КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 16-14-10115
НазваниеНовая методология комплексной экспрессной оценки качества и загрязнения почвы на основе ферментативных биолюминесцентных систем
РуководительКратасюк Валентина Александровна, Доктор биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский федеральный университет", Красноярский край
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2016 г. - 2018 г. |
Конкурс№13 - Конкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-108 - Почвоведение
Ключевые словабиолюминесцентный анализ, почва, почвенный покров, оценка токсичности, ферментативные биотесты токсичности, экологический мониторинг, люцифераза, НАДН:ФМН-оксидоредуктаза, многокомпонентный иммобилизованный реагент
Код ГРНТИ68.01.71
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Настоящий проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы мониторинга окружающей среды, обеспечение экологической безопасности и приемлемого качества почв и почвенного покрова. Решение проблемы важно для всех сфер хозяйственного комплекса страны, особенно для аграрной сферы, на которую возложены задачи импортозамещения зарубежных продуктов растениеводства, при производстве возрастающих объемов и надлежащего качества продукции растениеводства.
Актуальность проекта связана, в первую очередь, с необходимостью разрешения таких острых проблем как определение механизмов устойчивости и саморегуляции почвы на всех уровнях ее организации и использования, количественной диагностики состояния и поддержания плодородия и предотвращения деградации почвы, выбора высокоинформативных функциональных и фактологических оценочных критериев, имеющих экологическую и экономическую значимость, разработки системы научно обоснованных методов оздоровления деградированных и нарушенных почв. В подобной ситуации поиск интегральных характеристик оценки токсичности почв, позволяющих оценить последствия воздействия человека на эдафотоп, представляется актуальным. В равной степени это относится и к другим природным средам – вода и воздух.
При этом следует констатировать отсутствие в мировой практике развитой методологии комплексного биотестирования почв, воды и воздуха как природных, так и искусственных экосистем. Вместо этого наблюдается тенденция к применению отдельных биотестов, что приводит к неадекватному отражению степени загрязнения окружающей среды и влиянию ее на человека. Действительно, оценку токсичности проводят по влиянию почвы, воды или воздуха на отдельные функции организма, такие как дыхание, подвижность, рост, пищеварение и т.п. Кроме того, использование в биотестах живых организмов и культур приводит к большой ошибке измерения. Предлагаемая в проекте «ферментативная функциональная модель живого организма» как комплексный биотест может помочь в решении обозначенной проблемы.
Этот комплексный биотест сконструирован из набора ферментативных биотестов, в которых осуществляется связь «ключевые ферменты – функция организма». В сумме набор таких ключевых ферментов должен адекватно отражать влияние токсичной среды на жизнедеятельность организма в целом. В системе биотестов такой комплексный биотест необходим, так как он отражает влияние токсичной среды на молекулярном уровне.
Целью исследования является разработка новой методологии комплексной экспрессной оценки качества и загрязнения почвы на основе ферментов светящихся бактерий.
Результаты выполнения работ по данному проекту не имеют прямых аналогов в мировой практике биотестирования почв. Впервые методы биолюминесцентного ферментативного анализа будут применены к задачам комплексной оценки токсичности почвы. Будет разработана новая методология, основанная на установлении корреляций между функциями организма и механизмами влияния токсичных сред (на примере почвы) на активность ферментов в сопряженных с люциферазой ферментативных цепочках.
Конструирование набора ферментативных тестов, позволяющих проводить мониторинг почвы, основанного на изучении воздействия экстрактов разных почв в нативном состоянии и в условиях их загрязнения на ключевые ферменты метаболических цепей, в целом составляющих модель метаболических процессов в живом организме, является инновационным, так как будет разработана первая комплексная экспрессная тест-система для мониторинга сложных по составу объектов, к которым относится почва.
План работы:
2016: Теоретические и экспериментальные исследования поставленных перед НИР задач. Выбор направления исследований. Разработка и обоснование новой методологии биотестирования. Анализ принципов конструирования ферментативных тестов для оценки экологического разнообразия почв и создания банка эталонных образцов почвы.
2017: Экспериментальные исследования комплексного теста ФМО для диагностики экологического состояния почв, загрязненных токсическими веществами. Корректировка принципов и приемов конструирования биолюминесцентных ферментативных методов для построения комплексного ферментативного теста ФМО для анализа качества почв и мониторинга их загрязнения.
2018: Обобщение результатов исследований. Оценка перспектив и ограничений предлагаемых подходов, разработка рекомендаций по применению полученных результатов для решения проблем оценки токсичности.
Ожидаемые результаты
Будет разработана новая методология комплексной экспрессной оценки качества и загрязнения почвы на основе ферментов светящихся бактерий и биохимического конструирования набора биолюминесцентных ферментативных методов для оценки состояния почвы, почвенного покрова и безопасности их эксплуатации с целью получения сельскохозяйственной продукции. Полученные результаты позволят сделать выводы о степени токсического воздействия анализируемых образцов почв на функционирование целого набора метаболических путей (молекулярный уровень), и, таким образом, оценить эффект их воздействия на весь организм в целом. Впервые методы биолюминесцентного ферментативного анализа будут применены к задаче комплексной оценки экологического состояния почв в условиях техногенной нагрузки. Ожидаемыми результатами являются увеличение скорости и воспроизводимости анализа, упрощение процедуры оценки токсичности, что позволит увеличить количество анализируемых образцов почв, а также проследить динамику изменения характеристик почв, в условиях антропогенной нагрузки. Будут получены новые знания о механизмах адаптации и устойчивости почвенной системы к антропогенным воздействиям, новые количественные характеристики диагностики оценки экологического состояния почвы. Будут прослежены особенности и взаимосвязи между изменениями в работе ряда ферментных систем в зависимости от количественных и качественных характеристик анализируемых образцов. Разработка и внедрение в практику экспрессной тест-системы позволит качественно изменить подходы к организации экологического мониторинга почв, оптимизировать схему его проведения.
