КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 16-14-10321

НазваниеРазработка таргетной системы для фотодинамического элиминирования опухолевых новообразований глубинных тканей на основе генетически кодируемого фотосенсибилизатора, активируемого биолюминесцентным резонансным переносом энергии

РуководительПрошкина Галина Михайловна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2016 г. - 2018 г.

Конкурс№13 - Конкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словаадресная доставка, биолюминесценция, BRET-индуцированная фотодинамическая терапия

Код ГРНТИ34.15.33

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Фотодинамическая терапия (ФДТ) является перспективным методом воздействия на злокачественные образования человека, поскольку позволяет воздействовать на опухоль селективно и локально. Фотосенсибилизатор и специфический источник света, генерирующий свет определенной длины волны, - ключевые компоненты этой системы. После активации фотосенсибилизатора светом происходит образование активных форм кислорода, которые вызывают разрушение раковых клеток. ФДТ эффективна лишь в тех случаях, когда вся опухоль целиком может быть подвергнута световой обработке. Так, опухоли, больше, чем 4-5 мм не поддаются уничтожению с использованием ФТД. В силу того, что для фотодинамической терапии необходим внешний источник света, в клинической практике этот метод используется только для лечения опухолей кожи и сетчатки, а также эпителиальных поверхностей органов, доступных для катетеров и эндоскопов. Разработка внутренних источников света могла бы значительно расширить область примененияфотодинамической терапии. В современной литературе описаны разработки по имплантанции оптико-волоконных источников света [Choi M. et al. Nat. Photonics. 2013; Kim T-i, et al. Science. 2013; Bagley AF, et al. ACS Nano. 2013]. Однако, ключевым недостатком данного подхода является инвазивность метода и негомогенное распределение света внутри опухоли. Альтернативой твердотельным внутренним источникам света является создание молекулярных внутриклеточных источников света, основанных на биолюминесцентом резонансном переносе энергии-BRET (Bioluminescence resonance energy transfer). В этой системе и фермент (люцифераза), и субстрат (два компонента, необходимых для генерации квантов света) доставляются к клетке неинвазивно. В современной научной литературе явление биолюминесцентного переноса энергии (BRET) широко используется для детекции и изучения биологических процессов in vivo, а также для биоимиджинга (Pfleger, Eidne. Nat. Methods 2006; Baumes et.al., 2010, Nat. Chem.; Yan et.al., 2010, Nat. Nanotechnol.; Mino et.al., 2009, PNAS). Возможность применения этого явления для терапии, в частности, для BRET- опосредованной фотодинамической терапии, была показана только в 2003 г [Theodossiou T, et al. Cancer Res. 2003], и на сегодняшний день существует всего 4 работы, использующие биолюминесценцию для ФДТ опухолей (Theodossiou T, et al. Cancer Res. 2003; Yuan et.al. J. Am. Chem. Soc. 2012; Hsu et. al., 2013, Biomaterials; Kim YR et al. Theranostics. 2015). В данном проекте предлагается принципиально новый подход к ФДТ опухолей, включающий разработку полностью генетически кодируемой BRET-индуцируемой системы фотодинамической терапии, не зависящей от источника внешнего излучения. В качестве фотосенсибилизатора будет использован фототоксичный флавопротеид miniSOG, способный оказывать цитотоксический эффект на раковые клетки под действием синего света. Свет нужной длины волны для возбуждения miniSOG будет продуцироваться непосредственно в раковой клетке-мишени в ходе биолюминесцентной реакции окисления фуримазина (субстрат люциферазы) люциферазой NanoLuc. В клетку-мишень гены люциферазы и белкового фотосенсибилизатора будут доставляться в виде единой генетической конструкции, обеспечивающей эукариотическую экспрессию. Для направленной доставки указанной генетической конструкции к раковым клеткам-мишеням и достижения их селективного элиминирования планируется использовать псевдотипированные вирусы, узнающие специфический онкомаркер на поверхности раковых клеток.

