Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Для ЯМР-исследования изолированного потенциалочувствительного домена первой псевдо-субъединицы канала Nav1.4 человека (ПЧД-I) был выбран фрагмент Leu114-Ser246 канала. Для облегчения манипуляций с рекомбинантным белком, два неспаренных остатка Cys в последовательности ПЧД-I были заменены на остатки Ser. Используя систему бесклеточного синтеза (система сопряженной транскрипции-трансляции in vitro) на основе экстракта S30 из клеток E.coli были наработаны миллиграммовые количества образцов ПЧД-I, в том числе вариантов тотально-меченых стабильными изотопами 13С и 15N. Был проведен подбор оптимального мембраномоделирующего окружения для структурных исследований ПЧД-I методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии. Среда смешанных мицелл DPC/LDAO (1:1) при pH 5.5 была выбрана для дальнейших структурных ЯМР исследований ПЧД-I. Для подтверждения наличия корректной пространственной структуры у домена в этой среде был использован токсин Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei, который, влияя на потенциалозависимую активацию ПЧД, селективно ингибирует канал Nav1.4 человека. Титрование 15N-меченого образца ПЧД-I рекомбинантным аналогом токсина Hm-3 привело к селективному изменению положения и интенсивности некоторых сигналов домена. Это свидетельствует об образовании комплекса токсин/домен, и, следовательно, о правильной пространственной укладке молекулы домена. Используя 13С,15N-меченый образец ПЧД-I был получен набор 3D ЯМР спектров, необходимый для дальнейшего структурного исследования домена (HNCO, HN(CA)CO, HNCA, HN(CO)CA, HNCACB и 15N-NOESY). Для бактериальной продукции токсина ТS1 из яда скорпиона Tityus serrulatus были опробованы два подхода: продукция в виде слитой полипептидной последовательности с тиоредоксином (TS1-TRX), и «прямая» экспрессия в виде телец включения с последующей ренатурацией. Несмотря на тщательную оптимизацию условий продукции получить стабильный препарат TS1, путем экспрессии гибридного белка TS1-TRX, не удалось. В тоже время был разработан высокоэффективный протокол ренатурации токсина TS1 из телец включения. Оптимизация условий рефолдинга позволила получить до 0.7 мг токсина с литра бактериальной культуры. Выход 15N-меченого TS1 составил ~0.4 мг/л. Анализ методами 1H-15N ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии показал, что степень включения изотопа 15N в молекулу токсина составляет не менее 90%. Получен синтетический ген K+ канала KvAP и экспрессионный вектор для продукции белка в клетках E.coli. Оптимизированы условия получения, выделения и очистки рекомбинантного канала. Выход нативной тетрамерной формы KvAP после двухстадийной очистки методами металлоаффинной хроматографии и гель-фильтрации составил 0.8 мг/л культуры. Рекомбинантный канал KvAP был встроен в моноламелярные везикулы и плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ), состоящие из смеси липидов DPhPC/DOPE (7:3). Электрофизиологическое исследование в БЛМ выявило наличие потенциалозависимой проводимости. Наблюдаемый уровень проводимости одиночных каналов KvAP (~170 пС) подтвердил функциональную реконструкцию канала в мембрану. Полноразмерный канал KvAP был встроен в липид-белковые нанодиски (ЛБН), содержащие фрагмент бислойной мембраны, состоящий либо из цвиттер-ионного (POPC), либо из смеси цвиттер-ионного и анионного липида (POPC/DOPG 3:1). Для формирования нанодисков использовали специальный белок MSP2N2, позволяющий стабилизировать диски диаметром более 15 нм. Анализ полученных комплексов KvAP/ЛБН методом гель-фильтрации и просвечивающей электронной микроскопии с негативным контрастированием подтвердил преимущественное формирование частиц диаметром ~30 нм. Разработанные методы позволят в дальнейшем провести структурное исследование канала KvAP, химерных каналов на его основе и их комплексов с токсинами, методами просвечивающей криоэлектронной микроскопии. Получены синтетические гены химер KvAP/Nav1.4-I, KvAP/Nav1.4-II, ПЧД-KvAP/Nav1.4-I и ПЧД-KvAP/Nav1.4-II содержащие последовательность