КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 16-19-10697

НазваниеМикросистема для анализа запаха на основе массива полевых транзисторов и олигонуклеотидных последовательностей

РуководительСауров Александр Николаевич, Доктор технических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-производственный комплекс «Технологический центр», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2016 г. - 2018 г.

Конкурс№13 - Конкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 09 - Инженерные науки, 09-709 - Нанотранзисторы и другие наноэлектронные приборы элементной базы информационных систем

Ключевые словаОбоняние, электронный нос, биомиметические системы, граница раздела фаз жидкость-газ, микрофлюидика, транзисторы, аптамеры, нейронная сеть, запах кофе.

Код ГРНТИ59.35.35

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В рамках проекта предлагается исследование возможности создания системы распознавания запахов, с конструкцией имитирующей хеморецепторные системы обоняния и вкуса, существующие в природе. Подобные системы получи название «электронный нос» (для классификации химического состава газовой смеси) и «электронный язык» (для классификации химического состава в жидкости). В современном исполнении подобные мульти сенсорные системы, как правило, представляют собой массив чувствительных элементов, обладающих либо разной химической специфичностью к компонентам смесей, либо состоящих из чувствительных элементов, работающих по разным физическим принципам. Выходной сигнал с массива, обрабатываемый алгоритмами классификации, служит некоторыми «отпечатками пальцев» для каждого конкретного химического состава смеси. В настоящее время «электронный нос» нашел ограниченное применения в пищевой промышленности, как дешевый и эффективный аналог газового хроматографа. За последние несколько лет появились несколько мобильных роботизированных систем, снабженных «электронными носами», для мониторинга и выявления различных утечек химических соединений при мониторинге экологической обстановки. Интенсивно ведутся исследования и апробация систем распознавания запахов в медицинской диагностике. Основные проблемы в более широком использовании подобных систем связывают с низкой селективностью и чувствительностью. Кроме того относительно комплексный состав массива элементов значительно усложняет производство и алгоритмы обработки сигнала, что усложняет миниатюризацию и интеграцию, а также повышает себестоимость производства систем. В рамках проекта предлагается исследовать возможность создания биомиметической микросистемы анализа запахов на основе коротких олигонуклеотидных последовательностей - аптамеров и полевых транзисторов. Так как правильная и эффективная работа большинства биологических рецепторов подразумевает связывания с целевым соединением в водном растворе, в ходе проекта предполагается реализовать двухуровневую микрофлюидную систему. Анализируемая смесь запахов будет проходить по первому уровню микроканалов и в определенных местах контактировать через гидрофобную мембрану с жидкостью в микроячейках, размещенных на втором уровне микрофлюидной системы. В микроячейках будут находиться транзисторы с иммобилизованными на сенсорной поверхности аптамерами. В качестве модельной системы для исследования будут использованы запахи различного кофе. Проект представляет собой междисциплинарное поисковое исследование на стыке наук: физики и химии полупроводников, микрогидродинамики, физической химии поверхности, биохимии, технологий микро и нанообработок. В ходе работ по проекту в едином комплексе будет рассмотрен весь цикл исследования от разработки подходов к созданию тестовой микросистемы до экспериментальных исследований с ее использованием, в том числе: 1. С учетом моделирования будет разработана и оптимизирована конструкция как чувствительных элементов на основе транзисторов, так и конструкция двухуровневой микрофлюидной системы. 2. Будет разработан комплекс технологических операций для реализации маршрута изготовления двухуровневой микрофлюидной системы с интегрированными чувствительными элементами. 3. Будут разработаны подходы к подбору биологических рецепторов с различной аффиностью и схема их иммобилизации по поверхности подзатворного диэлектрика. 4. Будут разработаны подходы построения нейроморфной сети на основе матрицы чувствительных элементов для обработки и анализа сигнала. 5. Будут разработаны экспериментальные методы исследования процессов адсорбции и растворения газовых смесей в микрообъеме на основе интегрированных в микрофлюидную систему транзисторов с олигонуклеотидами. 6. Проведение экспериментальных исследований с использованием разработанной системы с целью изучения перспективности предлагаемых подходов для создания новых сенсорных микросистем. Фундаментальное значение проекта связано с созданием теоретических основ и разработкой практических методов по построению сложных микросистем с различными интегрированными компонентами, а также с экспериментальными исследованиями протекающих в подобных системах различных физико-химических процессов.

