Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Получены генно-инженерных конструкции, кодирующих белки слияния целевых белков - элементов цитоскелета - с бактериальными coiled-coil спиралями и флуоресцентные белки с парными спиралями. На модели клеточных культур млекопитающих определена работоспособность гетеродимерных пар спиралей, оценена скорость обмена транзиентной метки. Эффективность мечения с использованием отобранных спиралей можно считать сопоставимой с флуоресцентными белками. В экспериментах in vitro и в клетках E. coli измерена контрастность и устойчивость фотоконверсии трех обратимо фотоактивируемых белков на основе FusionRed с заменами по ключевым аминокислотным положениям 69, 148, 179. Показано, что два отобранных флуоресцентных белка обладают контрастом и устойчивостью фотоконверсии, сопоставимыми с лучшими обратимо фотоактивируемыми красными белками. Отобраны пары флуороген-белок, пригодные для флуоресцентного мечения целевых клеточных структур в живых клетках. Получены генно-инженерные конструкции, кодирующие мутантные варианты липокалина. Показана улучшенная, по сравнению с флуоресцентными белками, фотостабильность системы мечения флуороген-белок. Получены генно-инженерных конструкции, содержащие мутанты фотоактивируемого белка PA-GFP с улучшенной фотостабильностью для экспрессии в цитоплазме и в составе белков слияния с интегрином. С их помощью, на модели клеточной культуры проведено сравнение фотостабильности фотоконвертированной формы этих белков, фотонного бюджета.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В условиях локализационной флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения проведена оценка эффективности мечения кавеолина с использованием бактериальных coiled-coil спиралей и фотоактивируемого флуоресцентного белка с парной спиралью. За счет транзиентного характера взаимодействия спиралей происходит постоянный обмен флуоресцентой метки на целевом белке с внутриклеточным пулом. В результате достигается высокая плотность мечения целевой структуры, достаточная для реконструкции изображений сверхвысокого разрешения. Разработанные обратимо фотоактивируемые красные флуоресцентные белки на основе FusionRed показали эффективное переключение между темновым и флуоресцентным состояниями в условиях конфокальной и широкопольной флуоресцентной микроскопии. Также обнаружено, что у некоторых широко используемых красных флуоресцентных белков, включая FusionRed и TagRFP наблюдается обратимая фотоконверсия в нефлуоресцентное состояние. При этом возврат во флуоресцентное состояние происходит спонтанно, и при интенсивностях облучения в десятки ватт на квадратный сантиметр можно поддерживать стабильные флуктуации сигнала. Такие флуктуации оказалось возможным использовать для реконструкции изображений со сверхвысоким разрешением при съемке живых клеток в щадящих условиях облучения. http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/cc/c6cc09200d Разработана двухкомпонентная система мечения белков с использованием пар флуороген-белок. При этом генетически кодируемая метка на основе бактериального белка липокалина обратимо связывает низкомолекулярный флуороген, легко проникающий в живую клетку. Постоянный обмен флуорогена позволяет контролировать плотность мечения целевых структур в условиях локализационной микроскопии сверхвысокого разрешения путем изменения концентрации флуорогена. Также, за счет обмена улучшается фотостабильность в широкопольной флуоресцентной микроскопии, локализационной сверхразрешающей микроскопии, а также STED-микроскопии http://www.ibch.ru/press/news/science/2143 http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/sc/c7sc01628j#!divAbstract Выбраны модельные целевые белки и созданы генно-инженерные конструкции с ними для тестирования разрабатываемых фотоактивируемых флуоресцентных белков, оптимизированных для количественных приложений локализационной микроскопии сверхвысокого разрешения, в том числе для отслеживанием перемещения одиночных молекул (sptPALM).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проведена оценка эффективности мечения ряда модельных белков с использованием бактериальных coiled-coil спиралей и флуоресцентного белка (или фотоактивируемого флуоресцентного белка) с парной спиралью. Методами анализа восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания и в экспериментах по локализационной флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, что наилучшими свойствами для практического использования обладают пары спиралей, содеражащие по три гептадных повтора. Разработанные в рамках проекта обратимо фотоактивируемые красные флуоресцентные белки на основе FusionRed (rsFusionRed1, rsFusionRed2, rsFusionRed3) применены для сверхразрешающей RESOLFT-микроскопии белков цитоскелета в живых клетках. Установлено, что белки rsFusionRed2 и rsFusionRed3 обеспечивают наибольшую скорость съемки RESOLFT-изображений среди всех опубликованных красных обратимо фотопереключаемых флуоресцентных белков. Также, на примере разработанных белков, впервые показана возможность использования комбинации лазеров с низкой фототоксичностью (510 нм и 590 нм) для сверхразрешающей RESOLFT-микроскопии. https://www.nature.com/articles/s41592-018-0052-9 В рамках разрабатываемой двухкомпонентной системы мечения белков с использованием пар флуороген-белок обнаружена новая комбинация свободно проникающего через клеточную мембрану флуорогена и мутанта липокалина. Новая пара флуороген-белок обладает флуоресценцией в красной области и сравнимой со спектрально близкими флуоресцентными белками яркостью. Показано применение новой системы мечения для традиционных вариантов флуоресцентной микроскопии а также для локализационной флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. https://www.mdpi.com/1422-0067/19/12/3778 В условиях локализационной микроскопии сверхвысокого разрешения проведены эксперименты по трекинку одиночных молекул белков с примембранной локализацией, меченных с использованием разработанных в данном проекте мутантных вариантов фотоактивируемого белка PA-GFP. Определен вариант PA-GFP, обеспечивающий наибольшую длину непрерывных траекторий перемещения меченной белковой молекулы в условиях sptPALM.