Аннотация результатов, полученных в 2016 году
1. Результаты исследований позволяют предполагать, что нарушения энергетических функций митохондрий и нарушения динамического актинового цитоскелета, которые наблюдаются при нейродегенеративных заболеваниях, таких как Болезнь Паркинсона, могут приводить к нарушениям нейросекреции. Ранее считалось, что мембрана везикул сливается с клеточной мембраной пассивно без затраты энергии. Наша статья опубликованная в журнале Nature Communications показывает, что переход мембраны везикулы в клеточную мембрану происходит через мембранную пору образующуюся при слиянии мембран, зависит от степени натяжения клеточной мембраны и требует энергетических затрат, гидролиза АТФ. Актиновый цитоскелет и АТФ регулируют этот процесс в нейроэндокриновых клетках и нейрональных синапсах. Со статьей можно ознакомиться на сайте: http://www.nature.com/articles/ncomms12604. Работа отмечена советом F1000Prime как внесшая важный вклад в развитие науки в своей области. 2. Эффекты нарушения метаболизма липидов клеточной мембраны, сфинголипидов, исследовались с целью поиска молекулярных механизмов контролирующих анатомию персинаптических структур. Нокаутные мыши с избирательным выключением энзима S1P-лиазы (SPL), отвечающего за деградацию сфингозин 1 -фосфата (S1P) использовались в этих экспериментах. Выключение экспрессии SPL вызывало накопление S1P и сопровождалось нарушением морфологии нервных терминалей, уменьшением числа синаптических пузырьков и экспрессии пресинаптических белков и функции синапсов. Было обнаружено, что эти структурные изменения связаны с активацией убиквитин-протеосомной системы нейронов, и в частности с уменьшением экспрессии деубиквитинирующего энзима USP14. Уровень экспрессии пресинаптических белков, USP14, а также синаптические функции восстанавливались при ингибировании протеосомальной активности. Исследования указывают, что метаболизм S1P является одним из механизмов поддерживающих нормальную морфологию межнейронных синапсов. Ряд структурных сходств в патологии позволяют предполагать наличие нарушений этого механизма в дофаминергических синапсах при удалении LMXa/b обнаруженные нами ранее. Со статьей можно ознакомиться на сайте: http://www.nature.com/articles/srep37064.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Целый ряд новых механизмов был опубликован в 2017 году: 1. Синаптические белки синуклеины входят в состав патологических включений в мозгe человека, обнаруживаемых при ряде нейродегенеративных заболеваний. В первой работе (Воронцова и др., 2018) мы провели клонирование генов синуклеинов речной миноги (Lampetra fluviatilis), гигантский ретикуласпинальный синапс которой используется в проекте качестве модельной системы. Показано наличие трех генов, и установлено большое сходство аминокислотных последовательностей синуклеинов речной миноги с синуклеинами других позвоночных животных. В результате биoинформатического анализа аминокислотных последовательностей синуклеинов речной миноги было обнаружено наибольшее сходство с гамма-синуклеинами позвоночных, а также ряд сходств с альфа-синуклеином у человека. Гидрофобный участок, связанный с образованием амилоидных агрегатов альфа-синуклеина человека, присутствует у всех трех синуклеинов миноги, что позволяет предположить, что этот участок возник на ранних этапах эволюции. Определение аминокислотных последовательностей синуклеинов в мозге речной миноги открывает новые возможности для создания методических подходов для определения физиологических функций этих белков в дальнейших экспериментах. Результаты клонирования сохранены в базе данных NCBI. 2. В ходе исследований обнаружено, что нарушение молекулярных взаимодействий может приводить к образованию белковых агрегатов в синапсах. В эти агрегаты могут входить синуклеин и комплекс белков-скаффолдов, который включает интерсектин. Мы исследовали синаптическую функцию этого скаффолдного белка. Синапсические пузырьки сливаются с пресинаптической мембраной и выделяют нейропередатчик в активной зоне синапса. Чтобы поддерживать этот процесс синаптический пул везикул готовый к слиянию с пресинаптической мембраной должен пополняться из резервного пула. Синапсин играет важную роль в организации резервного пула визикул. Как восполняется этот пул было неизвестно. Мы обнаружили, что белок-скаффолд интерсектин (Intersectin) функционирует как важный регулятор этого процесса. Мы показали, что он взаимодействует с синапсином, с помощью Src-homology 3 A домена, и что это взаимодействие координируется внутримолекулярным «выключателем» находящейся в самой молекуле интерсектина. Вылючение генов интерсектина меняет распределение синапсина I и вызывает нарушение синаптической передачи при длительной стимуляции. Это нарушение можно восстановить экспрессией интерсектина I в нокаутных нейронах. Экспрессия мутантного интерсектина, находящегося в закрытой форме, не восстанавливает функцию. 3. Мы также исследовали другую функцию скаффолдного комплекса белков, в который входит интерсектин.. Мы обнаружили, что F-BAR белок Nervous Wreck (Nwk), контролирующий форму мембранных образований в клетке, перемещается из пула синаптических пузырьков в периактивную эндоцитозную зону синапса во время стимуляции. Мы показали, что в этом процессе участвует скаффолд Dap160/интерсектин, который взаимодействует с Nwk с помощью SH3 С домена. Это взаимодействие стимулирует связь Nwk с мембраной in vitro. У мутантов, у которых это взаимодействие нарушено, или у которых Nwk не может связываться с мембраной наблюдается нарушение морфологии синапса и накопление синаптических везикул разного диаметра. При стимуляции в синапсах происходит накопление мембранных цистерн и клатриновых пузырьков различного диаметра, что указывает что везикулы разного диаметра образуются в результате клатрин-опосредованного эндоцитоза. Таким образом, рекрутирование F-BAR белка интерсектином в синапсе важно для формирования синаптических пузырьков одинакового диаметра. 