канала KvAP с заменой внеклеточных петель S1-S2 и S3-S4, на гомологичные последовательности из ПЧД-I и ПЧД-II канала Nav1.4 скелетных мышц человека. Полученные гены клонированы в экспрессионный вектор для последующей бактериальной продукции. Для исследования структуры ПЧД-II канала Nav1.4 методами ЭПР-спектроскопии были получены два дважды спин-меченых варианта домена. Для этого используя методы сайт-направленного мутагенеза в последовательность ПЧД-II в положения 45 и 131 (вариант 1) и 25 и 115 (вариант 2) были введены остатки Cys. Полученные белки были химически модифицированы тиол-реактивной спиновой меткой MTSL. Спин-меченые образцы ПЧД-II были охарактеризованы методами масс-спектрометрии и ЭПР спектроскопии. Степень включения меток была близка к 100%, кроме того в образцах отсутствовали свободные, не связанные с белком, парамагнитные радикалы. Исследование дважды спин-меченых образцов ПЧД-II методом импульсного двойного электронного резонанса (PELDOR), проведенное в мицеллах детергента DPC, позволило оценить расстояния между парамагнитными центрами внутри молекулы. Наблюдаемые распределения расстояний для обоих вариантов ПЧД-II имели два максимума ~4 нм и ~6 нм. Сравнение этих расстояний с расстояниями из модели ПЧД-II (см. ниже), показало, что расстояние 4 нм соответствует ПЧД с нативной третичной структурой. В то же время, расстояния ~6 нм предположительно является результатом межмолекулярных взаимодействий (фоновый сигнал от спинов, находящихся на разных молекулах). Следует отметить, что если бы третичная структура домена была бы полностью развернута, то расстояния между парамагнитными центрами составляли бы 8 нм и более. Полученные данные подтвердили наличие правильной третичной структуры у ПЧД-II солюбилизированного в мицеллах детергента. В 2016 году были проведены следующие дополнительные (незапланированные) исследования. Был проведен анализ данных о структуре и динамике ПЧД-II канала Nav1.4 в мембраномоделирующем окружении мицелл LPPG, полученных ранее в ходе ЯМР-исследования домена. Сравнение вторичной структуры ПЧД-II с известными структурами K+ и Na+ каналов показало, что структура ПЧД-II наиболее близка структуре ПЧД бактериальных Na+ каналов (например, NavAb) и отличается от структуры доменов K+ каналов млекопитающих. В тоже время динамика домена во временном диапазоне микросекунды-миллисекунды была схожа с динамикой ПЧД K+ каналов. Методами молекулярного моделирования была построена модель ПЧД-II, согласующаяся с экспериментальными данными. Расчет молекулярной динамики (270 нс, мембрана POPC/POPE/холестерин 2:1:1) показал, что предложенная модель, включающая связку из 4 трансмембранных спиралей, – стабильна. Значительная подвижность наблюдалась только для N- и С- концевых участков домена, а также для внеклеточных (S1-S2 и S3-S4) и цитоплазматической (S2-S3) петель, что согласуется с экспериментально-наблюдаемой локализацией высокоамплитудных движений в диапазоне пикосекунды-наносекунды. Таким образом, в ходе выполнения первого этапа проекта получен ряд уникальных результатов: (1) разработаны системы рекомбинантной продукции для ПЧД-I канала Nav1.4 и токсина TS1, (2) разработан протокол инкапсуляции полноразмерного канала KvAP в нанодиски, (3) проведено исследование ПЧД-I и ПЧД-II канала Nav1.4 методами ЯМР- и ЭПР-спектроскопии. По результатам выполнения проекта в журнал BBA-Biomembranes, индексируемый в базе Web of Science, была отправлена статья. Результаты выполнения проекта были представлены на 3-х конференциях. Все запланированные работы выполнены полностью.