В 2016 году планируется проведение теоретических и экспериментальных исследований поставленных перед НИР задач, обоснование направления исследований. Будут предложены методы конструирования полиферментных биотестов на основе различных типов взаимодействий ферментов для построения комплексного ферментативного теста ФМО. Планируется разработать модифицированную методику пробоподготовки образцов почв с использованием в качестве экстрагирующих веществ дистиллированной воды, ацетона и спирта. Ожидается, что подобный подход позволит получить результаты, адекватно отражающие состояние почв и степень их загрязнения токсикантами различной химической природы. Будут разработаны и оптимизированы методики ферментативного биотестирования эталонных образцов почв. В результате выполнения работ по проекту будут выявлены факторы, определяющие степень воздействия образцов почв на результаты ферментативного биотестирования. Для оценки достоверности и применимости предлагаемых методов планируется провести сравнение результатов биолюминесцентного ферментативного тестирования анализируемых образцов почв с результатами физико-химического анализа.
В 2017 году будут проведены экспериментальные исследования комплексного ферментативного теста ФМО.для диагностики экологического состояния почв. На примере пестицидов, тяжелых металлов и наноматериалов будут установлены закономерности влияния образцов почв, загрязненных токсическими веществами на активность ряда ключевых ферментов – показателей функционирования основных метаболических цепей человека, таких как:
- глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (ключевой фермент вторичного пути катаболизма глюкозы - пентозофосфатного пути);
- лактатдегидрогеназа (ключевой фермент молочно-кислого брожения);
- NADH-FMN-оксидоредуктаза (один из ключевых ферментов дыхания);
- трипсин и химотрипсин (ключевые ферменты пищеварения белков);
- алкогольдегидрогеназа (ключевой ферментов детоксикации спиртов);
- бутирилхолинэстераза (ключевой фермент нервной проводимости).
Будет проведено сравнение результатов биолюминесцентного тестирования с результатами, полученными с использованием методов газовой хроматографии, а также других химических и биологических методов анализа. Будет проведен разносторонний статистический анализ полученных результатов. Будет сделан вывод о возможности рекомендовать интегральные биолюминесцентные методы в качестве сигнальной системы тестов ФМО для определения острой токсичности почвы.
В 2018 году будут обобщены результаты исследований в виде публикаций и заключительного отчета. Будут оценены перспективы и ограничения предлагаемых подходов по сравнению с известными методами. Будет разработан текст лабораторной комплексной методики биотестирования разного типа почв и изучены возможности аттестации методики комплексного биотестирования почвы для включения в систему экологического мониторинга. Будут разработаны рекомендации по применению полученных результатов для решения проблем мониторинга разного типа почв.
По результатам проекта будет опубликовано не менее 13 статей в высокоимпактовых отечественных и зарубежных журналах, таких как Luminescence (импакт-фактор 1,273), Analytical and Bioanalytical Chemistry (импакт-фактор 3,659), European Journal of Soil Science (импакт-фактор 2,651), Plant and Soil (импакт-фактор 2,638), Прикладная биохимия и микробиология (импакт-фактор 0,689) и других. Результаты будут представлены на специализированных Всероссийских и Международных научных мероприятиях, таких как 18 Международный симпозиум по оценке токсичности (ISTA18) и 19 Международный симпозиум по био- и хемилюминесценции, VII съезде Общества почвоведов им. В.В. Докучаева (г. Белгород, 15-22 августа 2016 г.).
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Настоящий проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы мониторинга окружающей среды, обеспечение экологической безопасности и приемлемого качества почв и почвенного покрова. Решение проблемы важно для всех сфер хозяйственного комплекса страны, особенно для аграрной сферы, на которую возложены задачи импортозамещения зарубежных продуктов растениеводства, при производстве возрастающих объемов и надлежащего качества продукции растениеводства.