4. Хромаффинные нейросекреторные клетки, которые использовались в проекте в качестве модельной системы выделяют целый ряд активных веществ, среди которых катехоламины: адреналин (эпинефрин), норадреналин (норэпинефрин), а также дофамин. Ранее считалось, что эти клетки не происходят от клеток нервного гребня. Показано, что хромаффинные клетки происходят в эмбриогенезе от стволовых клеток прекурсоров периферической глии, Швановских клеток. Они мигрируют вдоль висцерального моторного нерва в область формирующихся надпочечников, где они теряют связь с нервом и дифференцируются в хромаффинные клетки. Показана карта их миграции вдоль периферических нервов на различных стадиях развитиях и идентифицированы сигнальные механизмы контролирующие активацию и торможение генетических программ при дифференцировке клеток. Все это позволяет по-новому взглянуть на развитие эндокринной системы млекопитающих, включая человека.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Физический принцип разграничения жидких фаз (liquid-liquid phase separation) признан одним из основных механизмов лежащих в основе компартментализации живых клеток. Недавние исследования проведенные с изолированными белками позволяют предполагать, что организация синоптических пузырьков в кластеры основана на этом физическом принципе (Milovanovic and De Camilli, Science 2017). Для проверки этой гипотезы в живом синапсе мы использовали гигантский ретикулоспиншальный синапс миноги. Мы обнаружили, что нарушение взаимодействий D-участка молекулы синапсина, которая участвует в формировании "жидкой фазы" синопсиса приводит к разрушению кластеров пузырьков в состоянии покоя, при отсутствии синаптической активности. Реагенты нарушающие SH3 взаимодействия синаптических белков при этом были неэффективны. Наши эксперименты указывают, что синаптические пузырьки в живом синапсе представляют отдельную "жидкую фазу" сформированную в результате взаимодействий D-участков молекул синапсина. Используя гигантский синапс миноги в качестве модельной системы мы оказали, что скаффолдный белок интерсектин 1 (ITSN1) регулирует функцию синапсина во время синаптической активности образуя комплекс с этим белком. Как и в синапсах млекопитающих ITSN1 является компонентов экстравезикулярного матрикса у миноги. SH3A (Src-homology 3 A) домен интерсектина участвует в формирование белкового комплекса с D-участком синапсина. Взаимодействие регулируется конформационным изменением в молекуле ITSN1. Микроинъекции антител, взаимодействующих с SH3A доменом не нарушают структуру кластера при отсутствии синоаптической активности, однако приводят к разрушению кластера когда синапс активен. Наши исследования показывают, что SH3A домен обеспечивает связывание фосфорилированного синапсина, когда он диссоциирует от пузырьков при синаптической активности и обеспечивает эффективное восстановление кластеров освобождая синапсин в состоянии покоя. Таким образом мы обнаружили молекулярный механизм контролирующий организацию синаптических пузырьков в кластере при синаптической активности. (Shupliakov et al., 2018; Shupliakov 2019; paper submitted, under revision) Мы описали ранее неизвестную организацию пузырьков в кластеры в аксонах позвоночных. С помощью электронной микроскопии мы обнаружили белковые агрегаты организованные в виде фибрилл, окруженных синаптическими пузырьками, и связанными с ними тонкими филаментами. Фрагменты таких кластеров былы обнаружены в резервном пуле отдельных синапсов после стимуляции. Похожие структуры образуются в результате нарушения взаимодействий синанпсина в синапсах. (Sopova, Shupliakov, 2018; Manuscript). Cтруктурные изменения в дофаминергических синапсах, вызванные удалением LMX1b связывали в первую очередь с аутофагией митохондрий и нарушениям их функций (например, Doucet-Beaupré et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2016)., Действительно аутофагосомы, содержащие митохондрии, присутствуют в гигантских нервных окончаниях, образующихся при условном нокауте LMX1b. Мы показали, что условное селективное удаление митофюзина 2 (conditional knockout) в дофаминергических нейронах приводит к их гибели. В тоже время образования гигантских терминалей и белковых агрегатов в синапсах в стриатуме не наблюдалось. Это позволяем предполагать, что мишенью в случае условного выключения LMX1b является некоторый цитоплазматический белок(и) в цитоплазме нервных клеток. Наши эксперименты позволяют предполагать, что кластеры синаптических пузырьков в определенных условиях могут являться источником патологических белковых агрегатов предшествующих образованию амилоидных структур. Мы предполагаем, что нарушения в пресинаптических молекулярных механизмах а также определенных сигнальных путей связывающих синапс с ядром клетки лежат в основе ранней патологии болезни Паркинсона. Разработка этой концепции, а также обзор последний данный поддерживающих эту гипотезу представлены в наших обзорных статьях, опубликованных в 2018 году (Brodin, Shupliakov, 2018; Sopova et al., 2018).