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Получены генетические конструкции и плазмидные вектора для двух химерных каналов на основе KvAP, включающих полные последовательности ПЧД канала Nav1.4 человека. Для увеличения эффективности процесса инициации трансляции была получена третья конструкция (Trx-KvAP/Nav1.4-II) включающая дополнительный N-концевой партнер – белок E.coli тиоредоксин. Экспрессия химерных генов не привела к продукции детектируемых количеств рекомбинантных белков. Таким образом, полная замена ПЧД канала KvAP на соответствующий домен из Nav1.4 препятствует корректному встраиванию и фолдингу канала в мембране. Анализ образцов ПЧД-I канала Nav1.4 в мицеллах DPC и DPC/LDAO (1:1) методами гель-фильтрации и CD спектроскопии показал, что домен имеет преимущественно спиральную вторичную структуру (~60%) и находится в состоянии мономера (диаметр комплекса белок/мицелла ~5.7 нм). При высоких концентрациях (100-300 мкМ) образцы ПЧД-I в мицеллах были нестабильны и практически полностью переходят в форму агрегатов в течении нескольких дней. Для исследования ПЧД-I была применена стратегия «быстрого» отнесения ЯМР-сигналов основной цепи. Стратегия основана на селективном комбинаторном введении 13C/15N-изотопных меток в несколько образцов белка. Для расчета оптимальной схемы введения изотопных меток разработан новый алгоритм «CombLabel». CombLabel превосходит ранее предложенные алгоритмы и позволяет находить решения с меньшим количеством образцов, меньшей ценой, и большим количеством получаемой информации. Было синтезировано пять селективно-меченых образцов ПЧД-I. Анализ ЯМР-спектров этих образцов позволил получить отнесение для ~50% сигналов основной цепи домена в мицеллах DPC/LDAO, что достаточно для дальнейших структурных исследований. На основании данных о химических сдвигах ядер 13C’ и 13CА была охарактеризована вторичная структура ПЧД. Показано, что спираль S3 разделена на два меньших спиральных сегмента S3a и S3b, что ранее наблюдалось в кристаллических структурах Kv каналов. Данные 15N-релаксации показали, что основная цепь ПЧД-I обладает значительной подвижностью в диапазоне пс-нс. Мы предполагаем, что подобный тип внутримолекулярной подвижности является отличительной чертой ПЧД каналов Nav. Для исследования третичной структуры ПЧД-I был использован ЯМР метод парамагнитного усиления релаксации (PRE), который позволяет измерять расстояния между введенной спиновой меткой и 1H-15N группами основной цепи. Был получен 15N-меченый вариант ПЧД-I, содержащий спиновую метку в спирали S2 (Gln159/Cys-MTSL). Данные PRE показали, что введенная спиновая метка сближена с остатками из спиралей S3 и S4 на расстояние 18-19 ангстрем. Методами молекулярного моделирования было построено две модели ПЧД-I, одна из которых соответствует активированному состоянию (деполяризация мембраны, Up-конфигурация, спираль S4 поднята), а другая состоянию покоя (гиперполяризация, Down-конфигурация, спираль S4 опущена). Сравнение моделей ПЧД-I с измеренными расстояниями, показало, что в окружении мицелл DPC/LDAO пространственная структура домена соответствует Down-конфигурации. Методом ЯМР было исследовано взаимодействие токсина Hm-3 с мицеллами DPC/LDAO и ПЧД-I. Построена модель комплекса токсин/мицелла. Hm-3 взаимодействует с поверхностью мицеллы петлевым участком (A10-C17) и участком бета-тяжа (S22-K24). Кластер ароматических остатков (W11, F12, W16 и Y25) погружен в гидрофобный регион, а положительно и отрицательно заряженные группы либо контактируют с полярными группами детергентов, либо экспонированы в растворитель. Титрование 15N-меченого ПЧД-I немеченым Hm-3 (и наоборот) позволило картировать интерфейсы взаимодействия в комплексе ПЧД-I/Hm-3. Со стороны ПЧД-I во взаимодействии принимают участие остатки внешней половины спирали S3 (спираль S3b, остатки S199-T207) и C-концевой части внеклеточной петли S3-S4 (остатки L212-I215). Сайт связывания на поверхности Hm-3 формируют остатки антипараллельной бета-шпильки (C23-K28 и L31-I33) и остатки W11-F12, участвующие во взаимодействии с мицеллой. Пространственная структура ПЧД-I и Hm-3 и топология взаимодействия Hm-3/мицелла и ПЧД-I/мицелла существенно не меняются при образовании комплекса. Методом белок-белкового докинга, используя ограничения на интерфейсы взаимодействия из данных ЯМР, была построена модель комплекса Hm-3/ПЧД-I-Up. Токсин периферически взаимодействует со спиральной шпилькой S3b-S4. Комплекс стабилизирован двумя солевыми мостиками (K24-E208 и K28-D211) и гидрофобными взаимодействиями. Таким образом, впервые