Актуальность проекта связана, в первую очередь, с необходимостью разрешения таких острых проблем как определение механизмов устойчивости и саморегуляции почвы на всех уровнях ее организации и использования, количественной диагностики состояния и поддержания плодородия и предотвращения деградации почвы, выбора высокоинформативных функциональных и фактологических оценочных критериев, имеющих экологическую и экономическую значимость, разработки системы научно обоснованных методов оздоровления деградированных и нарушенных почв. В подобной ситуации поиск интегральных характеристик оценки токсичности почв, позволяющих оценить последствия воздействия человека на эдафотоп, представляется актуальным. В равной степени это относится и к другим природным средам – вода и воздух. При этом следует констатировать отсутствие в мировой практике развитой методологии комплексного биотестирования почв, воды и воздуха как природных, так и искусственных экосистем. Вместо этого наблюдается тенденция к применению отдельных биотестов, что приводит к неадекватному отражению степени загрязнения окружающей среды и влиянию ее на человека. Действительно, оценку токсичности проводят по влиянию почвы, воды или воздуха на отдельные функции организма, такие как дыхание, подвижность, рост, пищеварение и т.п. Кроме того, использование в биотестах живых организмов и культур приводит к большой ошибке измерения. Предлагаемая в проекте «ферментативная функциональная модель живого организма» (ФМО) как комплексный биотест может помочь в решении обозначенной проблемы. Этот комплексный биотест сконструирован из набора ферментативных биотестов, в которых осуществляется связь «ключевые ферменты – функция организма». В сумме набор таких ключевых ферментов должен адекватно отражать влияние токсичной среды на жизнедеятельность организма в целом. В системе биотестов такой комплексный биотест необходим, так как он отражает влияние токсичной среды на молекулярном уровне.
Целью исследования является разработка новой методологии комплексной экспрессной оценки качества и загрязнения почвы на основе ферментов светящихся бактерий.
Достигнутыми научными результатами работ по проекту за 2016 год являются:
1. Обоснована предлагаемая для разработки авторами проекта экспрессная биолюминесцентная тест-система «ФМО (Ферментативная модель человека)» для комплексного анализа экологического состояния почвенного покрова. В состав данной модели входят ферменты, которые выполняют разнообразные функций в живом организме, такие как: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (ключевой фермент вторичного пути катаболизма глюкозы - пентозофосфатного пути); лактатдегидрогеназа (ключевой фермент молочно-кислого брожения); НАДH-ФМН-оксидоредуктаза (один из ключевых ферментов дыхания); трипсин и химотрипсин (ключевые ферменты пищеварения белков); алкогольдегидрогеназа (ключевой ферментов детоксикации спиртов) и бутирилхолинэстераза (ключевой фермент нервной проводимости).
2. Предложены принципы, алгоритмы и приемы конструирования полиферментных биотестов для построения комплексного ферментативного теста ФМО на основе различных типов взаимодействий ферментов. Основными способами достижения необходимой чувствительности ферментативных тестов являются- изменение соотношения компонентов реакционной смеси; изменение процедуры пробоподготовки; варьирование характеристиками используемых препаратов ферментов; введение дополнительной процедуры инкубации ферментов в анализируемой пробе и др.
3. Создан банк образцов почв Красноярского края, отличающихся по генезису, гранулометрическому составу, физико-химическим и другим характеристикам анализируемых эталонных проб (рН, ионный состав, катионная емкость, содержание гумуса и его подвижных соединений, ферментативная активность и др.), а также содержанием загрязняющих веществ. На каждый из 100 образцов подготовлен паспорт. Образцы почвы были классифицированы по типу основных загрязнителей (содержание нитратного азота, подвижного фосфора, водорастворимый фтор, валовой мышьяк и свинец). Так же был создан банк 30 эталонных образцов почв, не подвергавшихся антропогенному или техногенному загрязнению.
4. Разработана лабораторная методика пробоподготовки образцов почв, включающая условия отбора образцов почв, подготовки их экстрактов, условий хранения проб почвы и их экстрактов до и в ходе анализа.
5. Написан текст методических указаний для проведения экспериментальных работ, позволяющих определить характеристики почв по активности ферментов, входящих в состав комплексного ферментативного тесто ФМО.
6. В ходе экспериментальной работы:
- Были изучены условия получения экстрактов почвы в зависимости от соотношения «навеска почвы-количество воды или растворителя», природы экстрагирующего раствора, времени и скорости перемешивания и экстракции, условий фильтрования и центрифугирования и др. Предложен вариант пробоподготовки, когда навеску почвы (массой не менее 5,0 г) помещают в коническую колбу и приливают 5-кратный объем дистиллированной воды, перемешивают в течение 30 минут, фильтруют через бумажный фильтр. Полученные таким образом водные экстракты почвы сохраняли свое влияние на интенсивность биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза+люцифераза после 4 суток хранения при температуре 5 °С.
- Проведена оценка влияния оптических эффектов (светорассеяния, реабсорбции) исследуемых образцов на результаты биолюминесцентного анализа в зависимости от этапов пробоподготовки, геометрии съемки. Поглощение водных экстрактов почв не имеет выраженных полос в диапазоне регистрации 400-600 нм и отличается малым перекрыванием со спектром излучения биолюминесценции. Подсчитанные коэффициенты коррекции показали, что ослабление интенсивности биолюминесценции возможным "эффектом фильтра" не превышает погрешности измерений (<5%). Эти оценки не меняются в зависимости от различий в геометрии съемки на разных регистрирующих приборах - биолюминометрах. Вместе с тем, исследование спектров поглощения и других оптических характеристик экстрактов почв представляется перспективным в качестве альтернативного метода оценки качественного и количественного состава экстрагируемых из почвы веществ.
- Показатель биолюминесценции сильно (в 1,9-2,7 раза) увеличивается по профилю ряда почв. Зависимости между показателем биолюминесценции и содержанием гумуса, подвижных гумусовых веществ тесные, обратные (r = - 0,74±0,17 – 0,84±0,14). Для объективной оценки степени загрязнения почв необходимо нивелировать влияние гумусовых веществ. При низком содержании гумуса, менее 0,77-1,41%, и содержании подвижных гумусовых веществ менее 50 мгС/100г тушения биолюминесценции не происходит и оценочный показатель биолюминесценции можно использовать для определения загрязнения почв.