Ожидаемые результаты
В рамках данного проекта будет разработана система для адресной фотодинамической терапии опухолей с определенным молекулярным профилем, в которой в качестве генетически кодируемого фотосенсибилизатора будет применен цитотоксический флавопротеид miniSOG, а для его возбуждения будет использован «внутренний» источник света: свет нужной длины волны для возбуждения цитотоксического флавопротеида miniSOG будет получаться в ходебиолюминесцентной реакции окисления фуримазина люциферазой NanoLuc непосредственно в клетке-мишени. В клетку-мишень гены люциферазы NanoLuc и белкового фотосенсибилизатора miniSOG будут доставляться одновременно в виде единой генетической конструкции, обеспечивающей эукариотическую экспрессию рекомбинантного составного белка NanoLucminiSOG. Проблема адресной доставки будет решена с использованием псевдотипированных лентивирусов, узнающих на поверхности раковых клеток онкомаркер HER2/neu. Применение подхода направленной доставки лекарственного средства для селективной элиминации клеток опухоли позволит избежать большинства проблем, характерных для неспецифической терапии онкологических заболеваний, а использование внутреннего мобильного источника света существенно расширит возможности метода фотодинамической терапии: такой подход позволяет преодолеть проблему проникновения света вглубь тканей, и следовательно, открывает возможность оптического воздействия на глубинные ткани. Более того, этот подход позволит также воздействовать на неидентифицированные метастазы любого размера, рассеянные по организму. Согласно литературным данным (см. раздел 4.5) подобные работы ранее не проводились.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Фотодинамическая терапия является перспективным методом воздействия на злокачественные образования человека, поскольку позволяет воздействовать на опухоль селективно и локально. Однако из-за способности биологических тканей поглощать и рассеивать свет, проникающая способность видимого света в тканях составляет не более 10 мм. Ранее в нашей лаборатории были получены адресные белковые (т.е. генетически кодируемые) фотосенсибилизаторы на основе фототоксичного флавопротеида miniSOG, обладающие высокой цитотоксической активностью in vitro относительно HER2-положительных клеток аденокарциномы молочной железы (Mironoa et al., Theranostics, 2013; Proshkina et al., Biochimie, 2015). Возбуждение miniSOG происходит в синей области спектра (λmax=448 нм) (Shu et al., PlosBiol., 2011), что накладывает ряд ограничений на использование данных фотосенсибилизаторов in vivo. В качестве решения проблемы доставки синего света in vivo, мы предлагаем систему, в которой фотосенсибилизатор miniSOG возбуждается в результате реакции окисления субстрата (фуримазина) люциферазой NanoLuc (Promega). В ходе работ первого этапа мы показали, что люцифераза NanoLuc, введенная в составе единой генетической конструкции с miniSOG в эукариотические клетки, в присутствии субстрата фуримазина вызывает возбуждение фототоксичного флавопротеида miniSOG. При этом miniSOG проявляет фотоиндуцированную цитотоксичность, и смертность трансфецированных клеток составляет 48%. В настоящей работе впервые показана возможность использования биолюминесцентного резонансного переноса энергии для возбуждения белкового (генетически кодируемого) фотосенсибилизатора: испускаемый окисленной формой люциферазного субстрата свет переводит фототоксичный белок miniSOG, находящийся в составе белкового гибрида с люциферазой, в возбужденное состояние, необходимое для генерации активных форм кислорода и индукции клеточной гибели. Использование явления биолюминесценции в качестве внутриклеточного источника излучения для возбуждения фотосенсибилизатора в раковой клетке может стать решением проблемы доставки света вглубь тканей и расширить возможности фотодинамической терапии при лечении опухолей глубинных тканей и метастазов.

Публикации

1. Е. И. Шрамова, Г. М. Прошкина, С. П. Чумаков, Ю. М. Ходарович, С. М. Деев Индукция фототоксичности флавопротеида miniSOG посредством биолюминесцентного резонансного переноса энергии Acta Naturae, ТОМ 8 № 4 (31), стр. 117-123 (год публикации - 2016)

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Фотодинамическая терапия - неинвазивный метод воздействия на новообразования, основанный на использовании фотосенсибилизаторов (ФС), вводимых в опухоль, и света определенной длины волны для возбуждения ФС. При облучении ФС светом соответствующей длины волны в присутствии молекулярного кислорода образуются активные формы кислорода, такие как синглетный кислород 1O2, или радикальные формы, например, OH∙, O2∙, которые способны с высокой эффективностью окислять клеточные компоненты вблизи того места, где они были произведены, вызывая тем самым гибель клетки. Однако необходимость наличия внешнего источника света накладывает существенные ограничения в применении этого метода для фототерапии глубинных тканей: во-первых, происходит потеря оптической активности возбуждающего света в результате рефракции, отражения, поглощения и рассеяния квантов света в биологических тканях, во-вторых, проникающая способность видимого света в тканях не превышает 10 мм. «Внутренние» источники света могут стать решением проблемы доставки света вглубь тканей. Биолюминесцентные системы, основанные на Ферстеровском резонансном переносе энергии, широко используются в биомедицинских исследованиях. Однако возможность использования биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET) для ФДТ была показана лишь недавно, при этом в системе использовали ФС химической природы и квантовые точки, конъюгированные с люциферазой. В своей работе мы предлагаем использовать полностью генетически кодируемую систему для ФДТ, в которой в качестве ФС выступает фототоксичный белок miniSOG, а в качестве источника возбуждающего света – биолюминесцентная система на основе люциферазы NanoLuc и ее специфичного субстрата фуримазина. На этапе проекта 2017 г. мы показали, что в раковых клетках, содержащих гибридный белок NanoLuc-miniSOG, фототоксичность miniSOG, вызванная окисленной формой люциферазного субстрата, сопоставима с фототоксичностью miniSOG при облучении клеток внешним источником света. Созданная система характеризуется высоким коэффициентом переноса энергии (0.731±0.007) и, мы полагаем, может рассматриваться как альтернатива внешним источникам света при фототерапии in vivo.