было показана применимость ЯМР-спектроскопии для структурных исследований взаимодействия между токсинами и каналами Nav. Кроме того, был впервые охарактеризован новый сайт связывания токсинов пауков, влияющих на потенциалозависимую активацию. Этот сайт находится на ПЧД-I канала, а сайты, описанные для Nav каналов ранее, находятся на ПЧД-II и ПЧД-IV. Анализ модели ПЧД-I в Down-конфигурации показал, что в этой конформации участки, ответственные за взаимодействие с токсином, образуют один компактный сайт на поверхности молекулы. Возможно, именно эта компактизация интерфейса определяет большее сродство токсина к Down-конфигурации ПЧД, что наблюдается в электрофизиологических экспериментах. Для построения модели комплекса Hm-3/ПЧД-I-Down необходимо уточнение структуры ПЧД по данным ЯМР. Методом ЯМР-спектроскопии было исследовано взаимодействие токсинов Hm-3, VsTx1 и Ts1 с ПЧД-II канала Nav1.4. Показано, что Hm-3 образует комплекс с ПЧД-II, с участием того же сайта на поверхности токсина, что и в случае с ПЧД-I. При этом Hm-3 имеет меньшее сродство к ПЧД-II, что согласуется с данными электрофизиологии. Взаимодействия VsTx1/ПЧД-II не наблюдалось, что также согласуется с опубликованными результатами электрофизиологических экспериментов. ЯМР-эксперименты не выявили формирование комплекса Ts1/ПЧД-II. Вероятно, ПЧД-II, так же как и ПЧД-I, в мицеллах имеет структуру близкую к Down-конфигурации, что препятствует взаимодействию с токсином Ts1, который селективно связывается с ПЧД-II в Up-конфигурации. Полноразмерный канал KvAP инкапсулированный в липид-белковые нанодиски (ЛБН) был изучен методом крио-электронной микроскопии (крио-ПЭМ). Классификация полученных изображений подтвердила наличие дискоидных частиц диаметром ~15 нм, внутри которых, располагаются тетрамеры канала, имеющие характерную 4-х лучевую симметрию. Однако, из-за того что канал KvAP имеет маленькие внемембранные домены, в классах частиц, соответствующих боковой проекции, наблюдалась только плотность соответствующая белку MSP2N2, стабилизирующему нанодиск, а изображение канала было полностью размыто. Исследование химерного канала Trx-KvAP, включающего дополнительный N-концевой белок партнер (тиоредоксин), в качестве цитоплазматического домена, не позволило добиться удовлетворительного совмещения изображений мембранной части канала. Полученные результаты показывают, что среды на основе нанодисков не подходят для исследования небольших ионных каналов, таких как KvAP (гомотетрамер 32*4 кДа). Методом ПЭМ с негативным контрастом был исследован полноразмерный канал KvAP в составе мицелл мягкого детергента DDM. Классификация полученных изображений позволила наблюдать отдельные молекулы канала, имеющие характерную 4-х лучевую симметрию. Для подтверждения применимости подхода по структурным исследованиям ионных каналов, инкапсулированных в нанодиски, было проведено дополнительное (незапланированное) исследование канала Kv7.1 (KCNQ1) человека. Альфа-субъединица канала была экспрессирована в клетках дрожжей P.pastoris. Из мембранной фракции клеток были получены нанодиски на основе белка MSP2N2, содержащие KCNQ1. Препараты канала в нанодисках и мицеллах CHAPS изучали с помощью ПЭМ с негативным контрастом. Анализ изображений KCNQ1 в нанодисках выявил наличие дополнительного пояса электронной плотности, соответствующего фрагменту липидного бислоя и белку MSP2N2 (диаметр 15 нм). C разрешением от 2.5 до 3.2 нм были реконструированы трехмерные структуры «пустого» нанодиска, комплекса rKCNQ1/ЛБН и rKCNQ1/CHAPS. Сравнение полученных реконструкций выявило различия в структурной организации цитоплазматических доменов канала. В составе ЛБН цитоплазматические домены имеют более компактную структуру и «прижаты» к мембране. Полученные данные показали, что нанодиски могут быть успешно использованы для выделения, очистки, стабилизации в растворе и дальнейших структурных исследований потенциалозависимых ионных каналов. Таким образом, в ходе выполнения второго этапа проекта получен ряд уникальных результатов: (1) Разработан программный комплекс