Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Быстрый прогресс в области нанотехнологий уже привел к появлению инновационных, а иногда и революционных приложений на основе наночастиц (НЧ, сверхмалые частицы с размерами ≤ 100 нм) в биомедицине для визуализации и направленной доставки генетического материала и лекарственных средств. Разработка аналогичных приложений в области фундаментальных и прикладных наук о растениях обещает не менее революционные достижения. НЧ обладают рядом уникальных свойств, помимо их ультрамалого размера, и в целом имеют больше преимуществ по сравнению с существующими платформами (такими, как вирусы, агробактерии или биолистика) для доставки биологически активных веществ (белков, малых РНК, РНК и ДНК) в растения для зондирования и модуляции растительных функций и процессов. Главного целью этого междисциплинарного проекта является разработка новой эффективной технологии доставки наноплатформ для редактирования генома картофеля с использованием системы CRISPR/Сas9. Эта система основана на доставке белка эндонуклеазы (Сas9) и специфической гидовой РНК в клетки растения с целью внесения целевого разрыва в последовательность гена-мишени (редактирования генома). Для достижения этой цели, в течение первого года реализации проекта (2016 г.) нами разработаны основные инструменты и методы (I) получения и (II) загрузки/функционализации НЧ биоактивными молекулами - белками и РНК и (III) доставки функционализированных НЧ (наноплатформ) в клетки растений картофеля и Nicothiana benthamiana. Мы также провели дизайн гидовых РНК для нокаута генов коилина в растениях картофеля и продемонстрировали их функциональную активность in vitro, используя ДНК-последовательность этого гена в качестве модели и важного гена интереса для дальнейшей работы. Задача 1. Создание НЧ различного состава для доставки белков и РНК в ткани картофеля и Nicothiana benthamiana и отбор наиболее перспективных кандидатов среди вариантов НЧ для доставки компонентов CRISPR/Сas9 системы редактирования генома. В качестве основы для получения наноплатформ были разработаны следующие типы НЧ: золотые наночастицы (AuNP), магнитные наночастицы оксида железа (MNP), кремниевые мезопористые наночастицы (SNP), наночастицы, состоящие из металлического ядра и оболочки из мезопористого оксида кремния (MSNP), а также наночастицы хитозана (CNP). Как и планировалось, AuNPs, MNPs и MSNPs были подготовлены в сотрудничестве с доктором Humphrey Yiu (Heriot Watt University, Edinburgh, UK). Эти НЧ были загружены модельными флуоресцентными белками (зеленый флуоресцентный белок, GFP; бычий сывороточный альбумин, меченный FITS) и флуоресцентно меченными РНК (тРНК и гидовой РНК) с использованием различных методов подготовки и функционализации НЧ. Как и планировалось, AuNPs, MNPs и MSNPs были подготовлены в сотрудничестве с доктором Humphrey Yiu (Heriot Watt University, Edinburgh, UK). Методы получения хитозановых НЧ и их загрузки биомолекулами (РНК и белка) были отработаны в нашей лаборатории. Характеристика полученных и функционализированных НЧ проводилась с использованием просвечивающей электронной микроскопии, рентгеновской порошковой дифракции, динамического лазерного светорассеяния и измерения дзета-потенциала. Эффективность загрузки НЧ карго (белок, РНК) определяли путем мониторинга флуоресценции. Примечательно, что два класса НЧ, проанализированных в этой работе, AuNPs и CNPs, показали лучшие характеристики с точки зрения доставки и выгрузки полезного карго в клетки растений. Задача 2. Разработка/оптимизация методов доставки НЧ с функциональным белком/РНК в ткани картофеля. При разработке метода доставки функциональных NPs в ткани растений мы использовали модельные растения N. benthamiana и растения картофеля. Нами были выбраны три основных метода доставки НЧ с иммобилизованными белками и короткими РНК в ткани растений: (i) бомбардмент тканей растений НЧ, связанными с флуоресцентными белками или РНК, с использованием биолистической пушки; (ii) инфильтрация или (iii) распыление суспензии НЧ. Эффективность проникновения НЧ определялась путем наблюдением за интенсивностью флюоресценции. Установлено, что два метода (бомбардмент и инфильтрация) являются наиболее подходящими для доставки биологически активных молекул (следовательно, и для доставки компонентов системы CRISPR/Cas9) в ткани картофеля, так как позволяют молекулам белка и РНК наиболее эффективно проникать в растительные клетки. Кроме того, сочетая новизну, простоту и низкую стоимость, метод инфильтрации в сочетании с новым способом подготовки НЧ, разработанным в рамках данного проекта, может представлять патентную инновацию, которая в настоящее время находится на рассмотрении. Задача 3. Сборка системы CRISPR/Cas9 и проверка ее активности на генах картофеля (ДНК) in vitro. Для проверки функциональной активности системы CRISPR/Cas9, мы разработали тестовую систему in vitro, используя представляющий практический интерес (для картофеля или других культур) ген коилина, который контролирует защитные ответы растения на заражение вирусом и абиотический стресс. В первую очередь, используя биоинформатическую прогностическую модель, мы разработали дизайн 5 последовательностей гидовых РНК, потенциально способных нацеливать протеазу Cas9 на разрезание модельного гена коилина N. benthamiana и гена коилина картофеля (с учетом наличия РАМ-сайтов и отсутствия похожих/идентичных последовательностей в других генах картофеля для того, чтобы исключить неспецифические эффекты в будущих экспериментах in vivo). Нуклеотидные последовательности были синтезированы в виде кДНК, клонированы в соответствующие плазмиды, и гидовые РНК были транскрибированы. Параллельно, нами создана кДНК библиотека картофеля, выделены и амплифицированы фрагменты гена коилина. Показано, что эти фрагменты гена коилина расщепляются белком Cas9 в присутствии синтезированной гидовой РНК. Точность расщепления ДНК подтверждена электрофоретической подвижностью фрагментов, ПЦР анализом и секвенированием. Таким образом, в 2016 году нами были разработаны инструменты (НЧ), методы (для загрузки/функционализации НЧ компонентами системы CRISPR/Cas9 и их доставки в клетки растений) и подходы (для создания и тестирования функционально активных гидовых РНК), которые являются необходимым условием успешной работы по оставшейся части проекта. Следует также отметить, что методы, разработанные в рамках проекта, имеют большое значение для доставки других соединений и генов в самые различные культурные растения.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Редактирование генома в настоящее время широко используется для научных исследований на различных эукариотических системах, включая растения и животных. Однако практические приложения геномного редактирования все еще ограничены. Одним их ограничений является отсутствие технологий доставки редакторов генома (в частности системы CRISPR/Cas) в растительные клетки без использования чужеродной ДНК (как элемента ГМО), подходящих для использования в практике. В течение 2016 г. года мы разработали технологии подобной доставки с использованием различных макромолекул белков, РНК и ДНК. Главной целью нашей работы в 2017 году было использование этих технологий для доставки системы CRISPR/Cas9 в клетки растений картофеля и тестирование ее активности как редактора генома с использованием двух генов картофеля, кодирующих фитоендесатуразу (PDS) и коилин. При выполнении этапа 2017 г. получены редактированные по гену коилина и гену фитоендесатуразы растения картофеля сорта Чикаго. Для редактирования генов системой CRISPR/Cas9 использованы разработанные нами методы доставки редактора, исключающие использование плазмид: доставка с помощью бомбардмента тканей растения предобразованным РНП комплексом CRISPR/Cas9, иммобилизованным на частицах золота, и оригинальный метод инфильтрации тканей растения наночастицами хитозана, функционализированными системой CRISPR/Cas9. Разработанный нами метод инфильтрации обладает патентной чистотой в связи с чем 12.07.2017 г. нами подана заявка на международный патент «Способ доставки биологически активных молекул в клетки растений» регистрационный номер 2017124849. Для редактирования генов фитоендесатуразы и коилина растений картофеля, нами впервые было предложено использовать апикальные зоны делящихся клеток, выделенные из верхушечных и боковых побегов картофеля размером около 100-200 мк. Ключевым преимуществом апикальной меристемы в данном случае была простота ее дальнейшей регенерации в целые растения, которая широко используется в производстве безвирусного картофеля и таким образом не требует дополнительной технологической адаптации. Для проведения экспериментов выбран сорт Чикаго как хорошо охарактеризованный по физиологическим параметрам: сорт является чувствительным к заражению вирусу PVY и легко и быстро образует регенеранты из листовых эксплантов и апикальных меристем на питательной среде. Оптимизированы условия получения растений-регенерантов после доставки в меристемные ткани нанокомплексов, функционализированных системой CRISPR/Cas9 для редактирования гена фитоендесатуразы и коилина. Факт редактирования генов картофеля подтвержден с использованием T7E1-эндонуклеазного теста, фрагментного анализа и секвенирования редактированных фрагментов генов. Проведен функциональный анализ редактированных растений картофеля. Редактированные по гену фитоэндесатуразы растения демонстрировали побеление тканей на ранних этапах развития растений. Редактированные по гену коилина растения-регенеранты картофеля анализировали в опытах по устойчивости к осмотическому и солевому стрессу и устойчивости к заражению вирусом PVY в условиях in vitro. Показано, что определенные линии редактированных растений проявляют повышенную устойчивость к осмотическому стрессу, в частности способны эффективно развивать корневую систему и частично устойчивы к солевому стрессу. Одна из линий проявила высокую устойчивость, а три линии среднюю устойчивость к заражению Y вирусом картофеля.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
