Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Основной задачей проекта является разработка уникального подхода по ex vivo визуализации кальциевой активности в нервной системе с помощью создания нового вида генетически-кодируемых кальциевых сенсоров – медленных кальциевых сенсоров и применение этого нового подхода к фундаментальной нерешенной задаче нейробиологии - совмещению визуализации кальциевой и геномной активности в одних и тех же нейронах мозга в связи с протекающими в них процессами нейрональной пластичности. В 2016 году с помощью направленной молекулярной эволюции в бактериях нами были найдены и разработаны два типа генетически кодируемых зеленых кальциевых индикаторов. Эти два типа NCaMP и TnC сенсоров реагируют на Са2+ заметным изменением флуоресценции, но с медленными и быстрыми временными характеристиками, соответственно. Сенсоры медленного типа NCaMP имеют “классический” дизайн, включающий циркулярно пермутированную версию флуоресцентного белка mNeonGreen и сенсорную часть, состоящую из кальмодулина и M13-пептида из сенсора GCaMP6s. Их свойства были охарактеризованы in vitro. Они реагировали увеличением флуоресценции при связывании кальция, имели высокий контраст (7-9, 24-148 и 21-25 раз) и яркость, выше, чем у популярного сенсора GCaMP6s. Обратимые NCaMP сенсоры имели медленную кинетику, их полу-времена диссоциации-ассоциации с ионами Са2+ варьировали в пределах 5-10 мин и 2-5 мин, соответственно. Необратимые NCaMP сенсоры имели еще более медленную кинетику диссоциации от ионов Са2+, полу-время диссоциации с ионами Са2+ достигало 17 мин, но этот процесс был необратим и повторное добавление Са2+ не вызывало увеличения флуоресценции. Таким образом, в результате поиска и разработки медленных кальциевых сенсоров были найдены сенсоры, необратимо диссоциирующие от ионов Са2+ и медленные обратимые с разными временами диссоциации/ассоциации от ионов кальция. Для разработки и демонстрации возможности фиксации медленных сенсоров мы провели их фиксацию и изучили зависимость флуоресцентного контраста от времени в бактериях. После фиксации параформальдегидом медленные обратимые и необратимые кальциевые NCaMP сенсоры демонстрировали высокие контрасты между кальций-связанным и кальций-свободным состояниями 4-6 и 10-раз, соответственно. Этот контраст сохранялся неизменным по крайней мере в течение 4-х дней после фиксации. Таким образом, разработанные в проекте медленные кальциевые сенсоры NCaMP второго типа позволяют фиксировать их кальций-связанное и кальций-свободное состояния в бактериях. Свойства медленных обратимых сенсоров были охарактеризованы в животных клетках и нейрональной культуре. В животных клетках NCaMP сенсоры демонстрировали равномерную цитоплазматическую локализацию и значительно более медленную кинетику ассоциации-диссоциации с кальцием, чем у быстрых сенсоров, таких как R-GECO. Мы зарегистрировали ответ NCaMP сенсоров в ответ на электрическую стимуляцию в культурах нейронов методом пэтч-кламп. В отличие от быстрых сенсоров, таких как GCaMP6s и NTnC, в случае медленных обратимых NCaMP сенсоров электрическая стимуляция нейронов приводила к значительно более медленным ответам. Следовательно, замедление ассоциации/диссоциации ионов кальция от NCaMP сенсоров наблюдается также в нейрональной культуре. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что медленные обратимые сенсоры типа NCaMP позволят зафиксировать кальциевую активность нейронов после воздействия ex vivo. NTnC быстрый сенсор второго типа имеет новый дизайн, который сочетает преимущества сенсорной части сенсоров из семейства Twitch на основе FRET и сенсоров на основе циркулярно-пермутированных флуоресцентных белков. Мы охарактеризовали основные свойства нового интенсиометрического сенсора как in vitro, так и in vivo. NTnC обладает высокой яркостью, рН стабильностью и мономерностью благодаря входящему в его состав флуоресцентному белку mNeonGreen. При связывании ионов Са2+ уровень флуоресценции NTnC уменьшается, то есть он обладает обратным фенотипом. По сравнению с другими часто используемыми сенсорами последовательность NTnC ~ на 100 аминокислотных остатков меньше, он связывает в два раза меньше ионов Са2+. Использование полученного нами варианта белка mNeonGreen для нового дизайна кальциевых индикаторов может улучшить яркость других сенсоров на основе одного флуорофора и способствовать разработке сенсоров с белком mNeonGreen в качестве флуоресцентной части. Мы экспрессировали NTnC в клетках млекопитающих и нейрональных клетках, а также характеризовали его свойства in vivo. NTnC отражает изменения концентрации ионов