Аннотация результатов, полученных в 2016 году
С целью изучения механизмов височной эпилепсии и разработки математической модели синхронизованной активности нейронов мы опробовали несколько экспериментальных моделей эпилепсии в первичной культуре нейронов и на срезах мозга, и выбрали наиболее надёжные, приводящие к возникновению хорошо воспроизводимых эпилептоподобных состояний. Эти индуцированные эпилептоподобные состояния были исследованы методами электрофизиологии и оптической визуализации. Мы описали наблюдаемые режимы эпилептиформной активности, определили насколько локализованной она является. Полученные регистрации были обработаны как традиционными так и новыми методами, что позволило получить новые данные о синаптических сигналах, которые получают клетки в ходе интериктальных разрядов. Это позволило нам составить гипотезы о механизмах генерации этих разрядов и сформулировать математическую модель для каждого из основных режимов интериктальной активности. По результатам применения разработанного математического описания эпилептоподобных вспышек мы сформулировали задачи проверки гипотез в будущих экспериментах. На данном этапе, изучение было сосредоточено на активности, наблюдаемой в очаге разрядов - энторинальной коре; экспериментально-модельное описание ограничивалось квазистационарными режимами и не затрагивало механизмов перехода из одного режима в другой. Основные полученные результаты не только способствуют раскрытию механизмов эпилептических разрядов, но и относятся к разработке новых методик анализа экспериментальных данных и математического моделирования. На экспериментальной модели височной эпилепсии с использованием первичной культуры нейронов коры головного мозга крысы и удалением из среды ионов магния показано, что с увеличением срока культивирования наблюдается рост числа нейронов, в которых регистрируются эпилептиформные токи (ЭТ) [Сибаров и др. 2016]. Показано, что использование агонистов NMDA-рецепторов в низких концентрациях вызывает рост частоты миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов и их постепенную синхронизацию, приводящую к формированию ЭТ. Отсутствие блокирования ифенпродилом ЭТ при сохранении его подавляющего эффекта на токи целой клетки, вызываемые NMDA, говорит о ключевой роли резистентных к его действию синаптических NMDA-рецепторов, содержащих GluN2A, в генерации ЭТ. Мы полагаем, что возникновение ЭТ в культуре нейронов и постепенный рост их амплитуды с увеличением срока культивирования идет параллельно с ростом числа синаптических связей и заменой субъединицы GluN2B на GluN2A у NMDA-рецепторов в синапсах. В экспериментальных моделях с использованием кортико-гиппокампальных срезов были подобраны сочетания про-эпилептогенных факторов (повышенная концентрация ионов калия, сниженная концентрация ионов магния, частичная блокада потенциал-управляемых калиевых каналов), приводящие к быстрому возникновению хорошо воспроизводимых режимов эпилептоподобной активности [Amakhin et al. 2016]. С помощью одновременной пэтч-кламп регистрации двух клеток была зарегистрирована синхронная активность нейронов глубоких слоев энторинальной коры во время эпилептиформных разрядов. В аналогичных экспериментальных условиях была зарегистрирована сихронная активность с помощью оптической визуализации свободного внутриклеточного кальция в нейронах. Визуализация позволила выявить очаг синхронной активности нейронов в III-V слоях энторинальной коры. Паттерны синхронной активности с режимами интериктальных и иктальных разрядов аналогичны наблюдаемым у пациентов, страдающих эпилепсией височной доли. Мы оценили AMPAR-, NMDAR- и GABAAR-опосредованные проводимости интериктальных разрядов (IID) двух типов. Оригинальная методика оценки синаптической проводимости была основана на различиях вольт-амперных характеристик синаптических компонентов. Новый метод оценки трёх синаптических проводимостей, AMPA, NMDA и GABA, основан на многократных регистрациях в режиме фиксации потенциала на разных уровнях. По данным многократных регистраций хорошо воспроизводимых событий решается обратная задача нахождения трёх значений проводимостей в каждый момент времени при известных по предварительным измерениям вольт-амперным характеристикам каждой из компонент. Полученная для интериктальных разрядов динамика синаптических проводимостей показала, что первый тип интериктальных разрядов (IID1) определяется активностью GABAAR каналов с деполяризованном потенциал