Аннотация результатов, полученных в 2016 году
На ультратонких срезах ткани печени и сердца крыс с помощью антител к белку-каналу ROMK, одному из претендентов на роль митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала (митоКАТФ), проведено электронно-микроскопическое исследование мест локализации и распределения в клетке белка ROMK. Показано, что в тканях сердца и печени крыс этот белок локализован на мембранах крист митохондрий, а его распределение различается в гепатоцитах и кардиомиоцитах. Гранулы коллоидного золота относительно равномерно располагаются на мембранах крист митохондрий гепатоцитов. В кардиомиоцитах количество гранул было значительно меньше, чем в гепатоцитах, локализованы они также на мембранах крист митохондрий и ограничены только центром митохондрий. В экспериментах на крысах линии Вистар, на модели ишемии/реперфузии миокарда (длительность ишемии 30 мин, реперфузии – 120 мин) изучено кардиопротекторное действие уридина и УМФ, которые являются предшественниками метаболического активатора митоКАТФ. Показано, что препараты при двукратном внутривенном введении за 30 мин до ишемии и за 5 мин до реперфузии в дозе 30 мг/кг уменьшали зону некроза в миокарде на 35% и 46% соответственно. Они оказывали защитное действие на метаболизм миокарда, стабилизируя энергетический обмен, ограничивая процессы липопероксидации и улучшая состояние антиоксидантной системы. Селективный блокатор митоКАТФ каналов 5-гидроксидеканоат (5 мг/кг, внутривенное введение) уменьшал защитное действие уридина и УМФ, что свидетельствует об участии этих каналов в механизме реализации антиишемического эффекта препаратов. Уридин и УМФ (30 мг/кг, внутривенное введение) на модели ишемии/реперфузии (ишемия 5 мин, реперфузия 30 мин) оказывали как антиаритмическое, так и проаритмогенное действие. Антиаритмический эффект проявлялся в уменьшении частоты возникновения фибрилляции желудочков сердца, уменьшении в 2-3 раза продолжительности желудочковых тахикардий и сокращении числа эпизодов их возникновения. Негативным последствием применения препаратов являлось увеличение случаев фибрилляции желудочков, заканчивающихся летальным исходом. Предварительное введение селективного блокатора митоКАТФ каналов не позволило с уверенностью говорить о роли этих каналов в реализации антиаритмического или проаритмогенного действия уридина и УМФ. Возможно, оба препарата активируют как митохондриальные, так и саркоплазматические АТФ-зависимые калиевые каналы. Этот аспект кардиотропного действия уридина и УМФ требует дальнейшего исследования. В работе изучено влияние уридина на цитокиновый профиль в крови, экспрессию белка теплового шока HSP72 и активность сигнального пути NF-kB в клетках селезенки мышей линии Balb/c с острым воспалением, вызванном внутрибрюшинным введением липополисахарида (ЛПС) из грамотрицательных бактерий E.coli. Уридин вводился внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг веса животного за 1 час до внутрибрюшинного введения ЛПС. Показано, что введение уридина нормализует повышенный уровень цитокинов (TNF-альфа , IFN-γ, IL-1альфа, IL-2, IL-6) в крови опытных животных. Установлено многократное возрастание продукции Hsp72 в клетках селезенки мышей в условиях острой интоксикации, тогда как предварительное введение уридина вызывало полную блокировку продукции этого белка. Обнаружено, что при введении ЛПС повышается уровень фосфорилированной формы NF-κB и активность киназы IKK, способной фосфорилировать свободные субъединицы ингибиторного белка IkB, а применение уридина снижало наблюдаемые эффекты. Таким образом, впервые установлена противовоспалительная активность уридина при остром воспалении, вызванным эндотоксином in vivo. Механизм обнаруженного защитного действия уридина при развитии бактериальной интоксикации организма требует дальнейших исследований. У крыс линии Крушинского-Молодкиной (КМ), реагирующих интенсивным судорожным припадком в ответ на звук (аудиогенная эпилепсия), проанализированы особенности функционирования митохондрий клеток мозга и печени крыс. Значительных изменений параметров дыхания в митохондриях мозга и печени КМ и контрольных крыс обнаружено не было; однако, эффективность синтеза АТФ в митохондриях крыс КМ была на 10% ниже. У крыс с аудиогенной эпилепсией концентрация маркера окислительного стресса малонового диальдегида в митохондриях головного мозга (но не печени) была в 2 раза выше, чем у контрольных крыс. Скорость образования H2O2 в митохондриях мозга крыс КМ была в два раза выше, чем у контрольных животных при использовании НАД-зависимых субстратов. Эта разница была менее выраженной в митохондриях печени. У крыс КМ, АТФ-зависимое набухание было на 30% ниже, чем этот показатель в митохондриях печени контрольных крыс. Исследование ионного обмена показало более