7. Сравнение результатов биолюминесцентного ферментативного тестирования эталонных проб почвы с результатами физико-химического анализа выявило факторы, от которых зависит степень воздействия образцов почв на результаты ферментативного биотестирования: температура, рН, ионная сила, природа растворителя для экстракции.
8. На примере влияния фуллеренов и наноматериалов, симулирующих гуминовые соединения, на биолюминесценцию предложены подходы для корректировки условий проведения ферментативного тестирования почв для минимизации ингибирующего воздействия на ферментативную активность
9. Биотест ФМО апробирован на разного типа коммерчески существующих биолюминометрах, а также на портативном биолюминометре Люмишот (ООО «НПП «Прикладные системы»). Для выполнения задач проекта был разработан новый макетный образец термостатируемого варианта прибора «Люмишот+» для полевых исследований, позволяющий работать в более широком спектре температур. Проведена проверка пригодности этого прибора для измерения биолюминесценции.
10. Продемонстрирована принципиальная возможность применимости результатов биолюминесцентного анализа ФМО в качестве интегрального показателя характеристики почв на примере почв Красноярского края (ОПХ «Минино», «Погорельский бор», ОПХ «Солянское» и др.).
11. Подготовлено и опубликовано 13 публикаций, в том числе принято к опубликованию 4 статьи в высокорейтинговые журналы.
12. Результаты проекта были представлены в виде устных и постерных докладов на 6 российских и 6 международных конференциях, таких как 19 Международный симпозиум по био- и хемилюминесценции (29 мая - 2 июня 2016, Цукуба, Япония); VII съезде Общества почвоведов им. В.В. Докучаева (Белгород, 15-22 августа 2016) и другие
13. Ссылки на информационные ресурсы в сети Интернет (url-адреса), посвященные проекту:
1. Городские новости (gornovosti.ru), 22.08.2016
http://www.gornovosti.ru/tema/eureka/analiz-za-odnu-minutu85786.htm
2. Монависта (krasnoyarsk.monavista.ru), 07.11.2016
http://krasnoyarsk.monavista.ru/news/2308361
3. ИА 1-LINE (1line.info), 08.11.2016
http://1line.info/nauka-i-tekhnologii-intervyu/item/61328-valentina-kratasuk
Публикации
1. А.С. Сачкова, Е.С. Ковель, Г.Н. Чурилов, О.А. Гусейнов, А.А. Бондарь, И.А. Дубинина, Н.С. Кудряшева On mechanism of antioxidant effect of fullerenols Biochemistry and Biophysics Reports, - (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1016/j.bbrep.2016.10.011
2. Байгина Е.М., Римацкая Н.В., Степанова Л.В., Кратасюк В.А. Анализ возможности применения биолюминесцентных ферментативных биотестов для оценки загрязнения почвы Красноярского края Известия Иркутского государственного университета. Серия: Биология. Экология, - (год публикации - 2017)
3. Е. Н. Есимбекова, Е. В. Немцева, М. А. Кириллова, А. А. Асанова, В. А. Кратасюк Биолюминесцентный метод токсикологической оценки наноматериалов Доклады Академии Наук, - (год публикации - 2017) https://doi.org/10.7868/S0869565217050267
4. Шпедт А. А., Трубников Ю. Н., Жаринова Н. Ю. Агрогенная деградация почв и почвенного покрова Красноярской лесостепи Почвоведение, - (год публикации - 2017)
5. А.Е. Лисица, Е.В. Немцева, В.А. Кратасюк Кинетика биферментной биолюминесцентной реакции бактерий в условиях макромолекулярного краудинга, моделируемого полиэтиленгликолем Acta Naturae (Научные труды V Cъезд физиологов СНГ V Съезд биохимиков России Конференция ADFLIM), - (год публикации - 2016)
6. Байгина Е.М., Гульнов Д.В., Лисица А.Е., Римацкая Н.В., Сутормин О.С., Степанова Л.В.,Кратасюк В.А. Биолюминесцентных ферментативные системы в мониторинге загрязнения почвы Биотехнология новых материалов – окружающая среда – качество жизни, - (год публикации - 2016)
7. Е.М. Байгина, А.А. Шпедт, Н.В. Римацкая, В.А. Кратасюк Биолюминесцентный ферментативный экспрессный метод оценки загрязнения почв сельскохозяйственных угодий Материалы IV Всероссийской научной конференции Динамика современных экосистем в голоцене, - (год публикации - 2016)
8. Кириллова М.А., Есимбекова Е.Н., Кратасюк В.А. Сопряженная ферментативная система светящихся бактерий для анализа бактериального загрязнения Материалы международного симпозиума и молодежной школы "Биодиагностика и оценка качества природной среды:подходы, методы, критерии и эталоны сравнения в экотоксикологии", - (год публикации - 2016)
9. Кратасюк В., Есимбекова Е. Applications of luminous bacteria enzymes in ecotoxicology Материалы международного симпозиума и молодежной школы "Биодиагностика и оценка качества природной среды:подходы, методы, критерии и эталоны сравнения в экотоксикологии", - (год публикации - 2016)
10. О.О. Лащук, М.А. Геpаcимова, Б.С. Мельник, Е.В. Немцева Временные компоненты спектра собственной флуоресценции карбоксиангидразы Б на разных стадиях денатурации Acta Naturae (Научные труды V Cъезд физиологов СНГ V Съезд биохимиков России Конференция ADFLIM), - (год публикации - 2016)
11. Фрицлер Я.В., Есимбекова Е.Н., Кратасюк В.А. Анализ токсичности наноматериалов на основе металлов с использованием биолюминесцентного метода in vitro Материалы Международной научной конференции "Биотехнология новых материалов – окружающая среда – качество жизни", - (год публикации - 2016)