Ожидаемые результаты
В ходе проекта предполагаются поисковые исследования подходов к созданию модельной биомиметической микросистемы анализа запахов и исследование перспективы использования подобных конструкций в качестве сенсоров нового поколения в роботизированных системах. Впервые в мире в подобном исполнении предлагается создание и исследование искусственных систем обоняния на основе взаимодействия растворенных веществ с высокоселективными рецепторами, иммобилизованными на поверхности матрицы чувствительных элементов на основе транзисторов, интегрированных в рамках единой двухуровневой микрофлюидной микросистемы. В качестве модельной системы для исследования разрабатываемой системы будут использоваться ароматы жареного кофе разных сортов. В результате работы могут быть получены как новые теоретические знания о процессах, протекающих в микросистемах (в том числе и биологических) на границе раздела фаз жидкость-газ-твердое тело, подкрепленные экспериментальными данными, так и новые знания в области практического конструирования различных гибридных био\флюидных микро- и наносистем для химического анализа. Подобный подход, с одной стороны, позволит изучить возможность улучшения селективности за счет использования биологических рецепторов, с другой стороны, изучить влияние процессов растворения газа в жидкости на микроуровне в закрытой микросистеме на остальные сенсорные характеристики. Полевые транзисторы являются стандартным элементом, формируемым при помощи микроэлектронных технологий, и различные подвиды этого транзистора широко используются в разработках «электронного носа». Олигонуклеотидные последовательности, в зависимости от своей первичной структуры, способны создавать разнообразные вторичные структуры, обладающие высокоселективной способностью взаимодействия к широкому спектру веществ. Кроме того, биохимические протоколы, получившие общее название SELEX, позволяют предварительно отбирать необходимые последовательности олигонуклеотидов к интересующим соединениям. Таким образом, меняя последовательность в структуре олигонуклеотидов, иммобилизованных на затворе полевого транзистора, возможно создавать массивы чувствительных элементов для «электронного носа» с разной аффиностью к химическому соединению. Важно отметить, что в независимости от последовательности используемых олигонуклеотидов можно стандартизировать процесс их иммобилизации на поверхность подзатворного диэлектрика. Использование стандартной кремниевой технологии для формирования чувствительных элементов на основе полевых транзисторов с различными рецепторными слоями, таким образом, оказывается универсальным решением, открывающим возможность к стандартизации схем обработки сигнала и упрощению всей системы в целом, что в конечном итоге может привести к удешевлению ее производства.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
За отчетной период были изучены возможные пути реализации микросистемы «искусственный нос» на основе полевых транзисторов и иммобилизованных на их чувствительной поверхности олигонуклеотидных последовательностей. Сформулированы новые принципы построения и функционирования, поставлены задачи, решение которых необходимо для реализации рассматриваемой системы. В рамках поставленных задач проведены предварительные теоретические и экспериментальные исследования. В качестве чувствительного элемента матрицы предложены ионно-чувствительные полевые транзисторы с плавающим танталовым затвором. Для рассматриваемых полевых структур проведена экспериментальная оптимизация условия получения чувствительной поверхности из оксида тантала и на модельной системе аптамер-тромбин экспериментально показано, что данные структуры могут быть использованы для прямого детектирования взаимодействия аптамер-мишень. С