низкую способность митохондрий крыс с аудиогенной эпилепсией удерживать ионы Са2+. Совокупность литературных и полученных в работе данных указывает на участие митохондриального калиевого канала в механизме генерации судорожных состояний у крыс. Введение уридина в дозах 0,3 и 3 мг/100 г массы тела половозрелым белым лабораторным крысам-самцам линии Вистар перед острогипоксическим воздействием (7% О2 в N2 в течение 30 мин) приводит к активации морфогенеза митохондрий в миокарде, способствует повышению сохранности мембран митохондрий, что является непосредственным защитным эффектом в отношении развития вторичной тканевой гипоксии. Активация АТФ-зависимых митохондриальных калиевых каналов с помощью уридина при острой гипоксической гипоксии усиливает также процесс образования микромитохондрий в отдельных участках миокарда: до 45% митохондрий в кардиомиоцитах содержат вновь образованные микромитохондрий. Значительно активируется выход микромитохондрий в окружающую цитоплазму. Нами выявлена способность микромитохондрий к динамическим процессам по типу fission-fusion внутри «материнских» митохондрий. С увеличением дозы уридина, повышается сохранность миофибрилл без проявлений отека и деструкции. Совокупность полученных данных указывает на то, что уридин можно рассматривать как мощный активатор самовосстановления митохондриального аппарата в сердце при гипоксии, а также как средство, способствующее нормализации ультраструктуры миокарда.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В работе показано, что адениновые нуклеотиды, АТФ и АДФ способны с разной степенью эффективности ингибировать работу митохондриального и микросомального калий-трнспортирующих белков-каналов, встроенных в бислойные липидные мембраны (БЛМ). Показано, что специфический ингибитор митохондриального АТФ–зависимого калиевого канала (митоКАТФ) – 5-гидроксидеканоат (5-ГД) в концентрации 300 µM-400 µM ингибирует работу реконструированных в БЛМ белков, выделенных из митохондрий и микросом. Эти же концентрации 5-ГД ингибируют АТФ-зависимый транспорт калия в митохондриях печени крысы. Полученный результат говорит о том, что изучаемые белки относятся к системе АТФ-зависимого калиевого транспорта. Отсутствие влияния глибенкламида и 4-аминопиридина (4-АП), а также результаты сравнения регуляторных свойств изучаемых белков в целом, позволяют сделать вывод, что изучаемые нами белки представляют собой новый класс АТФ-чувствительных каналов. Электронно-микроскопическое исследование срезов ткани печени и сердца с использованием первичных антител (разведение антител 1:50) на изучаемый митохондриальный белок м.м. 57 кДа, показало, что гранулы золота локализуются как в митохондриях гепатоцитов, так и в митохондриях кардиомиоцитов. Помимо этого гранулы обнаружены на мембранах эндоплазматического ретикулума клеток печени. Полученный результат указывает на локализацию белка-канала с м.м. 57 кДа в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме. Проведено электронно-микроскопическое исследование срезов ткани печени и сердца с использованием антител на Kir6.2. Показано, что гранулы коллоидного золота, были обнаружены в митохондриях как кардиомиоцитов, так и гепатоцитов. Частицы золота отсутствуют на мембранах ретикулума клеток печени и в миофибриллах клеток сердца. Антитела на Kir6.2 белок локализуются на плазматических мембранах клеток сердца и печени, тогда как антитела на митохондриальный белок-канал с м.м. 57 не связываются с плазматической мембраной. Полученные результаты свидетельствуют в пользу нашего представления о том, что в митохондриях присутствует как минимум два типа АТФ-чувствительных калиевых канала. С помощью ингибиторного анализа, выяснен молекулярный механизм обнаруженного нами на предыдущем этапе проекта действия уридина на снижение уровня про- и противо- воспалительных цитокинов в крови мышей с острым бактериальным воспалением, сопровождающимся развитием окислительного стресса. Определено, что селективные ингибиторы митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала, 5-гидроксидеканоат и глибенкламид, частично снимают ингибирующий эффект уридина на содержание провоспалительных цитокинов. Установлено, что ингибитор превращения уридинтрифосфата (УТФ) в УДФ глюкозу – галактозамин, также ингибирует противовоспалительное действие уридина, из которого в клетке образуется УТФ. На основании проведенных исследований с использованием указанных трёх ингибиторов (галактозамин, 5-гидроксидеканоат, глибенкламид), выдвинуто предположение о том, что механизм противовоспалительного действия уридина связан как с активацией митоКАТФ канала, которая, как известно, защищает организм от вредных последствий развития окислительного стресса, так и с усилением синтеза гликогена, предположительно оказывающим влияние на