12. Шпедт А.А., Жаринова Н.Ю., Ямских Г.Ю., Александрова С.В. Оценка почв земледельческой части Красноярского края Почвоведение продовольственной и экологической безопасности страны: Тезисы докладов VII съезда Общества почвоведов им. В.В. Докучаева и Всероссийской с международным участием научной конференции. Ч. II., - (год публикации - 2016)
13. Шпедт А.А., Римацкая Н.В., Байгина Е.М., Степанова Л.В., Кратасюк В.А. Биолюминесцентный ферментативный экспрессный метод для оценки загрязнения почв Материалы IV Международной научно-практической конференции "Почва как связующее звено функционирования природных и антропогенно-преобразованных экосистем", - (год публикации - 2016)
14. - Инновационные разработки учёных СФУ презентованы в «Сколково» Новости СФУ, Пресс-служба СФУ, 3 ноября 2016 г (год публикации - )
15. - Анализ за одну минуту сайт муниципальной газеты Красноярска "Городские новости", 22.08.2016 | №3401 (год публикации - )
16. - Евгений Ваганов: «Нобелевские лауреаты вырастают на решении крупных проблем» Наука и жизнь, № 12, декабрь 2016 (год публикации - )
17. - Биолюминесценция: от идеи до коммерциализации сайт Краевого фонда науки, 07 ноября 2016 (год публикации - )
18. - «Работы нашего научного коллектива известны во всем мире» Информационное агенство 1-LINE, Вторник, 08 ноября 2016 10:22 (год публикации - )
19. - Проекты учёных СФУ получили поддержку Российского научного фонда Новости СФУ, Пресс-служба СФУ, 5 апреля 2016 г. (год публикации - )
20. - На интерактивной выставке "Город открытий" выступит известный британский популяризатор науки профессор Сосабовски Официальный портал Красноярского края, 21 ноября 2016, понедельник, 12:50 (год публикации - )
21. - Роботы-миньоны захватили СФУ Новости СТС Прима Красноярск, Среда, 5 октября 2016 (год публикации - )
Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Настоящий проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы мониторинга окружающей среды, обеспечение экологической безопасности и приемлемого качества почв и почвенного покрова. Актуальность проекта связана, с необходимостью разрешения таких острых проблем как определение механизмов устойчивости и саморегуляции почвы на всех уровнях ее организации и использования, количественной диагностики состояния и поддержания плодородия и предотвращения деградации почвы, выбора высокоинформативных функциональных и фактологических оценочных критериев, имеющих экологическую и экономическую значимость, разработки системы научно обоснованных методов оздоровления деградированных и нарушенных почв. В подобной ситуации поиск интегральных характеристик оценки токсичности почв, позволяющих оценить последствия воздействия человека на эдафотоп, представляется актуальным. При этом следует констатировать отсутствие в мировой практике развитой методологии комплексного биотестирования почв, воды и воздуха как природных, так и искусственных экосистем. Вместо этого наблюдается тенденция к применению отдельных биотестов, что приводит к неадекватному отражению степени загрязнения окружающей среды и влиянию ее на человека. Предлагаемая в проекте «ферментативная функциональная модель живого организма» (ФМО) как комплексный биотест может помочь в решении обозначенной проблемы. Этот комплексный биотест сконструирован из набора ферментативных биотестов, в которых осуществляется связь «ключевые ферменты – функция организма». В сумме набор таких ключевых ферментов должен адекватно отражать влияние токсичной среды на жизнедеятельность организма в целом. В системе биотестов такой комплексный биотест необходим, так как он отражает влияние токсичной среды на молекулярном уровне.
Целью исследования является разработка новой методологии комплексной экспрессной оценки качества и загрязнения почвы на основе ферментов светящихся бактерий.
Достигнутыми научными результатами работ по проекту за 2017 год являются:
1. Была проведена оценка возможности использования биолюминесцентных ферментативных тестов в качестве диагностических показателей широкого спектра загрязняющих вещества на 68 модельных образцов почв, отобранных в экологически чистых районах.
2. Для обеспечения экстракции из почв загрязнителей, имеющих разные физико-химические характеристики, была разработана модифицированная лабораторная методика пробоподготовки загрязненных почв с использованием разных растворителей, таких как дистиллированная вода, ацетон, этиловый спирт и ацетатно-аммонийный буфер.
3. Предложенные варианты пробоподготовки были использованы для определения чувствительности биотеста, основанного на использовании биферментной системы NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза+люцифераза (R+L), к вытяжкам почвы, загрязненной солями тяжелых металлов (хлорида и сульфата меди, соединений свинца). Методом атомно-абсорбционной спектрометрии была подтверждена эффективность разработанного метода пробоподготовки почвы.