CombLabel для расчета оптимальной схемы селективного ведения 13C/15N-изотопных меток и «быстрого» отнесения ЯМР-сигналов основной цепи белка. (2) Получены прямые структурные данные о конформации ПЧД Na+ канала в состоянии близком к состоянию покоя (Down-конфигурация). (3) На основании данных ЯМР-спектроскопии, построена модель комплекса токсин/ПЧД канала Nav и охарактеризован новый сайт связывания токсинов пауков, располагающийся на ПЧД-I. (4) Методами электронной микроскопии, исследована пространственная структура канала KCNQ1 человека. По результатам выполнения проекта было опубликовано три статьи, индексируемые в базе Web of Science, и одна статья была отправлена в журнал PNAS. Результаты выполнения проекта были представлены в 6-и докладах на международных конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Получены генетическая конструкция и плазмидный вектор кодирующие ген химерного ПЧД канала KvAP с лиганд-связывающими участками (петли S1-S2 и S3-S4) из ПЧД-II канала Nav1.4. Экспрессия химерного гена в бесклеточной системе синтеза не привела к продукции детектируемых количеств рекомбинантного белка. При этом ПЧД-KvAP в контроле синтезировался с высоким выходом. Вероятно, имеет место затрудненная трансляция химерного белка. Проведено исследование рекомбинантного аналога токсина Ts1 бразильского скорпиона Tityus serrulatus, содержащего C-концевой остаток Gly62. Такой вариант токсина присутствует в природном яде наряду с компонентом, содержащим C-концевую карбоксиамидную группу (Cys61–CONH2). Методами 1H,15N ЯМР показано, что Ts1 структурирован в водном растворе, и его молекула содержит значительную долю β-структурных элементов. В процессе ренатурации токсина наблюдали образование стабильного дисульфидного изомера Ts1, обладающего неупорядоченной структурой. Исследование методом двухэлектродной фиксации потенциала на ооцитах лягушки Xenopus laevis подтвердило активность рекомбинантного Ts1 на каналах Nav1.4 и Nav1.5 млекопитающих. Как и природный токсин, рекомбинантный Ts1 не влиял на процессы активации и инактивации канала Nav1.5, и сдвигал зависимость активации канала Nav1.4 в сторону более отрицательных значений мембранного потенциала. В то же время, в отличие от амидированного варианта токсина, рекомбинантный Ts1 не влиял на инактивацию канала Nav1.4, что говорит об отсутствии взаимодействия с ПЧД-IV этого канала. Полноразмерный канал KvAP солюбилизированный в мицеллах DDM изучали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Трехмерная структура канала была реконструирована по данным ПЭМ с негативным контрастом с разрешением 2.1 нм. Структура имеет диаметр ~13.1 нм и высоту ~11.7 нм и обладает характерной С4 симметрией. В мембранной части канала наблюдалась только плотность соответствующая поровому домену. В цитоплазматической части канала наблюдались четыре региона дополнительной плотности, вероятно, соответствующие четырем ПЧД диссоциировавшим от поры. Полученная структура отличалась от кристаллической структуры полноразмерного канала KvAP, в которой также наблюдались искажения конформации ПЧД. Анализ микрофотографий KvAP полученных методом крио-ПЭМ подтвердил наличие С4 симметрии у молекулы канала. Однако, как и в случае негативного контраста, хорошо наблюдалась только электронная плотность, соответствующая поровому домену, а на месте ПЧД изображение было размыто. Таким образом, показано, что ПЧД канала KvAP подвижны и слабо связаны с поровым доменом. Солюбилизация KvAP в мицеллах DDM приводит к значительному искажению четвертичной структуры канала. Получены четыре спин-меченых варианта ПЧД-I канала Nav1.4, содержащих метку MTSL в положениях Gln47(S2)/Cys, Phe58(S2)/Cys, Leu84(S3a)/Cys и Ala114(S4)/Cys, а также одновременно меченые изотопом 15N. Данные эффекта парамагнитного усиления релаксации (PRE) показали, что введенные спиновые метки усиливают релаксацию HN-групп остатков из соседних спиралей, и наблюдаемые ослабления примерно соответствуют структуре домена. Модель домена, согласующаяся с данными PRE, была построена методом молекулярной динамики (МД) используя явно-заданное представление для растворителя и мицеллы DPC. Расчеты МД проводили для вариантов ПЧД-I содержащих спиновые метки в положениях 84 и 114. Система состояла из одной молекулы ПЧД, 80 молекул DPC, 30285 молекул TIP3P воды и 3х ионов Cl-. Расчеты МД с ограничениями, полученными из данных PRE, показали, что структура ПЧД в Up-состоянии хорошо согласуется с экспериментальными данными, наблюдались лишь минорные изменения в положении отдельных спиралей. Таким образом, мы подтвердили, что молекула ПЧД-I в мицеллах DPC/LDAO имеет пространственную структуру близкую к ожидаемой в активированном состоянии ПЧД (деполяризация мембраны, спираль S4 поднята). Ранее на основании данных ЯМР нами была предложена модель комплекса токсина Hm-3 из яда паука Heriaeus melloteei с ПЧД-I канала Nav1.4 в окружении мицелл DPC/LDAO. Согласно, полученной модели Hm-3 взаимодействует с внешней половиной спирали S3 и внеклеточной петлей S3-S4, образуя солевые мостики с двумя отрицательно заряженными группами домена. Таким образом, был охарактеризован новый сайт связывания токсинов, который находится на ПЧД-I канала. Сайты, описанные ранее, находятся на ПЧД-II и ПЧД-IV. На текущем этапе проекта был проведен анализ термодинамики взаимодействия токсина с ПЧД-I в окружении мицелл DPC/LDAO. Оказалось, что основной вклад в свободную энергию образования комплекса Hm-3/ПЧД-I вносит начальное связывание токсина с поверхностью мицеллы. Таким образом, мембрана, окружающая рецептор, играет большую роль во взаимодействии токсин-домен. Полученные результаты позволили предложить мембрано-опосредованную модель действия вольт-сенсорных токсинов. Токсин изначально заякоривается на поверхности мембраны, окружающей рецептор, и из этого состояния формирует комплекс со спиральной шпилькой S3-S4, блокируя движение датчика потенциала – спирали S4. Это, в свою очередь, приводит к ингибированию потенциалозависимой активации канала. На текущем этапе мы исследовали взаимодействие токсина Hm-3 с классическим сайтом, находящемся на ПЧД-II канала Nav1.4. Несмотря на невысокое качество спектров домена, использование комбинаторного селективного 15N/13С-меченья и «быстрой» технологии отнесения сигналов позволило получить отнесение ~45% сигналов основной цепи домена. Полученное отнесение покрывало петлевые участки и спираль S4. Вторичная структура ПЧД была охарактеризована по данным о химических сдвигах ядер 13C’ и 13CА. Титрование 15N-меченого ПЧД-II немеченым Hm-3 и наоборот выявило изменения в химических сдвигах и интенсивностях сигналов Hm-3 и ПДЧ-II. Сайт связывания на поверхности токсина практически совпадал с сайтом, отвечающим за взаимодействие с ПЧД-I, в то время как на поверхности ПЧД-II было выявлено два обособленных сайта связывания. Первый сайт находится на внеклеточной стороне мембраны и образован остатками петли S1-S2 и внешней части трансмембранной спирали S2. На этом участке находятся отрицательно заряженные группы, которые могут образовывать солевые мостики с положительно заряженными остатками токсина. Второй сайт располагается на внутриклеточной стороне ПЧД, захватывая отдельные остатки N- и С-концевых участков и петли S2-S3, и видимо является неспецифическим. Так как в природе токсину не доступна цитоплазматическая сторона мембраны. Используя алгоритм белок-белкового докинга с ограничениями на интерфейсы взаимодействия, налагаемыми данными ЯМР были получены вероятные структуры двух комплексов Hm-3/ПЧД-II (внеклеточный и внутриклеточный сайты). Полученная модель комплекса Hm-3 с внеклеточным сайтом ПЧД-II согласуется с электрофизиологическими данными. Таким образом, нами впервые охарактеризован «неканонический» сайт связывания токсинов, находящийся на шпильке S1-S2 ПЧД. Ранее предполагалось, что сайт связывания может находиться только на шпильке S3-S4. Гипокалиемический периодический паралич (HypoPP) 2 типа вызван мутациями консервативных остатков Arg в сегментах S4 ПЧД канала Nav1.4 скелетных мышц человека. В результате мутаций ПЧД канала проводят аберрантные токи утечки (омега-токи) и мышцы