целью создания микросистемы анализа запахов, чувствительные элементы которой функционируют в жидкости, были разработаны подходы к совмещению первого уровня микроканалов, формируемых в кремниевом чипе, со вторым уровнем микрофлюидной системы, формируемым методами 3д печати на поверхности чипа в в процессе микросборки. Так как целью исследований является изучения возможности системы распознавать запахи кофе, из спектра соединений, отвечающих за формирование запаха кофе, были выбраны 4 соединения-мишени для отбора аптамеров. Был оптимизирован протокол отбора аптамеров (capture-SELEX). С использованием оптимизированного протокола был проведён отбор аптамеров к четырём мишеням. Отобранные в результате пулы библиотек случайных последовательностей ДНК показали наличие в них последовательностей, афинных к мишеням. Гарантированно успешным можно считать отбор к трём мишеням из четырёх. Для двух мишеней установлены последовательности аптамеров, ещё для одной показано их наличие в пуле отобранных последовательностей.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
При отборе аптамеров на компоненты запаха кофе были получены и охарактеризованы аптамеры на фуранеол (Fur), ванилин (Van) и 2-изобутил-3-метоксипиразин (Ibmp). Предварительная оценка эффективной константы связывания аптамеров с мишенью показала, что эффективные константы для аптамеров Van74 и Ibmp95 >7.81 мкМ, а для Fur58 >1.95 мкМ. Дополнительно при проведении Capture-SELEX были получены пулы олигонуклеотидов, обладающих аффинностью к следующим мишеням-компонентам аромата кофе: хомофуранеол, гваякол, 4-этил-гваякол, 4-винил-гваякол, 2,3-пентандион, 2,3-бутандион, 2-этил-3,5-димитилпиразин и β-дамасценон На примере полевого транзистора с плавающим танталовым затвором и аптамером Van74 были изучены сенсорные характеристики чувствительного элемента разрабатываемой матрицы. Было показано, что предел обнаружения чувствительного элемента без дополнительного усиления 1.55 × 10-7 M с линейным диапазоном от 1.55 × 10-7 M до 1 × 10-6 M. Расчетное значение эффективной константы связывания аптамера Van74 с ванилином на поверхности чувствительного элемента было определено как 9 ± 3 × 10-7 M. Исследование кросс-селективности показывает, что разработанный биосенсор может быть использован для селективного определения ванилина на фоне сопутствующих соединений. Кроме того, был изготовлен сенсор с амплификацией сигнала от взаимодействия аптамер-ванилин на основе полевого транзистора. Амплификация основана на реакции с Bsm ДНК-полимеразы. Изготовленный сенсор способен выполнять полуколичественный анализ и определять ванилин в концентрации > 1 × 10-8 M. Для изготовления электронного чипа с матрицей на основе наноструктурных полевых транзисторов с плавающим танталовым затвором в ходе разработки был решен ряд конструктивно-технологических задач (напыление и характеризация слоев тантала наноразмерных толщин; селективное плазмохимическое травление пленок тантала; интеграция тантала как материала в технологию интегральных схем; жертвенное селективное травление алюминия с фоторезистивной маской; подбор материалов и разработка технологии нанесения силановых SAM с интеграцией в технологию; выбор материала и конструкции гидрофобной мембраны; обеспечение защиты мембраны и транзисторов при резке пластин на чипы; разработка точеной функционализации чувствительных элементов; разработка технологии интеграции электрода сравнения в микрофлюидный канал). На основе разработанных технологических процессов был изготовлен электронный чип, содержащий 16 чувствительных элементов. Чувствительные элементы находятся в нижнем уровне микрофлюидной системы под гидрофобной мембранной. Первичная обработка сигналов с 16 чувствительных элементов интегрирована на уровне электронного чипа.

