Аннотация результатов, полученных в 2016 году
За отчетный год было обследовано 30 добровольцев, здоровых и больных болезнью Паркинсона (БП), что подтверждалось показателями двигательных расстройств (согласно классификациям Hoehn, Yahr; UPDRS III). Каждый испытуемый проходил нейрофизиологическое обследование с помощью измерения электроэнцефалограммы (ЭЭГ). На данном этапе в группе больных БП отмечалось достоверное снижение спектральной мощности низкочастотной альфа-активности и тенденция к усилению активности бета2 ритма. В каждом образце крови проводили расширенное иммунофенотипирование в отдельных фракциях полиморфноядерных гранулоцитарных (PMN) и мононуклеарных (PBMС) лейкоцитов, которое включало измерение доли основных популяций иммунокомпетентных клеток (T-, B- лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов, NK-клеток), а также минорных субпопуляций, таких как двойные позитивные T-лимфоциты CD 4+8+, гамма-дельта T-клетки, активационных маркеров (HLA-DR, NKG2C), а также основных маркеров дифференцировки T-лимфоцитов и NK-клеток. Анализ экспрессии активирующего рецептора NKG2C на лимфоцитах выявил достоверное увеличение доли NKG2C- позитивных NKT-подобных клеток в группе больных БП. Еще одной субпопуляцией клеток, доля которых была увеличена в группе БП, были дважды позитивные CD4+8+ клетки. Методом проточной цитометрии в образцах PMN и PBMC измеряли уровень спонтанной внутриклеточной продукции активных форм кислорода (АФК), а методом люминолзависимой хемилюминесценции регистрировали внеклеточную фоновую и индуцированную продукцию АФК в образцах этих клеток. Во фракциях PMN и PBMC с помощью проточной цитометрии оценивали базальный внутриклеточный уровень белков теплового шока HSP70, а также его стресс-индуцированное изменение под действием гипертермии in vitro. Методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (qRT-PCR) оценивали вариации базального уровня транскрипционной активности основных генов группы HSPA (HSPA1A/B, HSPA1A и HSPA1B, HSPA6 и HSPA8), кодирующих белки HSP70. Предварительные данные свидетельствуют в пользу того, что в нейтрофилах периферической крови уровень HSP70 значительно снижен в группе больных БП по сравнению с группой здоровых доноров среднего возраста (40-59 лет), а также более старшей возрастной группой (60-89 лет), которое происходит на фоне увеличения транскрипционной активности гена HSPA8. В рамках проекта в клетках PMN и PBMC здоровых добровольцев было проведено сопоставление транскрипционной активности генов HSPA и внутриклеточного уровня HSP70 (конститутивного Hsc70 и индуцируемого Hsp70 белков). В результате были выявлены различия экспрессии белков HSP70 в анализируемых клетках иммунной системы. В лейкоцитах сравнивали базальную и стресс-индуцируемую экспрессию HSP70, а также транскрипцию генов HSPA в аналогичных условиях. В качестве модели стресса использовали гипертермию в двух режимах: мягком тепловом шоке (40°C, 1 ч), который с физиологической точки зрения допустим при воспалении и лихорадке in vivo, а также сублетальном тепловом шоке (41°C, 1 ч). В результате было обнаружено, что клетки фракций PMN (преимущественно нейтрофилы) и PBMC (лимфоциты и моноциты) значительно отличаются по профилю экспрессии как базального уровня HSP70, так и величине его роста, индуцированного нагреванием. Также различия наблюдали на уровне транскрипции генов HSPA. Экспрессия конститутивного белка Hsс70 была значительно выше в PBMC, представленных лимфоцитами и моноцитами, по сравнению с PMN. В то же время в интактных PMN внутриклеточный уровень индуцируемого белка Hsp70 был достоверно выше по сравнению с PBMC. В условиях гипертермии в лейкоцитах по-разному индуцировалась экспрессия HSPA генов. Наиболее выраженное увеличение наблюдали для индуцированных генов HSPA1A/B как в PMN, так и PBMC. Однако в PMN на фоне более низкого уровня внутриклеточного конститутивного Hsc70 по сравнению с PBMC, индуцированная транскрипция гена HSPA8, кодирующего этот белок, была значительно выше, чем в PBMC. Такие различия в транскрипции генов HSPA и внутриклеточном уровне HSP70 в различных популяциях лейкоцитов, вероятно, отражают разные потребности в функционировании пула белков-шаперонов у иммунокомпетентых клеток с разной функциональной активностью и их ролью в иммунном ответе.