оказываются неспособны отвечать на сигналы нервной системы. Как показали наши исследования токсин Hm-3 блокирует токи утечки через мутантные каналы, в которых второй остаток Arg (R2) в спирали S4 ПЧД-I заменен на остаток Gly или Trp. При этом токсин не влияет на токи утечки вызванные мутациями в других положениях ПЧД-I и других доменах канала, включая ПЧД-II. Была предложена модель объясняющая механизм такой селективной блокировки. Взаимодействие токсина с S3-S4 шпилькой, вызывает переход ПЧД-I в сильно гиперполяризированное состояние, что приводит к блокированию токов в ПЧД мутантных по положению R2. Взаимодействие токсина со шпилькой S1-S2 ПЧД-II, не не влияет на потенциалозависимые перестройки и Hm-3 не блокирует омега-токи при мутациях в домене II. Разработана бесклеточная система синтеза белка, позволяющая получать миллиграммовые количества изолированного ПЧД-III канала Nav1.4 скелетных мышц человека (Thr1019-Ile1157). ЯМР анализ ПЧД-III в окружении мицелл DPC/LDAO выявил наличие внутримолекулярных конформационных флуктуаций в диапазоне времен мкс-мс. ЯМР эксперименты по титрованию, указали на формирование комплекса Hm-3/ПЧД-III. Были продолжены работы по совершенствованию методики «быстрого» отнесения ЯМР-сигналов основной цепи белка с использованием комбинаторного селективного мечения. Разработано программное обеспечение «UUCSL», которое позволяет конструировать универсальные схемы введения изотопов для отнесения белков. Специальный модуль программы проводит оптимизацию рассчитанных схем, минимизируя число образцов и общую цену изотопных меток. Для всех систем кодирования были рассчитаны оптимальные по цене универсальные схемы введения изотопов. Эти схемы могут использоваться в сложных случаях, когда поиск схем специфичных для последовательности конкретного белка невозможен, например, для больших белков, включающих 100 и более уникальных дипептидных фрагмента. На примере изолированного ПЧД из K+ канала человека Kv2.1 был исследован фолдинг небольших мембранных доменов in vitro. Методом импульсного двойного ЭПР (PELDOR) показано, что третичная структура ПЧД-Kv2.1 зависит от свойств мицелл детергента. ПЧД полностью разворачивается в мицеллах анионного лизо-липида LPPG (сигнал PELDOR не детектируется), а добавление в образец цвиттер-ионного детергента DPC ведет к постепенному сворачиванию белка. Наибольшая доля свернутого домена наблюдается в мицеллах чистого DPC. Зависимость структуры ПЧД от свойств детергента была также исследована методом ЯМР-спектроскопии. Показано, что фолдинг ПЧД (переход из развернутого в свернутое состояние) проходит в два этапа и включает дополнительное промежуточное состояние. Полученные данные впервые выявили возможное наличие интермедиатов фолдинга при сворачивании in vitro небольших мембранных белков и их доменов. Таким образом, в ходе выполнения второго этапа проекта получен ряд уникальных результатов: (1) Показано, что вариант Ts1-Gly62 не взаимодействует с ПЧД-IV канала Nav1.4. (2) Реконструирована трехмерная структура канала KvAP с разрешением 2.1 нм. Показано, что ПЧД канала KvAP подвижны и слабо связаны с поровым доменом. Солюбилизация канала приводит к искажению его четвертичной структуры. (3) Выявлена роль мембранного окружающая во взаимодействии токсинов паукообразных с ПЧД Nav каналов. (4) Впервые охарактеризован «неканонический» сайт связывания токсинов, находящийся на шпильке S1-S2 ПЧД. (5) Показано, что вольт-сенсорные токсины могут блокировать патологические токи утечки через мутантные ПЧД. (6) Разработан программный комплекс UUCSL для расчета универсальных схем селективного ведения 13C/15N-изотопных меток для «быстрого» отнесения ЯМР-сигналов основной цепи белка. (7) Впервые показано возможное наличие интермедиатов фолдинга при сворачивании in vitro небольших мембранных белков. По результатам выполнения проекта было опубликовано две статьи, индексируемые в базе Web of Science, включая статью в журнале Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Результаты были представлены в 7-и докладах на международных конференциях.