4. Определены условия хранения проб. Показано, что в сухом виде (воздушно-сухая проба) почвы могут храниться продолжительное время (более 14 месяцев) без изменения их физико-химических характеристик при условии отсутствия летучих соединений. Экстракты почв могут храниться в холодильнике при температуре +4°С в течение 3-5 дней.
5. Проведенный спектральный анализ экстрактов модельных образцов почв показал наличие высокой корреляции содержания флуорофоров в почве с результатами биолюминесцентного биотестирования.
6. Проведено исследование чувствительности ферментативных систем предлагаемого биотеста ФМО к растворам токсикантов в дистиллированной воде. Наибольшей чувствительностью к действию токсических веществ обладают моноферментная реакция, катализируемая бутирилхолинэстеразой, биферментная реакция R+L и триферментная реакция NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза+люцифераза (R+L) +лактатдегидрогеназа ( LDH+R+L).
7. Проведена оценка чувствительности ферментативных систем к воздействию токсических веществ при их внесении непосредственно в экстракты почв, что подтвердило возможность применения ФМО для экологического мониторинга загрязненных почв.
8. Найдены условия по количеству реагентов, входящих в состав реакционной смеси для каждой ферментативной системы, обеспечивающие максимальную чувствительность комплексного теста ФМО (ферментативная модель организма).
9. Система биотестов ФМО показала хорошую воспроизводимость результатов (15-20 %), экспрессность проведения анализа (время пробоподготовки - 15-30 минут, процедура измерения - 3-10 минут) и высокую чувствительность методов на примере пестицида гексахлорана (ГХЦГ) и хлорида меди, внесенных непосредственно в образцы пяти эталонных почв.
10. Проведено сравнение результатов ферментативного биотестирования (на примере биферментной системы NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза+ люцифераза) с результатами стандартизованных методов биотестирования, разрешенных к использованию в экологическом контроле. В 58% случаев биолюминесцентный метод выявил токсичность образца (сильное ингибирование), не обнаруженную с помощью известных методов.
11. Для различных типов экосистем почвы проведено математическое моделирование распределения гумусовых и органических веществ в почве с усреднёнными в масштабах биомов вертикальными распределениями в почвенном профиле. Показаны тренд и изменения содержания гумусовых веществ в агропочвах под залежами. Установлены математические зависимости между количеством гумуса, подвижных гумусовых веществ в агропочвах залежей разного возраста и климатом. Разработанные модели имеют фундаментальную и практическую значимость.
12. Проведены регрессионные исследования между параметрами загрязненной почвы и результатами биолюминесцентного тестирования с использованием биферментной системы NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза+ люцифераза, которые показали сложные взаимосвязи между свойствами почвы, степенью загрязнения и величиной остаточного свечения биолюминесцентной ферментативной тест-системы.
13. Разработана схема базы данных исследования почвенных образцов с управляющей моделью изучения почвенных образцов для Платформы консолидации данных научных исследований. Предложенное информационное решение по организации данных исследования почвенных образцов реализует возможность структурированного хранения данных, создавая основу для сопоставления результатов смежным исследований, аналитической обработки данных и развития предложенной базы данных, сообразно выбранному направлению научных изысканий. База данных необходима для инвентаризации и классификации изученных многочисленных образцов почвы, отличающихся характеристиками.
14. Показана возможность адаптация ферментативных методов биотестирования под существующие портативные приборы без потери чувствительности методов, на примере биолюминометра «LumiShot+» производства ООО «НПП «Прикладные биосистемы» (Красноярск) с целью создания Портативной лаборатории для мониторинга загрязнения почвы, включающей прибор-биолюминометр, реагенты и новые методики.
15. На основе проведенных экспериментальных исследований по анализу чувствительности ферментативных систем к разным классам токсических веществ и с учетом корректировки приемов конструирования ферментативных методов тестирования, для дальнейших исследований в комплексную систему тестов рекомендуется включить: моноферментную реакцию, катализируемую бутирилхолинэстеразой, биферментную систему R+L и триферментную систему LDH+R+L.