Публикации

1. Андрианова М.С., Комарова Н.В., Грудцов В.П., Кузнецов Е.В., Кузнецов А.Е. Amplified Detection of the Aptamer–Vanillin Complex with the Use of Bsm DNA Polymerase Sensors, - (год публикации - 2017)

2. Комарова Н.В., Глухов С.И., Андрианова М.С., Кузнецов А.Е. Usage of fluorescent labels Cy3 and Cy5 for protection of the DNA strand against degradation under λ exonuclease treatment Moscow University Chemistry Bulletin, - (год публикации - 2018)

3. Кузнецов А.Е., Комарова Н.В., Андрианова М.С., Грудцов В.П., Кузнецов Е.В Aptamer based vanillin sensor using an ion-sensitive field-effect transistor Microchimica Acta, - (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1007/s00604-017-2586-4

4. Кузнецов А.Е., Андрианова М.С., Комарова Н.В., Грудцов В.П., Кузнецов Е.В., Сауров А.Н. Detection of aroma compound by ISFET modified with aptamer 2017 2nd International Conference on Bio-engineering for Smart Technologies (BioSMART), - (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1109/BIOSMART.2017.8095326

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В третьем отчётном периоде было проведено секвенирование пулов ДНК, полученных ранее в результате отбора аптамеров по протоколу capture-SELEX. Были выбраны последовательности-кандидаты в аптамеры на хомофуранеол, гваякол, 4-этилгваякол, винилгваякол, 2,3-бутандион, 2-этил-3,5-димитилпиразин и β-дамасценон. Проведён анализ данных по изучению влияния структуры библиотеки случайных последовательностей ДНК на процесс отбора аптамеров по протоколу Capture-SELEX. Показано, что последовательности сайтов связывания праймеров оказывают существенное влияние на отбор аптамеров. Наличие частичной гибридизации между последовательностями capture-фрагмента и сайтами связывания праймерами является дополнительным фактором, увеличивающим количество побочного продукта в ПЦР-амплификации. Но при этом образующиеся дуплексы между capture-фрагментом и сайтами связывания праймеров одновременно могут стабилизировать трёхмерную структуру олигонуклеотида при его дегибридизации от зонда в присутствии мишени, фактически увеличивая количество возможных аптамеров в пуле ДНК. Разработаны три дополнительные методики изучения связывания олигонуклеотидов с низкомолекулярными мишенями: на основе специфической элюции ДНК в присутствии мишени; на основе изменения интенсивности флуоресценции интеркалирующего красителя SYBR Green I в случае специфического связывания олигонуклеотида с мишенью; на основе замедления скорости реакции расщепления одноцепочечной ДНК под действием экзонуклеазы I из E. coli в случае специфического связывания олигонуклеотида с мишенью. С использованием четырёх методов скрининга был проанализирован 61 олигонуклеотид на предмет связывания с соответствующим им мишеням (всего 8 мишеней). Выявлено 9 последовательностей аптамеров к 8 мишеням (фуранеол, хомофуранеол, гваякол, 4-этилгваякол, винилгваякол, 2,3-бутандион, 2-этил-3,5-димитилпиразин и β-дамасценон), взаимодействие которых с мишенью было детектировано на полевых транзисторах (ISFET). С использованием аптамера на фуранеол разработан и охарактеризован биосенсор для детекции фуранеола в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкМ. Аптасенсор продемонстрировал хорошую селективность по отношению к фуранеолу в сравнении с другими соединениями со схожей структурой. На примере ванилина с использованием полученного в ходе выполнения проекта аптамера на ванилин была продемонстрирована работоспособность разработанной микросистемы с ISFET и интегрированной гидрофобной мембраной в качестве биоэлектронного носа для анализа запахов. Разработанная микросистема способна детектировать пары ванилина в диапазоне концентраций от 2,7 ppt до 0,272 ppm и позволяет селективно определять ванилин в составе сложной матрицы кофейного запаха.

Публикации

1. Комарова Н.В., Андрианова М.С., Глухов C.И., Кузнецов А.Е. Selection, Characterization, and Application of ssDNA Aptamer against Furaneol Molecules, Molecules 2018, 23(12), 3159 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.3390/molecules23123159

2. Кузнецов А.Е., Комарова Н.В., Кузнецов Е.В., Андрианова М.С., Грудцов В.П., Рыбачек Е.Н., Пучнин К.В., Рязанцев Д.В., Сауров А.Н. Integration of a field effect transistor-based aptasensor under a hydrophobic membrane for bioelectronic nose applications Biosensors and Bioelectronics, - (год публикации - 2019)

3. Кузнецов А.Е., Кузнецов Е.В., Рыбачек Е.Н., Пучнин К.В., Грудцов В.П., Сауров А.Н. Development of an integrated CMOS-microfluidics for bioelectronic nose 2018 IEEE SENSORS Proceedings, - (год публикации - 2018)

4. Комарова Н.В, Кузнецов А.Е. Selection of DNA aptamers to odorous substances using Capture-SELEX protocol FEBS Open Bio, FEBS Open Bio 8 (Suppl. S1) (2018) 107–496 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1002/2211-5463.12453

5. Кузнецов А.Е., Кузнецов Е.В Биосенсор с интегрированной мембраной -, - (год публикации - )

6. - На основе ДНК создан эффективный детектор ванилина Индикатор, - (год публикации - )

7. - Российские ученые создали биосенсор для определения количества ванилина в продуктах Чердак, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
В рамках проекта была разработана принципиально новая и уникальная технология создания биосенсоров для детектирования соединений из газовой фазы. Реализованная в данном проекте концепция биоэлектронного носа обладает огромным потенциалом. Во-первых, разработанные технологии изготовления полностью совместимы со стандартной КМОП технологией без дополнительных модернизаций имеющихся производств под новые процессы, что позволяет использовать существующие микроэлектронные производства. Более того, КМОП-технология позволяет интегрировать массив датчиков ISFET с обработкой данных на одном кристалле. Кроме того, благодаря достижениям в биотехнологии SELEX, комбинация ISFET с набором аптамеров представляет собой гибкую систему, настраиваемую для определения различных запахов. Следовательно, предложенная концепция может найти практическое применение в областях контроля качества пищевых продуктов и парфюмерии, медицинской диагностики и обнаружения опасных веществ. По результатам проекта готовятся документы на подачу патентов на конструкцию микросистемы и изобретение. Информация о подаче патента будет предоставлена в Фонд дополнительно.