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Была дополнена база данных по неврологическим, психометрическим и электрофизиологическим показателям пациентов с болезнью Паркинсона (БП) и здоровых испытуемых. Достоверных различий между группами больных и здоровых по величине относительной спектральной мощности основных частотных диапазонов ЭЭГ выявлено не было. Найдено повышение относительной мощности низкочастотного альфа-ритма 8-9 Гц в правой затылочной области у больных БП посравнению с нормой (при БП 11,0+1,5%; в норме 6,0+0,9%; p<0,01). При этом отмечалась тенденция к снижению альфа-активности в основном альфа-диапазоне у больных по сравнению с нормой. Такие изменения соответствуют результатам других авторов о замедлении доминирующей альфа-активности при БП. Во фракциях полиморфноядерных гранулоцитов (PMN) и мононуклеарных (PBMС) лейкоцитов методом проточной цитометрии измеряли субпопуляционный клеточный состав, доли минорных субпопуляций NKT-подобных клеток (CD3+СD56+), ɣɗ-T-клеток, двойных позитивных Т-лимфоцитов по CD4+ и CD8+, а также некоторые активационные маркеры, основные маркеры дифференцировки T-лимфоцитов. В этих же клетках оценивали внеклеточную и внутриклеточную продукцию активных форм кислорода (АФК). Получены предварительные результаты анализа об изменениях в субпопуляционном составе лейкоцитов, степени активации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток больных БП по сравнению со здоровыми испытуемыми. В популяции CD3+ лимфоцитов доля Th-клеток (CD4+) была достоверно выше в группе больных БП по сравнению с группой здоровых добровольцев, тогда как доля цитотоксических CD8+ клеток, наоборот, ниже. Это означает, что в группе пациентов с БП наблюдается «смещение» Т-зависимых иммунных процессов по одному из наиболее важных показателей иммунного статуса – CD4+/CD8+. В субпопуляции NKT-подобных клеток (CD3+CD56+) у пациентов с БП была значительно увеличена доля HLA-DR-позитивных клеток, что свидетельствует об их активации, а также была выявлена тенденция к увеличению доли NKG2C- позитивных в группе больных БП. Анализ уровня экспрессии активирующего рецептора NKG2C на NK-клетках и NKT-подобных клетках также позволил обнаружить тенденцию к увеличению экспрессии этого рецептора на фоне протекания БП. Наши предварительные данные по степени дифференцировки CD3+ лимфоцитов указывают на то, что количество наивных клеток не различается в двух группах сравнения, однако доля наиболее дифференцированных клеток памяти с фенотипом CD197-45RA+CD27-(TEMRA), в группе больных БП достоверно снижена. Экспрессия антигена CD57, который рассматривается в качестве маркера для идентификации состояния терминальной дифференцировки, снижения пролиферативной активности T-лимфоцитов и NK-клеток, на T-лимфоцитах (CD3+CD56-) и NKT-подобных клетках (CD3+56+) оказалась у пациентов с БП статистически значимо ниже, по сравнению с аналогичным показателем в группе здоровых доноров. На основе результатов измерения уровня фоновой продукции АФК в клетках периферической крови во фракциях PMN и PBMC было показано, что данный физиологический показатель не изменяется на фоне протекания БП, однако уровень индуцированной внеклеточной продукции АФК оказался достоверно выше у больных БП, чем у здоровых доноров. В клетках фракций PMN и PBMC оценивали внутриклеточный уровень белков HSP70, а также вариации базального уровня транскрипционной активности генов группы HSPA(HSPA1A/B, HSPA1A и HSPA1B, HSPA6 и HSPA8), кодирующих эти белки. Полученные результаты позволяют сделать предварительные выводы о том, что выраженного нарушения активности шаперонной системы HSP70 на уровне белкового синтеза в периферических иммунокомпетентных клетках на фоне протекания БП не наблюдается. Однако на уровне транскрипционной активности протекание БП характеризуется усилением экспрессии стресс-индуцируемых генов HSPA. Наряду с этим, было установлено, что повышение тяжести заболевания по шкале Hoehn-Yahr коррелировало с повышением транcкрипционной активности генов HSPA6 и HSPA8 в нейтрофилах (RSpearman= 0,56, p=0,03; RSpearman=0,63 p<0,02, соответственно). Кроме того, были полученные данные, свидетельствующие о маловероятной вовлеченности внеклеточного сывороточного пула HSP70 в развитие БП. Анализ ассоциации SNPs (Single nucleotide polymorphism) c уровнем экспрессии генов белков теплового шока (как конститутивно экспрессирующегося HSPA8, так индуцируемых HSPA1A, HSPA1B и HSPA6) был проведен в некоторых образцах из выборки пациентов с БП и здоровых доноров. Полученные результаты свидетельствуют о том, что вышеописанные полиморфизмы анализируемых генов вероятнее всего нельзя рассматривать как фактор, определяющий генетически-ассоциированную индивидуальную предрасположенность к БП. Оценку активности процесса аутофагии в лейкоцитах анализировали по внутриклеточному содержанию основного маркера белка p62. Анализ данных, измеренных методом иммуноферментного анализа, показал, что в PBMC внутриклеточный уровень p62 статистически значимо выше в группе больных БП, по сравнению с группой здоровых испытуемых. Проверялась ассоциация хронической инфицированности цитомегаловирусной инфекцией (CMV) с экспрессией активирующего рецептора NKG2C на лимфоцитах и NK-клетках на фоне протекания БП. Несмотря на то, что титр антител IgG у серопозитивных испытуемых в группе больных был повышен по сравнению с группой здоровых доноров, ассоциации экспрессии активирующего рецептора NKG2C на NK-клетках, СD3+ лимфоцитах и NKT-клетках с вирусной нагрузкой CMV-инфекции на фоне протекания БП на данном этапе выявить не удалось. Анализ спонтанного и индуцированного (окислительным стрессом) развития апоптоза in vitro клеток PBMC выявил, что доля апоптозных клеток на ранней стадии развития (Anexin V+/PI-) в группе больных БП увеличена по сравнению со значениями в группе здоровых. Это достоверно выявлено и в случае спонтанного апоптоза, и в модели индуцированного апоптоза. Более глубокий и детальный анализ изучаемых взаимосвязей требует дальнейших исследований.