реверсии. Второй тип интериктальных разрядов (IID2) определяется взаимодействием между возбуждением и торможением, с ранним GABAaR- и следующими за ним с задержкой AMPAR- и NMDAR-опосредованными компонентами. Вклад этих компонентов в IID подтверждён тестированием с их внутриклеточной фармакологической блокадой. Эти данные дают новое понимание механизмов генерации интериктальных разрядов. Сформулирована и реализована биофизически-детальная математическая модель взаимодействующих нейронных популяций с учётом натрий-калий-хлорного гомеостаза в условиях генерации эпилептических разрядов в очаге генерации. Для двух различных режимов генерации интериктальных разрядов IID1 и IID2, в условиях фиксированных ионных концентраций модель воспроизводит экспериментально зарегистрированные синаптические токи и синаптические проводимости и даёт предсказания о ключевых механизмах генерации этих разрядов. Основными механизмами IID1-разрядов являются: - рекуррентное возбуждение сети интернейронов посредством деполяризующих GABA-синапсов; - подпороговая деполяризация возбуждающих нейронов интернейронами; - синаптическая депрессия GABA-синапсов. Основными механизмами IID2-разрядов являются: - спонтанное возбуждение сети интернейронов; - сверхпороговая деполяризация возбуждающих нейронов интернейронами; - рекуррентное возбуждение возбуждающих нейронов посредством глутаматергических синапсов; - синаптическая депрессия. Таким образом, в условиях выбранной экспериментальной модели эпилепсии на кортико-гиппокампальных срезах главную роль в генерации IID играет синхронизация сети ГАМК-эргических интернейронов, а основным фактором, определяющим длительность каждого разряда - синаптическая депрессия. Отлаженная экспериментальная методика и развитая математическая модель позволяют нам в следующем году перейти к исследованию циклических переходов из состояния интериктальной активности в иктальную и обратно. По результатам проекта опубликовано 2 статьи в журналах Frontiers in Cellular Neuroscience и Биологические мембраны. Кроме того, 1 статья подана на рассмотрение в журнал Biological Cybernetics, и ещё 1 подготовлена к публикации.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В 2016 году мы освоили экспериментальную модель эпилепсии и начали наблюдать электрические разряды на срезах мозга крыс при помещении их в проэпилептический раствор. С помощью электрофизиологических методик мы изучили разряды, которые происходят во время судорог (иктальные разряды, ИР) и в интервалах между судорогами (интериктальные разряды, ИИР). В 2017 году мы сформулировали две математические модели, описывающие механизмы этих разрядов и провели эксперименты, требующиеся для подтверждения тех предположений, которые легли в основу моделей. Первая модель, относящаяся к классу моделей взаимодействующих нейронных популяций и выраженная уравнениями в частных производных, описывает ИИР трёх типов. ИИР-1 характеризуются тем, что обусловлены только активностью интернейронов. Интернейроны оказываются возбуждающими при патологическом накоплении ионов хлора внутри тех клеток, с которыми они образовывают контакт. ИИР-2 также инициируются интернейронами, которые затем вовлекают в генерацию принципиальные нейроны. Математическая модель подтверждает работоспособность этих патологических механизмов и проясняет то, что каждый начавшийся разряд завершается по причине истощения ресурса медиатора в пресинаптической части синаптического контакта [Chizhov et al. // PloS One 2017]. В свою очередь, дополнительные эксперименты подтвердили выводы модели. ИИР-3 наблюдаются в других условиях, когда в исходный проэпилептический раствор добавлены фармакологические блокаторы всех типов возбуждающих и тормозных синаптических рецепторов, кроме одного, AMPA. В этих условиях, ИИР-3 определяются только рекуррентным возбуждением принципиальных нейронов, синаптической депрессией и медленными калиевыми токами спайковой адаптации. Этот механизм подтверждается моделью, а она проясняет зависимость формы ИИР-3 от разных факторов [Чижов и др. // ДАН 2017]. Вторая модель относится к классу простых моделей на основе обыкновенных дифференциальных уравнений. Она учитывает только самые значимые процессы, но может совокупно воспроизводить ИИР и ИР, причём в терминах экспериментально измеряемых сигналов. Это её достоинство позволяет рассматривать её как альтернативу известной, но абстрактной модели Эпилептор, восстребованной во множестве приложений вплоть до