрастанию гидролитической активности фермента, которое подавляется в присутствии ДТТ. Подобный эффект наблюдается также в случае длительной инкубации клеток с et-GSH. Одновременно с этим под действием гипоксии, et-GSH и ДТТ отмечалось существенное повышение константы ингибирования для уабаина. Проникающий аналог окисленного глутатиона tetGSSG не влиял ни на активность фермента, ни на константу ингибирования уабаина. Полученные данные свидетельствуют о том, что кратковременное и длительное нарушение редокс-статуса клеток могут по-разному сказываться на функционировании белка. Необходимо отметить, после снятия регуляторных редокс-модификаций с помощью ДТТ активность и чувствительность к уабаину у образцов клеток после гипоксии и инкубации с et-GSH отличалась от контроля. Это позволяет предполагать, что котрансляционные редокс-модификации, в частности, базальное глутатионилирование, могут играть важную роль в регуляции активности белка при длительных нарушениях редокс-статуса клеток. Оценка жизнеспособности клеток при длительной гипоксии в присутствии производных глутатиона показала, что в данном случае они не оказывают защитного эффекта, в то время как при кратковременной гипоксии этот эффект был отчетливо выражен. Более того, длительная инкубация с et-GSH и GSNO, приводящая к длительному повышению регуляторного глутатионилирования, снижает жизнеспособность клеток. В то же время tetGSSG, не оказывающий такого эффекта на регуляторное глутатионилирование, не влияет на жизнеспособность клеток. По-видимому, защитным эффектом обладает только кратковременное увеличение регуляторного глутатионилирования Na,K-АТФазы, а его длительное повышение, надолго снижающее транспортную активность Na,K-АТФазы, опасно для клеток. Онкотрансформированные клетки характеризуются повышенной активностью Na,K-АТФазы. Ранее на линейке миелоидных клетках мыши FDC-P1 с эктопической экспрессией онкогенов KIT и AML1-ETO нами было показано, что введение данных онкогенов приводит к изменению редокс-статуса клеток и возрастанию активности Na,K-АТФазы. Данное возрастание мы связывали с тем, что в клетках, экспрессирующих данные онкогены, наблюдается снижение уровня регуляторного глутатионилирования и возрастание уровня нитрозилирования каталитической субъединицы фермента. В ходе данного проекта мы показали, что инкубация с ДТТ приводит к снижению активности в клетках, экспрессирующих AML1-ETO, имеющих самую большую активность по сравнению с контролем. Это подтверждает наше предположение о том, что рост активности фермента в значительной степени связан с увеличением уровня его нитрозилирования. Мы установили, что введение онкогенов также приводит к снижению уровня базального глутатионилирования альфа субъединицы. Для выявления потенциальных сайтов базального и регуляторного глутатионилирования в белках нами созданы две программы. Первая определяет вероятность глутатионилирования остатка цистеина на основе физико-химических свойств последовательности белка вокруг остатка цистеина, то есть ближайших по аминокислотной цепи остатков, окружающий данный цистеин. Вторая программа с помощью разбиения Вороного-Делоне определяет наличие полостей в структуре белков вблизи атомов серы остатков цистеинов, размеры этих полостей и их форму. Первая программа позволит выявить потенциальные сайты базального и регуляторного глутатионилирования в различных белках, в том числе в белках, с которыми взаимодействует Na,K-АТФаза. Совместное использование этих двух программ позволит предсказать расположение возможных сайтов базального глутатионилирования в существующих структурах белков. Рецепторная функция Na,K-АТФазы обусловлена тем, что часть молекул ассоциирована с Src киназой, которая, находясь в комплексе с ферментом, является неактивной. Активация Src киназы инициируется связыванием Na,K-АТФазы с кардиотоническими стероидами, в частности, с уабаином, которое приводит