При реализации проекта РНФ нами были разработаны технологии бесплазмидной доставки редактирующего РНП-комплекса Cas9-кгРНК в клетки апикальной меристемы растений картофеля и проведено тестирование ее активности как редактора генома с использованием двух генов картофеля, кодирующих фитоен десатуразу (PDS) и коилин. В 2018 г. получен российский патент «Способ доставки биологически активных молекул в клетки растений» (регистрационный номер 2663347, дата регистрации 03.08.2018). Факт редактирования генов картофеля был подтвержден с использованием T7E1-эндонуклеазного теста, фрагментного анализа и секвенирования редактированных фрагментов генов. Для детальной оценки вносимых мутаций в 2018 г. использовали метод глубокого секвенирования нового поколения (NGS) целевой области ДНК. Во всех вариантах были выявлены протяженные делеции, включающие несколько сотен нуклеотидов (около 500-600 нт). Обычно геномное редактирование ДНК системой CRISPR/Cas9 приводит к появлению вставок и/или делеций (так называемых инделей) размером менее 20 нт. Тем не менее, также были описаны более протяженные делеции (до 1500 нт). Недавно было показано, что индукция таких протяженных делеций при действии системы CRISPR/Cas9 не является редким событием, а представляет собой характерную отличительную особенность активно транскрибируемых локусов ДНК и ДНК клеток с повышенной митотической активностью. Наши данные полностью согласуются с этим наблюдением, поскольку клетки апикальной меристемы являются низко дифференцированными быстро делящимися клетками. Насколько нам известно, обнаружение протяженных делеций при редактировании генома растений ранее описано не было. Методом секвенирования нового поколения (NGS) проведена оценка возможности нецелевого редактирования с использованием кгРНК, применявшейся для редактирования гена коилина. Мутаций в выбранном участке выявлено не было, что соответствует литературным данным о низкой вероятности off-target редактирования при доставке редактирующего РНП-комплекса Cas9-кгРНК в клетки. Для увеличения эффективности редактирования был использован подход, основанный на повторной обработке частично отредактированных линий растений картофеля в условиях, аналогичных использованным при первичном редактировании. Действительно, повторное редактирование увеличило число редактированных аллелей гена коилина с одного до трех. Редактирование гена вакуолярной инвертазы с применением бесплазмидного способа доставки редактирующего комплекса в клетки меристемы картофеля также привело к появлению протяженных делеций размером около 400 нт, отсутствующих в ДНК контрольных растений, и заметному снижению уровня экспрессии гена. Пробирочные растения, редактированные по гену коилина и гену вакуолярной инвертазы, были высажены в поле на опытные делянки на естественном инфекционном фоне в июне 2018 г. на территории ООО «ДГТ» (с. Рогачево, Дмитровский район). Одна из редактированных по гену коилина линий в полевых условиях продемонстрировала повышенную устойчивость к заражению вирусом и максимальную продуктивность. Редактированные линии по гену вакуолярной инвертазы были менее устойчивы к заражению вирусом и менее продуктивны, однако содержание сахарозы в клубнях было повышено по сравнению с контрольными растениями. Знания и инструменты, полученные в ходе выполнения данного проекта, были переданы ООО «Дока–Генные Технологии» - ведущего частного селекционно-генетического центра России для использования в селекционной программе. Для последующего тиражирования полученных знаний другим потенциальным конечным пользователям для использования в программах селекции, предназначенных для практического развития новых подходов при редактировании генома 15 августа 2018 года на базе ООО «Дока-Генные Технологии» (с. Рогачево Дмитровский район, Московская область) была проведена научно-практическая конференция «Система CRISPR-Cas в редактировании геномов картофеля и других сельскохозяйственных культур» (грант РНФ №16-16-04019), которая прошла в рамках Картофельного Форума 2018, посвященного перспективным технологиям и инновациям в агроиндустрии. На Форуме был обсужден ряд важных проблем о применимости геномного редактирования в практическом растениеводстве РФ и обозначены перспективные направления развития геномных технологий