Са2+, вызванных добавлением иономицина в клетках млекопитающих, и при спонтанной активности в диссоциированной нейрональной культуре. Специфичность ответа сенсора NTnC на изменения уровня ионов Са2+ подтверждали с помощью мутанта NTnC/166D+/202D+ с вставками остатков Asp по позициям 166 и 202, который не способен связывать ионы кальция. Получение такого контроля для NTnC открывает возможности для дальнейших исследований того, как различные факторы (такие как рН) могут влиять на изменение флуоресценции индикатора. С помощью метода пэтч-кламп нам удалось установить, что NTnC и GCaMP6s обладают схожей кинетикой в нейрональных культурах. Чувствительность NTnC и GCaMP6s к одному потенциалу действия также похожи. Эта чувствительность коррелирует с высокой чувствительностью NTnC к ионам Са2+ и с линейным ответом сенсора при низких концентрациях ионов Са2+ благодаря меньшему числу Са2+-связывающих сайтов. Кроме того, нам удалось показать, что экспрессия и NTnC, и GCaMP6s одинаково влияет на электрофизиологические свойства нейронов, высаженных на мультиэлектродных матрицах. Мы также исследовали возможность использования NTnC для экспериментов in vivo. Флуоресценция NTnC менялась в ответ на вызванную стимулом нейрональную кальциевую активность in vivo в зрительной коре бодрствующих мышей, которую выявляли с помощью двухфотонного микроскопа. Также с помощью сенсора NTnC и миниатюрного микроскопа nVista, установленного на голове животного, удалось зарегистрировать нейрональную активность in vivo в зрительной коре свободноподвижных животных (при этом высокая яркость и обратный фенотип NTnC облегчали установку микроскопа, предшествующей in vivo регистрации). Во время экспериментов in vivo с помощью NTnC был зарегистрирован более слабый уровень нейрональной активности, чем с помощью GCaMP6s, что может быть связано с ограниченным dF/F динамическим диапазоном NTnC. Таким образом, высокая яркость NTnC в покое и обратный ответ сенсора облегчают определение нейронов при низких концентрациях ионов Са2+, и NTnC можно использовать in vivo в тех случаях, когда фоновая флуоресценция затрудняет определение интересующих объектов. Мы надеемся, что дальнейшее развитие сенсоров наподобие NTnC, увеличение их динамического диапазона dF/F может способствовать разработке сенсоров со свойствами близкими к таковым на основе «классического» дизайна или превосходящими их. Были отработаны два подхода по визуализации активности нейронов в коре мозга мыши с помощью двух-фотонной микроскопии разработанного нами кальциевого сенсора NTnC и широко-используемого сенсора GCaMP6s. Один подход включал регистрацию и анализ кальциевой активности в соматосенсорной коре в ответ на механическую стимуляцию вибрисс бодрствующих мышей. Во втором подходе регистрировалась кальциевая активность в зрительной коре бодрствующих мышей в ответ на предъявление им комплексных зрительных стимулов в виде движущихся в разных направлениях полосах. Отработка этих методов позволила подобрать условия для успешного мониторинга кальциевой активности у животных с фиксированной головой для дальнейшей характеризации динамики медленных и быстрых кальциевых сенсоров. Был отработан метод визуализации и анализа кальциевой активности в коре мозга у свободно-подвижной мыши в ответ на предъявление стимула с помощью сенсора GCaMP6s и разработанного нами быстрого кальциевого сенсора NTnC. Отработка этого метода позволила оптимизировать условия для успешного мониторинга кальциевой активности у свободно-подвижных животных для дальнейшей характеризации динамики медленных кальциевых сенсоров с помощью миниатюрного микроскопа nVista HD.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Основной задачей проекта является разработка уникального подхода по ex vivo визуализации кальциевой активности в нервной системе с помощью создания нового вида генетически-кодируемых кальциевых индикаторов и применение этого нового подхода к фундаментальной нерешенной задаче нейробиологии - совмещению визуализации кальциевой и геномной активности в одних и тех же нейронах мозга в связи с протекающими в них процессами нейрональной пластичности. В 2017 году мы продолжили разработку зеленых кальциевых индикаторов двух типов, реагирующих на кальций изменением флуоресценции, но с медленными (sNCaMP и NTnC2) и быстрыми (FGCaMP, iYTnC, iYTnC2, и insNCaMP) временными характеристиками, соответственно. Также мы получили первые версии сенсоров, имеющих кальций-зависимое созревание, и версии замедленных фотопереключаемых CAMPARI-подобных сенсоров. Сенсоры медленного типа sNCaMP имели “классический” дизайн, включающий