к изменению конформации фермента и высвобождению Src киназы из комплекса с Na,K-АТФазой. Ранее мы показали, что в условиях кратковременной гипоксии, которая приводит к увеличению регуляторного глутатионилирования Na,K-АТФазы, рецепторная функция Na,K-АТФазы к уабаину меняется. На основании полученных нами экспериментальных данных и данных моделирования мы заключили, что в основе изменения рецепторной функции Na,K-АТФазы при острой гипоксии может лежать изменение регуляторного глутатионилирования альфа-субъединицы Na,K-АТФазы, нарушающее ее взаимодействие с Src киназой. В ходе выполнения данного этапа проекта мы определили, как изменяется рецепторная функция Na,K-АТФазы при длительной гипоксии (72 ч, 0,2% кислорода), которая приводит к изменению базального уровня глутатионилирования Na,K-АТФазы. С этой целью было оценено изменение активирующего и ингибирующего фосфорилирования Src киназы через 30 минут добавления уабаина к клеткам фибробластов мыши линии SC1, длительное время находящихся в условиях гипоксии. Было установлено, что в данном случае, также как и при кратковременной гипоксии, наблюдается инверсия рецепторного ответа Na,K-АТФазы на уабаин, заключающаяся в том, что при гипоксии уабаин вызывает не возрастание, а снижение активирующего фосфорилирования. В отличие от острой гипоксии (в течение нескольких часов), при которой наблюдалось значительное возрастание активности Src киназы, при длительной гипоксии (несколько суток) этот эффект был выражен в гораздо меньшей степени. Самое существенное отличие в реализации рецепторной функции при кратковременной и длительной гипоксии заключается в том, что при длительной гипоксии в отличие от острой гипоксии наблюдается не снижение, а возрастание уровня ингибирующего фосфорилирования, а добавление уабаина приводит не к снижению, а к еще большему его возрастанию. Мы предполагаем, что это происходит вследствие того, что базальное глутатионилирование, возрастающее при длительной гипоксии, в отличие от регуляторного, не нарушает взаимодействие Src и Na,K-АТФазы, но может, влияя на конформацию Na,K-АТФазы, модулировать это взаимодействие. Показано, что производные глутатиона, изменяющие уровень глутатионилирования Na,K-АТФазы, влияют на уровень активирующего и ингибирующего фосфорилированя Src киназы. В условиях стресса, в частности, при ишемии, с Na,K-АТФазой может взаимодействовать белок теплового шока (БТШ 70), обладающий шаперонной активностью. Он стабилизирует её и предотвращает ее диссоциацию от цитоскелета. Однако, параметры взаимодействия БТШ 70 с Na,K-АТФазой были не известны. С помощью изотермической калориметрии титрования мы определили термодинамические параметры образования комплекса БТШ70 с Na,K-АТФазой. В процессе каталитического цикла Na,K-АТРаза проходит две основные конформации E1 и E2, еще одна хорошо описанная устойчивая конформация – фосфорилированная форма фермента E2P. Мы установили, c какой из конформаций Na,K-АТФазы (E1, E2 или E2P) преимущественно связывается БТШ70. Нами была оценено влияние БТШ70 на гидролитическую активность Na,K-АТФазы. Было установлено, что без преинкубации данных белков друг с другом БТШ70 приводит лишь к небольшому ингибированию активности Na,K-АТФазы. Na,K-АТФаза является единственным известным рецептором к кардиотоническим стероидам. Уровень эндогенных кардиотонических стероидов изменяется при ишемии. Также при ишемии может происходить связывание БТШ70 с Na,K-АТФазой, стабилизирующее фермент. Для того, чтобы проверить, как связывание БТШ70 влияет на чувствительность к кардиотоническому стероиду уабаину мы сравнили термодинамические параметры связывания Na,K-АТФазы с уабаином в присутствии и отсутствии БТШ70. Было установлено, что Na,K-АТФаза в комплексе с БТШ70 связывает уабаин практически также, как и отдельный фермент. Также было показано, что при образовании комплекса уабаина с Na,K-АТФазой связывание БТШ70 с ферментом практически не меняется. Таким образом, связывание БТШ70 с Na,K-АТФазой, происходящее при стрессовых воздействиях, не будет влиять на взаимодействие Na,K-АТФазы с уабаином, который способен как регулировать активность фермента, так и опосредовать рецепторную функцию Na,K-АТФазы.