16. Ссылки на информационные ресурсы в сети Интернет (url-адреса), посвященные проекту:
http://рнф.рф/ru/node/2550
http://kras.mk.ru/articles/2017/10/13/mkekologiya-krasnoyarskiy-kray.html
http://gazeta.sfu-kras.ru/node/5379
http://www.sfu-kras.ru/staff/19347
https://sib.fm/news/2017/09/27/uchjonye-nashli-sposob-opredeljat-toksichnost-nanomaterialov
http://fano.gov.ru/ru/press-center/card/?id_4=38815
http://www.sbras.info/news/sibirskie-uchenye-predlozhili-ispolzovat-svetyashchiesya-molekuly-dlya-opredeleniya-toksichnost
http://krsk.sibnovosti.ru/science/356641-krasnoyarskie-uchenye-nauchilis-opredelyat-toksichnost-nanomaterialov
http://news-w.com/64556-6952/
http://www.krskstate.ru/press/news/0/news/85768
https://glasnarod.ru/nauka/125427-krasnoyarskie-uchenye-razrabotali-biolyuminesczentnuyu-test-sistemu-dlya-opredeleniya-toksichnosti-nanomaterialov
http://www.sib-science.info/ru/news/sibirskie-uchenye-predlozhili-27092017
http://www.24rus.ru/more.php?UID=147949
http://mirtesen.sputnik.ru/blog/43632873495/Krasnoyarskie-uchenyie-sozdali-biolyuminestsentnuyu-fermentativn
Публикации
1. Барцев С.И., Почекутов А.А. Quantitative description of vertical organic matter distribution in real soil profiles by means a simple continuous model Ecological Modelling, Volume 360, Pages 219-222 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1016/j.ecolmodel.2017.06.016
2. Есимбекова Е.Н., Немцева Е.В., Кириллова М.А., Асанова А.А., Кратасюк В.А. Bioluminescent assay for toxicological assessment of nanomaterials BIOCHEMISTRY, BIOPHYSICS, AND MOLECULAR BIOLOGY, MAIK NAUKA/INTERPERIODICA/SPRINGER, 233 SPRING ST, NEW YORK, NY 10013-1578 USA, Том: 472 Выпуск: 1 Стр.: 60-63 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1134/S1607672917010173
3. Есимбекова Е.Н.,Немцева Е.В., Безруких А.Е., Жукова Г.В., Лисица А.Е., Лоншакова-Мукина В.И., Римацкая Н.В., Сутормин О.С., Кратасюк В.А Bioluminescent enzyme inhibition-based assay to predict the potential toxicity of carbon nanomaterials Toxicology in Vitro, Volume 45, Part 1, Pages 128-133 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1016/j.tiv.2017.08.022
4. Шпедт А.А., Трубников Ю.Н., Жаринова Н.Ю Agrogenic Degradation of Soils in Krasnoyarsk Forest-Steppe Eurasian Soil Science, Vol. 50, No. 10, pp. 1209–1216. (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1134/S106422931710012X
5. Кратасюк В.А., Есимбекова Е.Н. Can living organisms in bioassays be replaced on enzymes? Материалы конференции "Биотехнология новых материалов- Окружающая среда- Качество жизни", --- (год публикации - 2017)
6. Немцева Е., Лисица А., Прокопишко Ю., Барцев С., Кратасюк В. Нестационарная кинетика биолюминесцентной реакции бактерий: поиск лимитирующих стадий в условиях высокой вязкости VIII Съезд Российского фотобиологического общества. Материалы съезда., - (год публикации - 2017)
7. Степанова Л.В., Байгина Л.М., Матвиенко В.С., Римацкая Н.В., Шпедт А.А. Биолюминесцентная тест-система для выявления техногенного загрязнения почвы Материалы конференции "Биотехнология новых материалов- Окружающая среда- Качество жизни", - (год публикации - 2017)
8. Шпедт А.А., Кратасюк В.А., Римацкая Н.В., Байгина Е.М. Генезис, свойства и плодородие черноземов Красноярского края ЧЕРНОЗЕМЫ ЦЕНТРАЛЬНОЙ РОССИИ: ГЕНЕЗИС, ЭВОЛЮЦИЯ И ПРОБЛЕМЫ РАЦИОНАЛЬНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ, сборник материалов научной конференции, - (год публикации - 2017)
9. Шпедт А.А., Кратасюк В.А., Римацкая Н.В., Байгина Е.М., Степанова Л.В., Матвиенко В.С. Развитие методов биологического мониторинга почв Материалы III Всероссийской научной конференции с международным участием «Проблемы истории, методологии и социологии почвоведения, - (год публикации - 2017)
10. - Красноярские ученые предложили использовать светящиеся молекулы для определения токсичности наноматериалов НОВОСТИ СИБИРСКОЙ НАУКИ Главная публичная научно-техническая библиотека Сибирского отделения Российской академии наук, 27/09/2017 (год публикации - )
11. - Красноярские ученые разработали биолюминесцентную тест-систему для определения токсичности наноматериалов Красноярский край официальный портал, 29 сентября 2017, пятница, 16:35 (год публикации - )
12. - Красноярские ученые предложили использовать светящиеся молекулы для определения токсичности наноматериалов Официальный сайт Федерального агентства научных организаций, 27.09.2017 11:42 (год публикации - )
13. - Красноярские ученые создали биолюминесцентную ферментативную тест систему для оценки токсичности углеродных наноматериалов информационного агентства «НИА-Красноярск», 27.09.2017 14:19 (год публикации - )
14. - Учёные СФУ нашли способ определения токсичности наноматериалов Сайт "Сибирского федерального университета", 2 октября 2017 г (год публикации - )
15. - КРАСНОЯРСКИЕ УЧЕНЫЕ СОЗДАЛИ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНУЮ ФЕРМЕНТАТИВНУЮ ТЕСТ СИСТЕМУ ДЛЯ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ УГЛЕРОДНЫХ НАНОМАТЕРИАЛОВ Спутник Новости, 27.09.2017 в 10:19 (год публикации - )
16. - Красноярские учёные нашли способ определять токсичность наноматериалов за две минуты Средство массовой информации «Интернет-журнал Сиб.фм», 27 сентября, 13:07 (год публикации - )
17. - Сибирские ученые предложили использовать светящиеся молекулы для определения токсичности наноматериалов редакция издания «Наука в Сибири», 27 сентября 2017 (год публикации - )
18. - Живое свечение ферментов газета Сибирского федерального университета «Новая университетская жизнь», №12 (195) 21 сентября 2017 г., стр.8-9 (год публикации - )
19. - Мониторинг почвы попал в лидеры МК-Экология Красноярский край, Материалы рубрики "МК-Экология. Красноярский край" номер 42 от 11.10.17, стр.18 (год публикации - )
Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Настоящий проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы мониторинга окружающей среды, обеспечение экологической безопасности и приемлемого качества почв и почвенного покрова. Решение проблемы важно для всех сфер хозяйственного комплекса страны, особенно для аграрной сферы, на которую возложены задачи импортозамещения зарубежных продуктов растениеводства, при производстве возрастающих объемов и надлежащего качества продукции растениеводства.