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Обнаружен ряд характеристик клеток иммунной системы, отличающихся у пациентов с БП и у здоровых доноров. В частности, в минорной субпопуляции NKT-подобных клеток (CD3+CD56+) у пациентов с БП наблюдается тенденция к увеличению доли HLA-DR-позитивных клеток, что свидетельствует об усилении активации и пролиферации этих клеток при БП. Однако, в выборке, исследованной за текущий год, не было зарегистрировано достоверных различий доли NKG2C- позитивных NK-клеток в группе больных по сравнению с группой здоровых испытуемых. В то же время, по доли субпопуляции NKT-подобных клеток (CD3+56+), представляющих собой преимущественно высокодифференцированные Т-лимфоциты, в группе больных сохранилась выявленная ранее тенденция к снижению доли CD57 позитивных клеток по сравнению с группой здоровых доноров. В отличие от этого, для CD4+ и для CD8+ клеток в проанализированных в 2018 году образцах крови не удалось обнаружить достоверных различий по соотношению популяций наивных (CD197+, CD45RA+), а также активированных и клеток памяти (CD197-, CD45RA-/+) в двух группах сравнения. Результаты измерения базального внутриклеточного уровня HSP70 в клеточных фракциях PBMC свидетельствуют о том, что уровень этих белков в периферических клетках крови в группе больных БП не отличается по сравнению с группой здоровых доноров. Оценка базального уровня транскрипционной активности генов HSPA показала некоторые различия в группах больных БП и здоровых людей только в PBMC. Такие различия выявились только для стресс-индуцируемых генов, а именно для гена HSPA1A/B, который кодирует белки HSP70-1 и HSP70-2. В группе больных БП во фракции PBMC уровень транскрипции гена HSPA1A/B был достоверно выше, чем в группе здоровых участников исследования. В группе больных БП во фракции PBMC уровень транскрипции гена HSPA1A (относительно уровня транскрипции гена бета-актина) был выше, чем в группе здоровых участников исследования, однако значения не были достоверны . Эти результаты позволяют сделать выводы о том, что нарушения активности шаперонной системы HSP70 на уровне белкового синтеза в периферических иммунокомпетентных клетках на фоне протекания БП не наблюдается. Однако на уровне транскрипционной активности протекание БП характеризуется усилением экспрессии стресс-индуцируемого гена HSPA1A/B. На основе результатов измерения уровня фоновой и индуцированной (N-formyl-met-leu-phe) продукции АФК в клетках периферической крови во фракциях PMN и PBMC было показано, что данный физиологический показатель не изменяется на фоне протекания БП. Измерения внутриклеточного белка p62 (маркера процесса аутофагии) в PBMC показали, что содержание этого белка не отличается в группе больных БП, по сравнению с группой здоровых доноров. Результаты измерения уровня белка LC3 в фосфатидилэтаноламин-коньюгированной форме (LC3B-II) в интактных клетках, полученные методом проточной цитометрии, также не выявили различий между группой здоровых доноров и группой больных БП. Проточно-цитометрические измерения спонтанного апоптоза клеток PBMC выявил, что доля апоптозных клеток на ранней стадии программированной гибели (Anexin V+/PI-) в группе больных БП увеличена по сравнению со значениями в группе здоровых доноров, однако эти результаты не были достоверными, что можно объяснить недостаточным размером выборки, в которой проводились измерения. 66% испытуемых из выборки здоровых доноров оказались серопозитивными по IgG к CMV; процент инфицированных CMV из группы больных БП составил 100%. Вместе с тем, титр антител IgG у серопозитивных испытуемых в двух группах сравнения достоверно различался. В группе больных он был существенно выше по сравнению с группой здоровых доноров. При иммунофенотипировании измерялась экспрессия активирующего рецептора NKG2C, который, по некоторым данным, может быть связан с инфицированием CMV. Анализ взаимосвязи уровня экспрессии рецептора NKG2C на NK-клетках, СD3+ лимфоцитах и NKT-клетках с иммунным ответом на инфицирование CMV не позволяет сделать заключение о возможной ассоциации экспрессии активирующего рецептора NKG2C и вирусной нагрузки CMV-инфекции на фоне протекания БП.