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Целью проекта является выявление молекулярных механизмов редокс-регуляции Na,K-АТФазы в норме и патологии, обусловленных редокс-модификациями фермента, приводящими к изменению его свойств и взаимодействия с белками-партнерами. Нами было обнаружено, что одной из ключевых редокс-модификаций фермента является глутатионилирование его альфа субъединицы, приводящее к изменению его функционирования. Ранее нами было показано, что каталитическая субъединица Na,K-АТФазы подвергается регуляторному и базальному глутатионилированию. В отличие от регуляторного глутатионилирования, которое зависит от редокс-статуса клетки и приводит и ингибированию белка, базальное глутатионилирование возрастает лишь при длительном изменении редокс-статуса клетки и не может быть снято при восстановлении нормального редокс-статуса. Нами была выдвинута гипотеза, что базальное глутатионилирование это котрансляционная модификация, которая зависит от редокс-статуса клетки в процессе синтеза белка и играет важную роль в процессе фолдинга белка. Для того, чтобы проверить данную гипотезу мы провели анализ базального глутатиоилирования альфа субъединицы Na,K-АТФазы, выделенной из эндоплазматического ретикулума и цитоплазматической мембраны клеток фибробластов мыши линии SC1, выросших в условиях нормоксии и гипоксии (0,2 % pO2). Было установлено, что базальное глутатионилирование регистрируется при длительной гипоксии не только у молекул альфа субъединицы из цитоплазматической мембраны, но и у альфа субъединицы, выделенной из эндоплазматического ретикулума, возрастая при гипоксии. При этом вклад базального глутатионилирования в общее глутатионилироваие белка был выше в случае альфа субъединицы, выделенной из эндоплазматического ретикулума. Это объясняется тем, что общий уровень глутатионилирования альфа субъединицы в процессе жизни белка увеличивается и следовательно выше в случае Na,K-АТФазы из цитоплазматической мембраны, в то время как базальное глутатионилирование остается постоянным Полученные данные подтверждают нашу гипотезу о том, что базальное глутатионилирование является котрансляционной модификацией. Установлено, что базальному глутатионилированию подвергаются остатки альфа субъединицы: Cys 204, 452 и 698. Охарактеризована и объяснена зависимость эффективности регуляторного глутатионилирования Na,K-АТФазы от конформации фермента и проведен анализ структурной устойчивости пентапептидов последовательности альфа-субъединицы Na,K-АТФазы. В системе in vitro (в системе ретикулоцитных лизатов) было показано, что при изменении тиолового редокс-статуса, определяемого соотношением восстановленной (GSH) и оксиленной форм глутатиона (GSSG) происходит изменение уровня базального глутатионилирования альфа субъединицы. Изменение отношения GSH/GSSG от 100 до 1 приводит к возрастанию уровня базального глутатионилирования белка. Базальное глутатионилирование детектировалось не только в полностью синтезированных, но и частично синтезированных молекулах альфа субъединицы Na,K-АТФазы. Совокупность полученных данных является еще одним свидетельством в пользу того, что базальное глутатионилирование является котрансляционной модификацией. На основании созданного нами алгоритма для выявления остатков цистеинов в белках, которые могут подвергаться базальному глутатионилированию, в ходе анализа структур белков было выявлено 18 белков, которые могут обладать базально глутатионилированными остатками цистеина. Для ряда этих белков уже показано, что мутации данных цистеинов ассоциированы с возникновением различных заболеваний, что