медицины. Планируется, что статья об этой модели будет опубликована в следующем году [Chizhov et al. // submitted to PloS CB]. Кроме того, мы выясняли роль глутамат-глутаминового цикла обращения медиатора в генерации ИР и пришли к выводу, что этот фактор не является определяющим. Тем не менее, была сформулирована до этого не существовавшая модель динамики переходов глутамата и глутамина в системе нейрон-астроцит-внеклеточное пространство. Модель позволила сопоставить характерные времена процессов и убедиться в том, что цикл обращения глутамата не является «узким местом», а значит не влияет на форму, частоту и само существование ИР. Этот вывод подтвердился в наших экспериментах. Однако, роль цикла может оказаться иной в условиях энергетического дефицита или нарушения работы определенных ферментов, что может быть изучено с помощью предложенной модели. Мы выделили в отдельную подзадачу изучение влияния неинактивирующегося натриевого тока (NaP) на отдельный нейрон [Smirnova et al. // Studies in Computational Intelligence 2017]. Роль этого тока в эпилепсии обсуждается в литературе. В эксперименте мы сымитировали эти токи с помощью методики динамического управления реальным нейроном с помощью компьютерной модели. Таким образом мы обнаружили, что NaP-токи не только делают нейрон более возбудимым при низких входных токах, но и приводят к более раннему срыву генерации спайков при больших токах – деполяризационному блоку. Затем мы воспользовались известной математической моделью нейрона типа Ходжкина-Хаксли, сравнили модель с экспериментом, выяснили их качественное соответствие и охарактеризовали бифуркации перехода в режим генерации и в деполяризационный блок. Согласованное модельно-экспериментальное исследование позволило подтвердить полноту наших представлений о механизмах основных типов интериктальных разрядов и предложить обобщенное описание о механизма генерации иктальных разрядов.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Основным результатом нашего теоретико-экспериментального изучения эпилепсии является описание механизмов патологической активности, выраженное в виде математических моделей. Такое описание верифицировано сопоставлением словесных представлений, полученных на основе экспериментов, и количественных экспериментальных данных с расчётами. Тем самым, математическая модель представляет собой конечную формулировку описания физиологических механизмов. Однако, сложность подробного математического описания требует построения как полных, так и упрощенных моделей. И те и другие были развиты в нашем проекте. Была развита модель взаимодействующих нейронных популяций, подробно описывающая динамику ионных концентраций. Сочетание эффективного метода моделирования нейронной возбудимости – популяционной модели на основе уравнения для рефрактерной плотности (conductance-based refractory density - CBRD) – с учётом всех факторов ионного транспорта позволило предложить более полную модель, чем известные по литературе. Расчёты согласуются с экспериментальными записями эпилептической активности в комбинированных срезах гиппокампа-энторинальной коры головного мозга крыс в высококалиевом и низкомагниевом растворе, содержащем 4-аминопиридин. Модель и эксперименты указывают на гетерогенность популяции возбуждающих нейронов; одна часть из них обладает нормальными, тормозными ГАМК-синапсами, а другая – патологическими, возбуждающими, что происходит из-за накопления хлора внутри нейронов. Система из двух популяций глутаматергических нейронов и одной популяции интернейронов воспроизводит наблюдаемые повторяющиеся иктальные разряды, состоящие из кластеров интериктально-подобных событий. Моделирование позволило выявить вклад различных ионных механизмов в генерацию разрядов. Переходя к вопросу о механизме распространения разрядов по нервной ткани, с помощью двухэлектродных регистраций методом патч-кламп мы экспериментально обнаружили, что характер распространения интериктальных разрядов (ИИР) зависит от их типа. ГАМК-глутаматные и доля ГАМКергических ИИР распространяются как волны, сохраняя форму и обладая скоростью порядка десятков мм/с (40 и 20 мм/с, соответственно). Модель, основанная на CBRD-подходе, хорошо согласуется с экспериментальными данными и визуализирует кластеры синхронной активности интернейронов, из которых образуются фронты волн. Моделирование, согласующееся с экспериментальными наблюдениями, показывает, что волнообразное распространение ИИР, инициированное интернейронами, определяется локальной синаптической связностью в условиях деполяризующего ГАМК. Однако, также важным является то, что механизм генерации ИИР одинаков в пространственно-распределенной и однородной моделях, т.