циркулярно пермутированную версию флуоресцентного белка mNeonGreen и сенсорную часть, состоящую из кальмодулина и M13-пептида из сенсора GCaMP6s. Лучший медленный sNCaMP-подобный сенсор, разработанный в 2016 году, имел высокое сродство к ионам кальция, не оптимальное для работы в нейронах. Нам удалось с помощью направленного мутагенеза получить версию сенсора sNCaMP, которая имела уменьшенное сродство к ионам кальция, без изменения медленной кинетики. Затем с помощью случайного мутагенеза с последующим скринингом нам удалось замедлить кинетику sNCaMP сенсора с уменьшенным сродством к ионам кальция. В результате, были найдены мутанты, имеющие полу-времена ассоциации и диссоциации от ионов кальция 0.7-1.6 и 3.8-14.4 минут, которые должны быть оптимальны для проведения экспериментов на животных с воздействием в течение 2-5 минут для насыщения сенсора ионами кальция и последующей перфузии и фиксации сенсора. Таким образом, были выбраны окончательные версии медленных sNCaMP сенсоров, оптимизированные для ex vivo фиксации кальциевой активности нейронов после воздействия. Для исследования in vivo динамики медленного кальциевого сенсора sNCaMP была использована задача механической стимуляции вибрисс и двух-фотонная микроскопия. При этом были оценены быстрая и медленная кальциевая динамика сенсора при экспрессии в нейронах 2/3 слоев бочонковых полей соматосенсорной коры. Исследование быстрой динамики флуоресценции разработанного кальциевого сенсора sNCaMP не выявило изменения флуоресценции сенсора на коротких временных отрезках. При более длительной двух-фотонной визуализации в течение часа наблюдалось снижение флуоресценции в клетках с сенсором c F/F 121±17% и полу-временем затухания флуоресценции порядка 20 минут. Таким образом, исследуемый сенсор sNCaMP имеет медленную динамику в клетках мозга мыши при прижизненной визуализации, оптимальную для ex vivo визуализации. Для проверки возможности создания медленных версий кальциевых сенсоров, имеющих кальций-зависимое созревание, мы получили рациональные и случайные бактериальные библиотеки на основе зеленых G-GECO1.2 и GCaMP6s и красного R-GECO кальциевых сенсоров. Скрининг библиотек был проведен в режиме созревания в присутствии и в отсутствие кальция. В результате нам удалось найти мутанты, которые созревали и становились флуоресцентными в бактериях только в присутствии ионов кальция в библиотеках на основе красного кальциевого индикатора R-GECO. Для оценки возможности использования разработанных кальций-зависимо-созревающих сенсоров для ex vivo визуализации кальциевой активности в мозге мышей в ответ на сенсорную стимуляцию была использована модель обогащения среды в домашней клетке. Для этого через три дня после операции экспериментальным мышам в домашнюю клетку вешали нити с бусинами, так чтобы они равномерно заполняли клетку согласно протоколу Янга с соавторами (Yang et al., 2009). Нахождение в такой обогащенной среде вызывает значительную активацию нейронов в соматосенсорной коре. Контрольных мышей оставляли в стандартных домашних клетках. Через пять дней нахождения в обогащенной среде животных перфузировали и изготавливали срезы мозга. В случае мышей, которым проводили сенсорную стимуляцию, был выявлен более высокий процент красно-зеленых клеток относительно не красно-зеленых клеток, экспрессирующих кальций-зависимо-созревающие красные сенсоры и зеленый GFP, по сравнению с контрольной группой. Таким образом, был успешно отработан протокол ex vivo визуализации кальциевой активности на срезах мозга с помощью кальций-зависимо-созревающих сенсоров. Разработанные красные кальций-зависимо-созревающие сенсоры позволяют ex vivo выявить клетки соматосенсорной области, которые проявляли специфическую кальциевую активность при длительной сенсорной стимуляции. Для разработки более медленной и контрастной версии фото-переключаемого из зеленого-в-красный кальциевого сенсора-интегратора CAMPARI были получены и проскринированы случайные бактериальные библиотеки CAMPARI. В результате были найдены мутанты, названные sCAMPARI, которые демонстрировали в 3.5-5-раз более медленную кинетику диссоциации от ионов кальция и в 2.4-12 улучшенный контраст, по сравнению с исходным CAMPARI. Замедление кинетики диссоциации CAMPARI от ионов кальция и увеличение его контраста должно повысить эффективность и специфичность его кальций-зависимого перехода из зеленого в красный при фотоконверсии, и дает возможность для разработки альтернативного подхода для ex vivo визуализации кальциевой активности. Важной целью гранта была разработка версий кальциевых индикаторов, имеющих в качестве сенсорной