служит косвенным подтверждением важности таких остатков для правильного функционирования белков. Проведенный нами анализ базально глутатионированных белков в клетках фибробластов мыши линии SC1, растущих в условиях нормоксии и гипоксии выявил, что одним из основных базально глутатионилированных белков в данных клетках является актин. Также было зарегистрировано базальное глутатионилирование Ca-АТФазы саркоплазматического ретикулума (SERCA) и каталитической альфа субъединицы фосфоинозитол 4,5- бифосфат 3 киназы (PIK3CA), которая может взаимодействовать с альфа-субъединицей Na,K-АТФазы. Базальное глутатионилирование актина, SERCA и PI3K было гораздо более выражено в клетках, выросших в условиях гипоксии, что хорошо согласуется с данными, полученными нами ранее на Na,K-АТФазе. Рецепторная функция Na,K-АТФазы обусловлена тем, что при связывании с кардиотоническими стероидами происходит активация Src-киназы. В настоящее время есть предположение, что часть молекул Na,K-АТФазы в клетке, выполняющих рецепторную функцию постоянно связана с Src-киназой, взаимодействуя через актуаторный домен Na,K-АТФазы и SH2 домен Src-киназы. Взаимодействие нуклеотид-связывающего домена Na,K-АТФазы и киназного домена Src приводит к ингбированию Src и нарушается при связывании с Na,K-АТФазой кардиотонических стероидов, в частности, уабаина. Однако прямое взаимодействие данных белков было не доказано и его параметры не были известны. Нами впервые, с помощью микротермофореза (MST) была оценена константа прямого взаимодействия Na,K-АТФазы и Src киназы, которая составила около 450 нМ, при этом стехиометрия связывания равна единице. В присутствии уабаина наблюдалось сохранение взаимодействия Src-киназы и Na,K-АТФазы с константой 251 нМ. Это подтверждает предположение о том, что уабаин-независимое связывание актуаторного домена АТФазы и SH2 домена Src киназы имеет большую константу связывания, чем уабаин-чувствительное взаимодействие нуклеотид-связывающего и киназного доменов. Ранее нами было обнаружено, что в условиях гипоксии происходит нарушение рецепторной функции Na,K-АТФазы. Мы выдвинули гипотезу, что это происходит вследствие глутатионилирования белка. Для того, чтобы проверить эту гипотезу, мы оценили влияние глутатионилирования на параметры связывания Na,K-АТФазы c Src-киназой и активацию Src киназы в присутствии Na,K-АТФазы. Было обнаружено, что в присутствии окисленного глутатиона, индуцирующего глутатионилирование Na,K-АТФазы, связывание с Src-киназой полностью нарушается. Таким образом, глутатионилирование остатков цистеина нарушает интерфейс взаимодействия Na,K-АТФазы и Src-киназы. Это объясняет нарушение рецепторной функции Na,K-АТФазы в условиях гипоксии, приводящей к глутатионилированию фермента. Активация Src-киназы зависит от высвобождения ее киназного домена, связывание которого с Na,K-АТФазой предотвращает активацию Src-киназы. Поэтому было оценено также влияние редокс-модификаций на активность Src-киназы и уровень ее активирующего фосфорилирования (Y416), возникающего при высвобождении киназного домена. Установлено, что присутствие Na,K-АТФазы снижает активность Src-киназы и уровень ее активирующего фосфорилирования (Y416). При этом в присутствии GSSG снижение как активности Src-киназы, так и уровня ее активирующего фосфорилирования было выражено в меньшей степени, чем в отсутствие GSSG, что говорит о том, что глутатионилирование остатков цистеина в интерфейсе взаимодействия двух белков приводит к высвобождению киназного домена Src-киназы из комплекса с Na,K-АТФазой и последующей активации Src-киназы. На предыдущем этапе проекта нами впервые были установлены термодинамические параметры связывания БТШ70 c Na,K-АТФазой. Связывание с БТШ 70 может влиять на конформацию Na,K-АТФазы, что будет приводить к изменению ее свойств и взаимодействий с белками-партнерами. Методом изотермической калориметрии титрования (ИКТ) на