е. пространственная распределенность связей между нейронами не является необходимым фактором существования разрядов. Анализ экспериментов и полных моделей привёл нас к заключению, что простейшая модель, воспроизводящая иктальные и интериктальные разряды, может описывать только одну популяцию нейронов и должна отражать динамику четырех характеристик - уровня поляризации нейронов, концентрации ионов калия в межклеточном пространстве, концентрацию ионов натрия внутри клеток и синаптический ресурс. Такая модель, названная нами «Эпилептор-2», оказалась успешной и хорошо согласующееся с экспериментами, многие из которых показывают, что иктальные разряды, длящиеся несколько десятков секунд, представляют собой кластеры более коротких разрядов. Эти короткие разряды подобны интериктальным, которые могут происходить и вне периодов иктальной активности, но тоже порождаются патологической синхронизацией нейронов. Они, в свою очередь, представляют собой вспышки спайковой активности на долю секунды. Как нам удалось показать, в условиях повышенного возбуждения, например при повышенном содержании калия в межклеточном пространстве, короткие вспышки возникают как спонтанные высокоамплитудные осцилляции в системе колебаний нейронного возбуждения и синаптического ресурса. Кластеризация коротких вспышек происходит под действием осцилляций ионных концентраций. Выходя из нейронов во время спайковой активности, калий по принципу обратной связи деполяризует нейроны. Однако ионы натрия, накапливаясь в клетках, вызывают активацию натрий-калиевых насосов, которые восстанавливают градиент калия, останавливают разряд и определяют паузу в несколько минут до следующего иктального разряда. Для описания всего процесса оказалось достаточным системы из четырёх обыкновенных дифференциальных уравнений, не считая дополнительного уравнения для «регистрируемого» нейрона. Универсальность, простота и интерпретируемость в физиологических терминах делают предложенную модель уникальной. Переходя к вопросу о механизме распространения иктальных разрядов по нервной ткани, мы предположили, что таким механизмом является диффузия ионов калия во внеклеточном пространстве. Выход калия из нейронов во время разряда локально увеличивает ионную концентрацию, которая затем выравнивается и приводит к деполяризации соседних нейронов. Добавив уравнение диффузии в модель «Эпилептор-2», мы обнаружили сходство расчётных характеристик распространяющейся активности с экспериментальными, полученными методом оптических регистраций. Начавшись, режим генерации эпилептических разрядов имеет тенденцию к закреплению. Поэтому важным было ответить на вопрос о том, какие перестройки, ведущие к усилению возбудимости, происходят в нервной ткани под воздействием судорог. Нами был выявлен главный фактор таких перестроек – увеличение AMPA-рецепторной синаптической проводимости во время и после эпизодов индуцированной эпилептиформной активности. Исследование вызванных ответов пирамидных нейронов энторинальной коры in vitro модели судорожных состояний показало, что 15 минут эпилептической активности приводит не только к приросту амплитуды АМПА-рецептор-опосредованного компонента вызванного ответа, но также к усилению полисинаптических ГАМКа- и НМДА-рецептор-опосредованных компонент. Однако математическое моделирование с помощью популяционной CBRD-модели помогло установить, что практически только потенциация АМПА-рецепторов определяет все остальные изменения ответов нейронов. Наблюдаемое увеличение АМПА-рецептор-опосредованной синаптической проводимости зависит от активации НМДА-рецепторов, что указывает на возможность его реализации по механизму классической долговременной потенциации. Наблюдаемое увеличение сохраняется не менее 15-и минут после прекращения эпилептоподобной активности и частично опосредовано встраиванием кальций-проницаемых АМПА-рецепторов в постсинаптическую мембрану пирамидных нейронов. Полученные результаты показывают, что описанная потенциация АМПА-рецепторов в сочетании с вызванной проэпилептическим раствором ГАМК-опосредованной деполяризацией опосредует повышенную возбудимость нейронной сети, является фактором поддержания эпилептического статуса, а значит, может являться мишенью антиэпилептического воздействия.