части кальмодулин из других организмов, отличный от кальмодулина из животных, используемого в медленных сенсорах sNCaMP. Для этого мы создали индикаторы кальция с различными комбинациями CaMs и M13-подобных пептидов или кальцинейринов из грибов Aspergillus и дрожжей Komagataella. Из этих комбинаций мы выбрали лучшую и используя направленную молекулярную эволюцию в бактериях, мы разработали новый генетически кодируемый зеленый кальциевый индикатор на основе cpFP, FGCaMP, с новой сенсорной парой M13-пептид/CaM из грибов Aspergillus. Мы охарактеризовали основные свойства этого нового рациометрического индикатора как in vitro, так и in vivo. In vitro FGCaMP демонстрирует самую высокую комбинацию яркости и динамического диапазона среди других индикаторов, таких как GEX-GECO, Pericam и Y-GECO. Он обладает и другими полезными характеристиками, такими как высокая фотостабильность, мономерное поведение и быстрая кинетика диссоциации ионов Са2+. FGCaMP имеет рациометрический фенотип, то есть при связывании ионов Ca2+ его зеленая флуоресценция большого стоксового сдвига уменьшается для его 402-формы и увеличивается для его 493-формы. В отличие от интенсиометрических кальциевых индикаторов, таких как варианты GCaMP6 и GECO, рациометрические изменения флуоресценции FGCaMP позволяют количественно измерять концентрации Ca2+ около 300 нМ в живых клетках и помогают визуализировать клетки как при низких, так и высоких концентрациях Ca2+. Используя сайт-направленный мутагенез, мы обнаружили мутации, которые увеличивают флуоресцентный ответ и сродство индикатора FGCaMP к изменениям концентрации Ca2+ в диапазоне 0-1000 нМ, которые происходят во время активности нейронов. Индикатор FGCaMP и его улучшенные версии FGCaMP2 и FGCaMP3, которые включают новую сенсорную часть из грибов, могут быть дополнительно охарактеризованы in vivo и использованы в качестве матриц для разработки индикаторов кальция, которые имеют разные флуоресцентные цвета и свойства. Мы также охарактеризовали индикатор FGCaMP в цитоплазме клеток млекопитающих и на культурах нейронов и продемонстрировали, что новая сенсорная часть обеспечивает полезную высокую мобильность. FGCaMP может надежно визуализировать изменения концентрации ионов Ca2+, индуцированных иономицином в клетках млекопитающих, или во время спонтанной активности в диссоциированных культурах нейронов. Используя эксперименты FRAP, мы обнаружили, что в отличие от стандартных зеленых индикаторов, таких как G-GECO1.2 и GCaMP6s, FGCaMP обладает высокой подвижностью в клетках млекопитающих при низких концентрациях Ca2+. Это свойство может быть выгодным с точки зрения цитотоксичности и флуоресцентного ответа в живых клетках. Используя метод патч-клампа целой клетки, мы обнаружили более быструю кинетику кальциевых ответов в нейронах, экспрессирующих FGCaMP, по сравнению с теми, которые экспрессируют GCaMP6. Мы также обнаружили, что FGCaMP показывает более низкую чувствительность к ПД, чем сенсора GCaMP6s. Эта низкая чувствительность коррелирует с более низким сродством индикатора FGCaMP к ионам Ca2+ и с более низким флуоресцентным ответом при изменениях низких концентраций Ca2+ в диапазоне 0-1000 нМ. Следовательно, использование улучшенных версий FGCaMP, таких как FGCaMP2 и FGCaMP3, может устранить это важное ограничение. Наконец, мы оценили потенциал индикатора FGCaMP для применения in vivo. Использование флуоресцентной микроскопии вместе с FGCaMP позволило успешно выявить химически-индуцированную кальциевую нейронную активность in vivo в нервной системе парализованных рыбок данио. Во время экспериментов in vivo индикатор FGCaMP продемонстрировал более низкий динамический диапазон dF/F и выявил меньше активных нейронов, чем GCaMP6f. Рациометрическая микроскопия in vivo с помощью FGCaMP позволила визуализировать покоящиеся нейроны до их активации. Важно отметить, что рациометрические флуоресцентные ответы FGCaMP могут давать количественную оценку концентраций ионов Ca2+. Мы считаем, что дальнейшее использование нового сенсорного модуля из грибов Aspergillus и калмодулинов из других видов грибов может помочь разработать улучшенные индикаторы, которые будут демонстрировать превосходные свойства, но отличные от сенсоров с обычными сенсорными частями из метазоа. Следующей целью гранта было увеличение динамического диапазона быстрого кальциевого индикатора NTnC, разработанного в 2016 году. Для достижения этой цели были опробованы три альтернативных подхода. Первый подход заключался в увеличении контраста самого сенсора NTnC с помощью проведения рационального и нескольких раундов случайного мутагенеза исходного