основании зависимости энтальпии комплексообразования от температуры была получено изменение теплоемкости системы при образовании комплекса Na,K-АТФазы с БТШ70. Установлено, что связывание БТШ70 c Na,K-ATФазой характеризуется DCp= -226 кал/моль*К. На основании этих данных мы вычислили, что снижение площади поверхности белка доступной растворителю при образовании комплекса Na,K-АТФаза:БТШ70 составляет от 1196 до 1752 квадратных ангстрем. Изменение конформации Na,K-АТФазы при связывании БТШ70 также было оценено по изменению флуоресценции Na,K-АТФазы, меченной флуоресцентными метками флуоресцеин-5-изотиоционатом (FITC) и 5-йодоацетамид флуоресцеином (5-IAF). Было установлено, что добавление БТШ70 приводит к значительному возрастанию флуоресценции Na,K-АТФазы, меченной FITC, и снижению флуоресцении Na,K-АТФазы, меченной IAF, что свидетельствует об изменении конформации фермента. На основании данных о положении меченных FITC (Lys 501) и IAF (Сys 457) остатков, мы сделали вывод, об изменении положения нуклеотидсвязывающего домена в состояние близкое к положению в E1 конформации. Поскольку в присутствии NaCl, переводящего фермент в E1 конформацию наблюдается существенно меньшее возрастание флуоресценции Na,K-АТФазы меченной FTIC при связывании БТШ70 мы сделали вывод о том, что БТШ 70 переводит Na,K-АТФазу в более открытую в цитозоль конформацию близкую к E1. Это подтверждается также сниженим флуоресцении комплекса Na,K-АТФазы-FITC:БТШ70 при добавлении KCl, который переводит Na,K-АТФазу в E2 конформацию. Однако при этом фермент не достигает конформации E1, поскольку добавление Na, индуцирующего полный переход в E1 конформацию, к комплексу несколько увеличивает флуоресценцию Na,K-АТФазы. Взаимодействие Na,K-АТФазы с БТШ70 усиливается в условиях стресса и предотвращает диссоциацию Na,K-АТФазы от цитоскелета. Нами было охарактеризовано влияние редокс-модификаций Na,K-АТФазы на термодинамические параметры связывания БТШ70 с Na,K-АТФазой. Установлено, что значения термодинамических параметры связывания для контрольного, дополнительно глутатионилированного и восстановленного (деглутатионилированного) препарата достоверно не отличаются. Таким образом, глутатионилирование и деглутатионилирование Na,K-АТФазы не влияют на связывание БТШ 70. При окислении наблюдалось снижение стехиометрии связывания белка, однако значения параметров связывания практически не менялось. Нитрозилирование, также как и глутатионилирование ни на стехиометрию, ни на параметры связывания не повлияло. Проведено компьютерное моделирование комплекса БТШ70 человека и Na,K-АТФазы человека. Для этого вначале на основе существующих структур были созданы модели БТШ70 и Na,K-АТФазы человека. Согласно данным, полученным нами ранее, БТШ 70 связывается с Na,K-АТФазой через меллитин-подобный участок. Был выявлен меллитин подпобный участок в БТШ 70. Затем были построены модели взаимодействия Na,K-АТФазы в конформациях Е1Р и Е2Р с мелиттином. Полученные данные были использованы для построения моделей комплекса БТШ 70 с Na,K- АТФазой. Были созданы комплексы белка БТШ 70 с Na,K-АТФазой в двух конформациях методами глобального и локального докинга. В результате были получены два типа возможных комплексов БТШ70 с Na,K-АТФазой в Е1Р конформации. Второй тип комплекса, включающий в себя не взаимодействие БТШ70 не только с цитозольной, но и с трансмембранной частью Na,K-АТФазы более вероятен, поскольку в литературе показано, что после стрессового воздействия БТШ70 взаимодействует с цитоплазматической мембраной клетки. Комплекс БТШ70 с Na,K-АТФазой в Е2Р конформации получить не удалось, поскольку в этой конформации стерически затруднен доступ взаимодействующего участка БТШ70 с сайтом DPPRA альфа-субъединицы Na,K-АТФазы. Это полностью соответствует полученным нами на предыдущем этапе проекта данным, о том, что БТШ 70 взаимодействует с ферментом в E1, а не в E2P конформации.