Публикации

1. Шипунова В.О., Шилова О.Н., Шрамова Е.И., Деев С.М., Прошкина Г.М. Фуримазин, высокоспецифичный субстрат люциферазы NanoLuc, проявляет токсичность in vitro и in vivo. Биоорганическая химия, Т. 44. №2 (год публикации - 2018)

2. Шрамова Е.И., Прошкина Г.М., Деев С.М., Петров Р.В. Фотоиндуцированная цитотоксичность флавопротеида miniSOG, вызванная биолюминесцентным резонансным переносом энергии, зависит от его внутриклеточной локализации Доклады Академии наук, Т. 474. № 5С. 633-636. (год публикации - 2017)

3. Шрамова Е.И., Прошкина Г.М., Деев С.М Причина устойчивости рецептора ErbB2 к регуляции по типу отрицательной обратной связи Биоорганическая химия, Т. 44, №2 (год публикации - 2018)

4. Прошкина Г.М., Шрамова Е.И., Деев С.М. Активация белкового фотосенсибилизатора биолюминесцентным резонансным переносом энергии Acta naturae, Cпецвыпуск. С. 54 (год публикации - 2017)

5. Шрамова Е.И., Прошкина Г.М., Деев С.М. Сиситема фотодинамического элиминирования опухолевых новообразований на основе генетически кодируемого фотосенсибилизатора miniSOG, активируемого биолюминесцентным резонансным переносом энергии. В книге: Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии .Сборник тезисов. 2017., с. 186 (год публикации - 2017)

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Фотодинамическая терапия (ФДТ) является одним из наиболее перспективных методов эффективного и точного воздействия на опухоль. ФДТ представляет собой трехкомпонентную систему, состоящую из фотосенсибилизатора, света и молекулярного кислорода. Одной из основных проблем современной ФДТ является доставка возбуждающего света к глубинным опухолям и метастазам. Разработка методики, позволяющей доставлять свет к любой точке тела, является актуальной задачей. Внутренние источники света, основанные на биолюминесцентном резонансном переносе энергии (BRET), могут стать решением этой проблемы. В работе на текущем этапе мы показали, что биолюминесцентная система, основанная на люциферазе NanoLuc, ее специфичном субстрате фуримазин и фототоксичном белке miniSOG может использоваться для BRET-опостредованной ФДТ опухолей in vivo. Так, в опытной группе мышей (мыши с ксенографтными опухолями молочной железы, клетки которой стабильно продуцируют гибридный белок NanoLuc-miniSOG), при введении фуримазина в организм животного выявлено достоверное замедление в росте опухолей по сравнению с контрольной группой мышей (мыши с такими же опухолями, как опытная группа, но животные не получают фуримазин). На 25 день эксперимента рост опухолей в опытной группе был в 2.5 раза ниже, чем в контрольной. При этом эффект торможения роста опухоли составил 55%. Таким образом, наши результаты показывают, что биолюминесцентная система на основе NanoLuc-фуримазин и генетически кодируемого фотосенсибилизатора miniSOG является перспективной системой для BRET-опосредованной ФДТ глубинных опухолей и может рассматриваться как альтернатива внешним источникам света при фототерапии in vivo.

Публикации

1. Е. И. Шрамова, С. М. Деев, Г. М. Прошкина ЭФФЕКТИВНОСТЬ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО РЕЗОНАНСНОГО ПЕРЕНОСА ЭНЕРГИИ В СИСТЕМЕ NanoLuc-miniSOG – ФУРИМАЗИН Биоорганическая химия, Т. 44, № 6, с. 664-668 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1134/S0132342318060106

2. Прошкина Г.М., Шрамова Е.И., Шилова О.Н., Рябова А.В., Деев С.М. Phototoxicity of flavoprotein miniSOG induced by bioluminescence resonance energy transfer in genetically encoded system NanoLuc-miniSOG is comparable with its LED-excited phototoxicity. J Photochem Photobiol B, Nov;188:107-115 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2018.09.006

3. Шрамова Е., Прошкина Г., Шипунова В., Рябова А., Шилова О., Деев С. Photodynamic destruction of deep-tissue tumors using bioluminescence resonance energy transfer International journal on immunoreabilitation, V. 20, No 2, p. 77-79 (год публикации - 2018)

4. Шрамова Е.И., Прошкина Г.М., Деев С.М., Петров Р.В. МЕХАНИЗМ ГИБЕЛИ КЛЕТОК АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ВЫЗВАННОЙ BRET-ИНДУЦИРОВАННОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬЮ miniSOG, ЗАВИСИТ ОТ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ГИБРИДНОГО БЕЛКА NanoLuc-miniSOG Доклады академии наук, т. 482, №1, с.288-291 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1134/S1607672918050150

5. Шрамова Е., Прошкина Г., Деев С. Bioluminescence System Based on Luciferase NanoLuc and Flavoprotein miniSOG for Photodynamic Therapy of Deep Tissues Tumor Biology, 2018 (год публикации - 2018)

Возможность практического использования результатов
Проведенные фундаментальные научные исследования доказывают, что биолюминесцентная платформа на основе NanoLuc-фуримазин и генетически кодируемого фотосенсибилизатора miniSOG является перспективной системой для BRET-опосредованной ФДТ глубинных опухолей и может рассматриваться как альтернатива внешним источникам света при фототерапии in vivo