сенсора NTnC. Позиции для рационального мутагенеза были выбраны исходя из мутаций, найденных в процессе создания сенсора NTnC и полученной нами совместно с “Белковой фабрикой” НИЦ Курчатовский институт в 2017 году кристаллической структуре комплекса NTnC индикатора с ионами кальция. С помощью направленного и случайного мутагенеза с последующим скринингом были найдены прямые и обратные сенсоры NTnC2 с in vitro контрастом 269- и 21-раз, соответственно, что было в 268- и 20-раз лучше, чем у исходного сенсора NTnC. In vitro NTnC2 сенсоры имели замедленную кинетику взаимодействия с кальцием и яркость, подобную EGFP белку. Чтобы оценить функциональность нескольких версий индикатора NTnC2 в нейронах, мы сравнили их ответ во время спонтанной активности диссоциированных нейронных культур с ответами R-GECO1 и GCaMP6f индикаторов. NTnC2 сенсоры реагировали на спонтанную активность нейронов с аналогичным или более низким ответом по сравнению с ответами R-GECO1, но со значительно более медленной кинетикой. Их медленная кальциевая динамика была визуализирована in vivo с помощью двух-фотонной микроскопии в зрительной коре мозга мыши, полу-времена затухания флуоресценции составляли порядка 40 секунд. Таким образом, нам удалось на основании кристаллографических данных для NTnC сенсора получить его версии со значительно улучшенным контрастом и замедленной кинетикой. Для увеличения контраста NTnC сенсора мы применили второй альтернативный подход. Используя направленную молекулярную эволюцию в бактериях, мы разработали NTnC-подобный сенсор с улучшенным контрастом флуоресценции и кинетикой, заменив флуоресцентную часть mNeonGreen в индикаторе NTnC на EYFP. Аналогично NTnC, разработанный индикатор, названный iYTnC, имел инвертированный ответ на ионы Ca2+. Мы охарактеризовали основные свойства разработанного индикатора in vitro, в культивируемых клетках млекопитающих и на культурах нейронов. iYTnC имел обратный фенотип, т. е. его зеленая флуоресценция уменьшалась при связывании ионов Ca2+, аналогично предшественнику NTnC. Обратный фенотип упрощает визуализацию неактивных нейронов и клеток с низкой концентрацией свободного кальция, а также облегчает установку систем для визуализации in vivo, подобных NVista. По сравнению с другими, наиболее часто используемыми индикаторами GCaMP, iYTnC был примерно на 100 аминокислот короче и имел в два раза меньше участков связывания ионов Ca2+, подобно NTnC индикатору. In vitro, при концентрации ионов Mg2+, сходной с концентрацией в нейронах, индикатор iYTnC имел флуоресцентный контраст в 2 раза выше, чем у индикатора NTnC. iYTnC показал в 5 раз меньшую яркость и аналогичную фотостабильность по сравнению с NTnC in vitro. Согласно экспериментам с остановленным потоком, iYTnC демонстрировал кинетику диссоциации Ca2+ в 10 раз быстрее или аналогичную кинетике NTnC и GCaMP6f индикаторов, соответственно. В диапазоне концентраций Ca2+ 300-1300 нМ кинетика ассоциации Ca2+ с iYTnC была в 4,6-1,3 раза быстрее, чем для GCaMP6f. Быстрая кинетика делает iYTnC перспективным индикатором для визуализации нейронной кальциевой активности in vivo. Мы экспрессировали индикатор iYTnC и охарактеризовали его реакцию в культивируемых клетках млекопитающих и нейронах. iYTnC мог достоверно детектировать изменения концентрации ионов Ca2+, индуцированные иономицином в клетках млекопитающих, и согласно флуоресцентному контрасту iYTnC превзошел NTnC в 2,2 раза. iYTnC успешно визуализировал спонтанную активность нейронов в диссоциированных культурах нейронов, аналогично NTnC GECI. Чтобы понять причину и преодолеть умеренный отклик iYTnC в нейронах, мы разработали его улучшенную версию iYTnC2. В отличие от iYTnC, iYTnC2 демонстрировал в 4-раза более высокий F/F-ответ в культурах нейронов по сравнению с iYTnC и NTnC GECI. Согласно характеристикам iYTnC2 in vitro, его улучшенный контраст в нейронах можно объяснить уменьшенной зависимостью его контраста и сродства к ионам Ca2+ от присутствия ионов Mg2+. Наконец, мы смогли успешно использовать iYTnC2 для визуализации in vivo динамики нейронов в области гиппокампа в мозге мышей. Мы ожидаем, что дальнейшая разработка сенсоров с дизайном, подобным NTnC, с целью повышения их яркости и F/F ответа в нейронах может привести к появлению индикаторов, имеющих характеристики аналогичные или превосходящие таковые у сенсоров с обычным дизайном. Другим подходом для реализации цели гранта по улучшению контраста NTnC сенсора была заменена кальций-связывающего домена NTnC сенсора на другую на основе фьюжн-белка, состоящего из кальмодулина и M13-пептида. В результате такой замены были найдены положительные и инвертированные сенсоры insNCaMP с контрастами в 70- и 20-раз лучше, чем у исходного сенсора NTnC. Они имели in vitro кинетику ассоциации-диссоциации с ионами кальция в 1.6-5 раз медленнее и 1.5-2.5 раза быстрее, соответственно, по сравнению с контрольным сенсором GCaMP6f. Таким образом, нам удалось с помощью замены кальций-связывающего домена в сенсоре NTnC получить его версии со значительно улучшенным контрастом и быстрой кинетикой.