воспалительный процесс путем снижения активации синтеза цитокинов. Методом электронной микроскопии была изучена ультраструктура митохондрий в коре головного мозга и ткани сердца крыс с разной толерантностью к недостатку кислорода: низкоустойчивых и высокоустойчивых животных. Показано, что в коре мозга при нормоксии существуют различия в структуре митохондрий этих двух типов крыс. Кора неустойчивых к гипоксии животных содержала митохондрии с неплотной упаковкой крист, в то время как митохондрии коры высокоустойчивых животных имели их плотную упаковку. Для ткани сердца различий в структуре митохондрий не обнаружено. В диапазоне 14% О2 во вдыхаемом воздухе изменения в строении митохондрий коры мозга крыс носили адаптивный характер и структура митохондрий неустойчивых к гипоксии крыс была близка к структуре устойчивых животных. Полученные данные об ультраструктурных особенностях митохондрий коры головного мозга двух крайних типов животных с неодинаковой толерантностью к острой кислородной недостаточности подтверждают концепцию о том, что им соответствуют два принципиально разных "функционально-метаболических портрета". Проведен поиск возможных модуляторов митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала среди митохондриально-направленных соединений. Показано, что додецилтрифенилфосфоний (С12-ТРР) способен стимулировать набухание митохондрий печени крыс в среде, осмолярность которой поддерживается KCl (130 мМ), но не сахарозой (250 мМ). Это набухание не ингибируется циклоспорином А, но подавляется ингибиторами АТФ-зависимого калиевого канала – глибенкламидом и АТФ. В то же время, другой митохондриально-направленный катион – деквалиниум, а также анион триклозан способны индуцировать пермеабилизацию внутренней мембраны митохондрий посредством других механизмов: добавление деквалиниума приводит к индукции MPT поры и усиленной продукции активных форм кислорода, в то время как триклозан способен стимулировать образование короткоживущих липидных пор во внутренней мембране органелл и искусственных липидных мембранах (лецитиновых липосомах).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В отчетном году продолжено изучение влияния гипобарической гипоксии разной степени тяжести на ультраструктуру митохондрий в коре головного мозга (КГМ) низко- (НУ) и высоко- (ВУ) устойчивых к гипоксии крыс. Установлено, что при гипоксическом воздействии «средней» степени тяжести (10% О2), в КГМ как НУ, так и ВУ крыс преобладали митохондрии с плотно упакованными кристами. После воздействия «тяжёлой» гипоксией (8% О2) было обнаружено увеличение сверхпротяженных митохондрий КГМ с перетяжкой. Протяженные митохондрии мозга НУ крыс имели электронноплотный матрикс и плотную упаковку крист 3-5 мкм в длину. В КГМ ВУ крыс протяженные митохондрии имели такую же длину, но матрикс был заметно светлее. У НУ крыс число протяженных митохондрий увеличивалось в 4 раза, по сравнению с контролем, в то время как у ВУ крыс – только в 2.6 раза. При выполнении настоящего этапа работы мы показали, что выявленные нами на этом и предыдущем этапе работы структурные отличия между НУ и ВУ крысами, могут быть связаны с более выраженным увеличением в КГМ НУ животных уровня экспрессии транскрипционного фактора HIF1α, по сравнению с ВУ крысами. Этот фактор активирует синтез белков, ответственных за адаптацию организма к гипоксии. Таким образом, в КГМ НУ крыс после 30-минутного «слабого» гипоксического воздействия наблюдалась экспрессия транскрипционного фактора HIF-1α, т.е. запускался срочный механизм, ответственный за индукцию большого количества генов адаптации. Вероятно поэтому НУ животные при слабой гипоксии повышают свои адаптивные свойства, и приближаются по митохондриальной ультраструктуре к ВУ животным. Аналогичные изменения были выявлены также в ткани миокарда. При воздействии «средней» гипоксии, размеры митохондрий сердца НУ крыс увеличивались за счет набухания, появлялись удлиненные митохондрии размером в несколько саркомеров. Наблюдалась локальная деструкция крист, их частичная фрагментация, разрывы внешней мембраны, формирование мембранных структур в матриксе. Для ВУ животных при этом режиме нарушалось упорядоченное расположение митохондрий сердца вдоль миофибрилл. Органеллы имели увеличенный размер за счет набухания, располагались отдельно или образовывали группы. Была заметна деструкция крист. В матриксе митохондрий сердца, кроме мембранных структур, были плотные образования, напоминающие микромитохондрии. Число мелких органелл как у ВУ, так и у НУ было близким к контролю. Число крист на митохондрию не менялось у обоих видов животных. При «тяжелой» гипоксии число мелких митохондрий сердца существенно увеличивалось как у НУ, так и у ВУ крыс. Количество крист у ВУ при 8% О2 было: 25 ед./митохондрию, по сравнению с 15 