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1) Для разработки и оптимизации медленных и быстрых кальциевых сенсоров с помощью направленной молекулярной эволюции были выбраны улучшенные версии медленных сенсоров CAMPARI. Для этого были проведены 9 раундов случайного мутагенеза и направленный мутагенез с рандомизированными аминокислотными остатками по позициям M13-пептида 4, 7, 8, 9 и 10. В результате удалось получить мутант sCAMPARI-3s9#102 с флуоресцентным контрастом 47-раз и в 1.7-раз уменьшенным сродством к ионам кальция по сравнению с версией sCAMPARI, полученной в 2017 году (Kd = 78 нМ). Однако, значение константы диссоциации Kd = 78 нМ было все еще ниже оптимального значения 200 нМ. 1.2.1) В случае кальций-зависимо-созревающего сенсора pRm3-31 и pRm3-39 были охарактеризованы возможность визуализации спонтанной активности нейрональных культур. С этой целью мы трансдуцировали культуры нейронов вирусными частицами AAV (rAAV), кодирующими под контролем промотора CAG красные индикаторы pRm3-P2A-EGFP, или контрольный R-GECO1-P2A-EGFP и инкубировали культуры в присутствии или в отсутствие смеси ингибиторов нейрональной активности AP-5 и CNQX. Кальций-зависимо-созревающий индикатор pRm3 созревал в культурах в условиях спонтанной активности так же эффективно, как и в условиях, блокирующих спонтанную активность. Таким образом, кальций-зависимо-созревающий индикатор pRm3 не способен выявить спонтанную активность нейрональной культуры. 1.2.2) Была проведена попытка увеличить Kd кальций-зависимо-созревающего сенсора pRm3-31. Для этого в индикатор pRm3-31 была введена мутация F11V в М13-пептиде, чтобы вернуть аминокислотный остаток R-GECO1, имеющего пониженное сродство к ионам кальция Kd = 811 нМ. Однако, такая замена не привела к изменению Kd (Kd = 43 нМ). 1.2.3) Характеризация динамики разработанного кальций-зависимо-созревающего красного сенсора в нейронах коры мозга в течение и после предъявления стимула свободно-подвижной мыши с помощью двух-фотонного микроскопа. Для характеризации динамики кальций-зависимо-созревающего красного индикатора была использована модель обогащения среды в домашней клетке с помощью нитей с бусинами. При этом с помощью двухфотонного микроскопа были зарегистрированы кальциевые ответы нейронов 2/3 слоев бочонковых полей соматосенсорной коры. При анализе динамики флуоресценции в ходе стимуляции вибрисс не было показано значительного увеличения или снижения флуоресценции кальций-зависимо-созревающего сенсора. Таким образом, была охарактеризована динамика разработанного кальций-зависимо-созревающего сенсора в клетках бочонковых полей при длительной стимуляции вибрисс. 2) С помощью анализа кристаллической структуры кальциевого индикатора FGCaMP, имеющего в качестве сенсорной части кальмодулин из грибов, отличный от кальмодулина из животных, и нескольких раундов направленного и случайного мутагенеза была получена версия FGCaMP c улучшенным контрастом в нейронах. Основываясь на данных анализа кристаллической структуры FGCaMP, мы попытались улучшить контраст и сродство индикатора FGCaMP к ионам Са2+ путем оптимизации Са2+-связывающих компонентов гриба рода Aspergillus, входящих в состав FGCaMP, с помощью направленного мутагенеза. Наша стратегия заключалась в том, что в последовательность кальмодулина FGCaMP вводили мутации в позиции, координирующие ионы Са2+ согласно его кристаллической структуре, а также уже известные мутации, улучшающие свойства других генетически кодируемых кальциевых индикаторов. В результате скрининга мы выбрали мутант FGCaMP/N60D/D78Y/T79R/N97D/S101D, названный FGCaMP3, который отличался наибольшим сродством к ионам Са2+ (Кд1 183 нМ и 208 нМ для форм с пиком поглощения при 402 и 493 нм, соответственно), а также имел уменьшенный контраст низко-аффинной компоненты (контраст Кд2) при высоких концентрациях ионов Са2+. Так как сродство других кальциевых индикаторов к ионам Са2+ зависит от последовательности M13-подобного пептида (Helassa et al. 2015), мы создали две бактериальные библиотеки генов для мутанта FGCaMP3 с рандомизированными последовательностями в позициях 3, 4, 5 (TLH) или 8, 9, 10 (IDT) в М13-подобном пептиде. В результате скрининга библиотек с варьирующимися аминокислотными остатками в М13-пептиде был выбран мутант FGCaMP3/T3L/H5K (FGCaMP4; Кд1 93 нМ при возбуждении 493 нм), отличающийся высоким сродством к ионам Са2+ для компоненты КД1 и пониженным контрастом для компоненты Кд2 с низким сродством к ионам Са2+. Затем было проведено 6 раундов случайного мутагенеза этого мутанта. В процессе скрининга титрование клонов к ионам Са2+ проводили в присутствии 1 мМ MgCl2, для того чтобы приблизить условия скрининга к условиям в цитоплазме нейронов, а также контролировалось полу-время связывания мутантов с ионами Са2+. После 6 раундов скрининга выбранные 4 мутанта были протестированы в нейрональных культурах. Наиболее оптимальным исходя из контраста и кинетики accoциации с ионами Са2+ in vitro (Кд 204 нМ в присутствии ионов Mg2+, быстрая скорость связывания ионов Са2+, монофазная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации ионов Са2+ при возбуждении 493 нм), а также полу-времен возрастания/падения флуоресценции и ΔF/F0 (62±22%) в нейронах оказался мутант FGCaMP4 17-21 (по сравнению с рациометрическим сигналом ΔR/R0 для FGCaMP 31%). Таким образом, с помощью анализа кристаллической структуры индикатора FGCaMP нам удалось улучшать величину ответа индикатора FGCaMP в диссоциированной культуре нейронов мыши. 3) Была получена версия сенсора iYTnC2 с обратной, положительной реакцией на ионы кальция, называемая YTnC. Генетически кодируемый кальциевый индикатор NTnC обладает улучшенным дизайном из-за его меньшего размера, GFP-подобных N- и C-концов и уменьшенного в два раза количества кальций-связывающих сайтов по сравнению с широко используемыми индикаторами семейства GCaMP. Однако NTnC обладает обратным фенотипом, умеренным кальциевым ответом и низким временным разрешением. Заменив флуоресцентную часть mNeonGreen в индикаторе NTnC на EYFP и проведя 5 раундов случайного мутагенеза, нам удалось создать NTnC-подобный индикатор, названный YTnC, который обладает позитивным фенотипом, увеличенным ответом и быстрой кинетикой. Кальциевый ответ YTnC в 3 раза больше, чем ответ NTnC, а яркость YTnC в 13 раз меньше яркости NTnC in vitro. В соответствии с данными, полученными с помощью флуориметрии остановленного потока in vitro, скорость диссоциации кальция для YTnC в 4 раза выше, чем в случае NTnC. В клетках HeLa яркость YTnC в 3,3 раза ниже, чем яркость NTnC, а величина ответа в 4,9 раз больше ответа NTnC. Спонтанная активность нейронов индуцировала ответ F/F в 3.6 раз больше, чем было ранее показано для NTnC. При стимуляции нейронов ответ YTnC был в 2.6 раз меньше, чем ответ GCaMP6s. С помощью YTnC удалось визуализировать кальциевые токи в кортикальных нейронах анестезированной мыши и в гиппокампе бодрствующей мыши под одно- и двухфотонным микроскопом. Так, in vivo двухфотонная визуализация активности нейронов в зрительной коре мыши показала, что YTnC проявляет спонтанную активность в зрительной коре мышей со сходной чувствительностью, что и GCaMP6s, как в теле нейронов, так и в шипиках. Однако, оценка специфичных для зрительного сигнала ответов YTnC и GCaMP6s сенсоров выявила для YTnC 1,9-кратное снижение (p <0,0001) усредненного ответа ΔF/F 0,62 ± 0,23 по сравнению со значением ΔF/F 1,17±0,53 для GCaMP6s. Чтобы оценить, насколько индикатор YTnC пригоден для съёмки нейронной активности in vivo в однофотонном режиме мини-микроскопом (минископом) NVista HD, монтируемым на голову животного, мы визуализировали кальциевую активность нейронов поля CA1 гиппокампа свободно движущихся мышей в ходе обследования ими новой обстановки. Мы последовательно сопоставляли кальциевую активность нейронов, демонстрируемую индикатором YTnC в одном поле зрения в гиппокампе с перемещением мыши в О-образном треке. В результате, мы идентифицировали нейрон, специфически активирующийся на участке трека между 225 и 315. Таким образом, мы продемонстрировали, что YTnC может быть успешно использован для визуализации нейрональной динамики в ходе исследования животным новой обстановки и для идентификации клеток места в свободно подвижной мыши при помощи минископа NVista HD. Кроме того, YTnC превзошел GCaMP6s в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме культивируемых клеток HeLa и нейронов. В результате этого исследования в 2018 году была опубликована статья в журнале Scientific Reports: doi: 10.1038/s41598-018-33613-6 4) Была улучшена кинетика быстрых NTnC- и insNCaMP-подобных сенсоров. 