ед./митохондрию у НУ при этом режиме гипоксии. Число органелл с плотной упаковкой крист составляло у ВУ крыс 46,6%. Обнаруженные в работе данные, подтверждают развиваемую нами концепцию, что двум крайним типам животных с неодинаковой толерантностью к острой кислородной недостаточности соответствуют два принципиально разных функционально-метаболических паттерна. Еще одним направлением работы было изучение влияния уридина, предшественника активатора АТФ-зависимого калиевого канала (митоКАТФ) - УДФ, на ультраструктурные изменения ткани легкого крыс при воздействии острой тяжелой нормобарической гипоксии (7% О2, 30 мин). Было показано, что предварительное введение животным уридина (3 мкг/кг) приводило к уменьшению выраженности гипергидратации аерогематического барьера легкого и устранению развития внутриальвеолярного отека. Более того, введение уридина in vivo более чем в 2 раза уменьшало количество митохондрий с нарушенной ультраструктурой и предотвращало чрезмерное набухание органелл. Применение селективного ингибитора митоКАТФ - 5-гидроксидеканоата, предваряющее введение уридина, отменяло защитное действие уридина: толщина аерогематического барьера возвращалась до значений, определяемых после гипоксии. Таким образом, механизм действия уридина может быть связан с активацией митоКАТФ, который, по литературным и нашим данным, участвует в защите тканей от гипоксии и окислительного стресса. Тот факт, что уридин предотвращает отёк лёгкого при тяжёлой гипоксии, указывает на возможность использования уридина в терапевтических целях. В следующей части работы было проведено исследование эффекта уридина на развитие аудиогенных тонических судорог у крыс линии Крушинского-Молодкиной. Обнаружено, что латентный период развития тонических судорог у крыс был незначительно, но достоверно короче после хронического введения уридина (100 мкг/кг; 3 раза в день в течение 9 или 12 дней). В то же время интенсивность вызванных сильным звуком тонических судорог после хронического введения уридина осталась максимальной. Полученные данные показывают, что аудиогенную эпилепсию крыс линии КМ можно в данном случае рассматривать как генетическую модель эпилепсии, резистентной к лекарственному воздействию, что может быть предметом дальнейших исследований. Методом электронной микроскопии изучена ультраструктура митохондрий печени крыс Вистар при гипертиреозе, вызванного введением гормона тироксина. Обнаружено, что при этой патологии 58% митохондрий находится в набухшем состоянии. В 40% профилей в набухших митохондрий печени крыс при гипертиреозе обнаружены ламеллярные структуры, предположительно, в различной стадии их формирования: от момента образования до выхода из органелл. Большинство ламеллярных структур расположены в перинуклеарных митохондриях (27%), в то время как в области, прилегающей к цитоплазматической мембране, их число снижено. Выявленные структурные изменения митохондрий могут быть связаны с нарушением кальциевого гомеостаза. Установлено, что в состоянии экспериментального гипертиреоза достоверно увеличивается скорость транспорта ионов Са2+ в митохондриях печени крысы. Методом иммуноблотинга показано, что содержание канальной субъединицы митохондриального кальциевого унипортера (MCU) увеличивается, тогда как содержание неактивной субъединицы этого белка – (паралог MCU – MCUb) снижается. С помощью ингибиторного анализа, исследован механизм выхода ионов из митохондрий при продолжительных Sr(2+)-индуцированных осцилляциях ионных потоков через внутреннюю митохондриальную мембрану. Показано, что в качестве системы выхода ионов из митохондрий, обеспечивающей, в том числе, K+/H+ обмен (молекулярные структуры которого до сих пор не определены), может функционировать короткоживущая липидная пора, индуцированная длинноцепочечными насыщенными жирными кислотами (в основном, пальмитиновой и стеариновой) и ионами Са2+(Sr2+). Ранее нами было установлено, что образование подобной поры в митохондриях может лежать в основе механизмов развития патологий, связанных с окислительным стрессом, в частности, начальных этапов развития нейродегенеративных заболеваний. Установлено, что противотуберкулезный препарат нового поколения бедаквиллин дозозависимо подавляет работу систем, транспортирующих ионы К+ в митохондриях печени крыс. Ингибирующие действие был продемонстрировано на двух моделях: модели энергозависимого входа K+, и модели 2,4-динитрофенол-индуцированного выхода иона, которые опосредуются митоКАТФ. Полученные данные указывают на возможное действие этого препарата не только на бактериальные клетки (Mycobacterium tuberculosis), но и на внутриклеточные структуры эукариот. Ссылка на информационный ресурс: http://www.pushchino.ru/index.php?option=com_content&view=article&id=16190:2018-06-21-14-21-03&catid=48:news&Itemid=1