4.1) Были проведены рациональный и несколько раундов случайного мутагенеза сенсора NTnC2. Полученные в 2017 году версии сенсора NTnC2 имели ограниченный контраст в нейронах вследствие их медленной кинетики связывания кальция. Чтобы улучшить скорость взаимодействия NTnC2 с кальцием, мы провели его мутагенез по позиции 222, соответствующей остатку 148 в EGFP, который расположен рядом с гидроксильной группой тирозинового кольца хромофора, стабилизировали цис-конфигурацию хромофора путем введения в позиции 222 и 239 донора протонной группы остатка серина и объемного остатка фенилаланина, соответственно, заменили остатки EEE на GGG или QQQ в тропониновой части сенсора NTnC2, удлинили оба линкера 1 и 2 на два рандомизированных остатка, а также добавили один остаток перед линкером 1 и удалили два остатква после линкера 2 с рандомизацией трех остатков в линкере 1 и одного остатка в линкере 2, по аналогии с быстрым индикатором YTnC. Однако, не один из этих подходов не привел к значительному ускорению кинетики взаимодействия с ионами кальция. Таким образом, с помощью рационального и случайного мутагенеза нам не удалось улучшить кинетику взаимодействия сенсора NTnC2 с ионами кальция. 4.2) Были проведены рациональный и несколько раундов случайного мутагенеза сенсора insNCaMP c целью ускорения его ассоциации с кальцием. В 2017 году были получены версии сенсора insNCaMP, состоящего из флуоресцентного белка mNeonGreen и фьюжн кальмодулина/M13-пептида, которые имели ограниченный контраст в нейронах вследствие не достаточно быстрой ассоциации с ионами кальция. Для увеличения скорости ассоциации insNCaMP с ионами кальция были проведены рациональный мутагенез по остатку 326, соответствующего позиции 148 белка EGFP, на остатки His, Thr или Asn, несколько раундов случайного мутагенеза, а также удлинение линкера между кальмодулином и М13-пептидом на 2 и 4 аминокислотных остатка. В результате отбора лучших вариантов, имеющих быструю кинетику связывания кальция, были разработаны окончательные версии insNCaMP4, insNCaMP7, insNCaMP9, и insNCaMP10, имеющие разное сродство к ионам кальция от 105 до 373 нМ, высокий флуоресцентный контраст на добавление ионов кальция 21-34-раза и быструю кинетику связывания-диссоциации ионов кальция. В клетках HeLa Kyoto insNCaMP9 и insNCaMP10 с Kd 198 и 373 нМ, соответственно, имеют наиболее оптимальное сродство к ионам кальция для использования в цитозоле и демонстрируют динамический диапазон и яркость, примерно одинаковые с сенсором GCaMP6s. Мы сравнили характеристики полученных индикаторов во время визуализации кальциевой активности нейронов поля CA1 гиппокампа свободно движущихся мышей в ходе обследования ими новой обстановки с помощью in vivo минископа NVista HD. Все четыре варианта имели быструю кинетику взаимодействия с Са2+, похожую или более быструю по сравнению с контрольным индикатором GCaMP6s. Оказалось, что индикатор insNCaMP7 является наиболее оптимальным для визуализации нейронной активности с помощью минископа NVista и демонстрирует соотношение сигнал/шум в 1.4-раза больше, чем индикатор GCaMP6s. Путем направленного мутагенеза по кальций-связывающим остаткам удалось получить версию индикатора insNCaMPer47, имеющего пониженное сродство к ионам кальция, подходящее для детекции изменений кальция в эндоплазматическом ретикулуме. 5) Ex vivo визуализация кальциевой активности на срезах мозга: Клетки области бочонковых полей соматосенсорной коры были заражены с помощью трансфекции вирусными частицами, несущими гены кальций-зависимо-созревающего сенсора pRm3 #39 или медленного кальциевого сенсора sNCaMP. Во всех исследуемых мышах, зараженных красным кальций-зависимо-созревающим сенсором pRm3#39-P2A-EGFP выявлено, что процент колокализации кальций-зависимо-созревающего сенсора с GFP не отличается у мышей, которым проводили стимуляцию вибрисс и у контрольных мышей. Таким образом, в повторных экспериментах с помощью разработанного кальций-зависимо-созревающего сенсора не было зарегистрировано специфического увеличения кальциевой активности в клетках бочонковых полей после длительной стимуляции вибрисс. Для мышей, зараженных медленным сенсором sNCaMP в результате анализа количества клеток (с нескольких срезов мозга) было показано, что после краткой (в течение пяти минут) стимуляции вибрисс в 42% клеток происходит увеличение флуоресценции сенсора (в отличие от 18% у контрольных животных). Таким образом, по предварительным данным (на основании двух мышей) с помощью индикатора sNCaMP с использованием ex vivo визуализации можно детектировать изменения кальциевой активности в клетках соматосенсорной коры в ответ на стимуляцию вибрисс на срезах мозга, но данный результат требует достоверного подтверждения с использованием большего количества мышей.