Актуальность проекта связана, в первую очередь, с необходимостью разрешения таких острых проблем как определение механизмов устойчивости и саморегуляции почвы на всех уровнях ее организации и использования, количественной диагностики состояния и поддержания плодородия и предотвращения деградации почвы, выбора высокоинформативных функциональных и фактологических оценочных критериев, имеющих экологическую и экономическую значимость, разработки системы научно обоснованных методов оздоровления деградированных и нарушенных почв. В подобной ситуации поиск интегральных характеристик оценки токсичности почв, позволяющих оценить последствия воздействия человека на эдафотоп, представляется актуальным. В равной степени это относится и к другим природным средам – вода и воздух. При этом следует констатировать отсутствие в мировой практике развитой методологии комплексного биотестирования почв, воды и воздуха как природных, так и искусственных экосистем. Вместо этого наблюдается тенденция к применению отдельных биотестов, что приводит к неадекватному отражению степени загрязнения окружающей среды и влиянию ее на человека. Действительно, оценку токсичности проводят по влиянию почвы, воды или воздуха на отдельные функции организма, такие как дыхание, подвижность, рост, пищеварение и т.п. Кроме того, использование в биотестах живых организмов и культур приводит к большой ошибке измерения. Предлагаемая в проекте «ферментативная функциональная модель живого организма» (ФМО) как комплексный биотест может помочь в решении обозначенной проблемы. Этот комплексный биотест сконструирован из набора ферментативных биотестов, в которых осуществляется связь «ключевые ферменты – функция организма». В сумме набор таких ключевых ферментов должен адекватно отражать влияние токсичной среды на жизнедеятельность организма в целом. В системе биотестов такой комплексный биотест необходим, так как он отражает влияние токсичной среды на молекулярном уровне.
Целью исследования является разработка новой методологии комплексной экспрессной оценки качества и загрязнения почвы на основе ферментов светящихся бактерий.
Достигнутыми научными результатами работ по проекту за 2018 год являются:
1. разработана лабораторная комплексная методика биотестирования почв. Методика представляет собой способ экологического контроля проб почвы разного целевого назначения, в том числе загрязненных промышленными, сельскохозяйственными, бытовыми токсикантами и их смесями в концентрациях от 0,1 до 1000 ПДК и выше и может быть использована для оценки качества почвы, экологического картирования и мониторинга. Метод основан на регистрации степени ингибирования активности ферментов токсическими веществами, содержащимися в анализируемой пробе почвы. Для обеспечения достоверности результатов тестирования в КФБ включены ферменты и ферментные системы, различающиеся по чувствительности к различным классам токсических соединений, а именно: моноферментная реакция, катализируемая бутирилхолинэстеразой, биферментная реакция NADH:FMN-оксидоредуктаза + люцифераза, триферментная реакция лактатдегидрогеназа + NADH:FMN-оксидоредуктаза + люцифераза;
2. предложен состав Портативной лаборатории для осуществления комплексного биотеста определения загрязнения и качества почвы, включающий необходимы приборы, мелкое лабораторное оборудование, материалы и реактивы для проведения анализа, а именно: приборы для измерения активности бутирилхолинэстеразы – спектрофотометры (стационарные и портативные); приборы для измерения активности биолюминесцентных ферментов – биолюминометры (стационарные и портативные); приборы и расходные материалы, используемые для приготовления и хранения водных почвенных вытяжек; необходимые реактивы для проведения анализа;
3. ФБУ «Государственный региональный центр стандартизации, метрологии и испытаний в Красноярском крае» проведен анализ исходных данных и представил план работ для аттестации и внедрению методики измерений качества почв на основе комплексного ферментативного теста, необходимых для коммерциализации исследований, проведенных в настоящем проекте;
4. на основе анализа изученных образцов почв выявлены и сконструированы эталонные образцы почвы в качестве постоянных стандартов и контрольных образцов в комплексном ферментативном биотесте. Образцы для опытов были отобраны в экологически чистых районах, что исключало техногенное загрязнение почв и пород (ОПХ «Минино», Емельяновский район, лесной массив «Погорельский бор», Емельяновский район, пойма р. Енисей, Березовский район);
5. доработана база данных и проведено наполнение ее информацией на основе характеристик изученных образцов почвы. Разработана схема базы данных исследования почвенных образцов с управляющей моделью изучения почвенных образцов для Платформы консолидации данных научных исследований, включающая описание справочников − «Тип почвы», «Место отбора проб» и «Почвенный горизонт» − и исследований − «Почвенный разрез», «Подвижный азот и фосфор в почве» и «Гумусное состояние». На основе управляющей модели создана модельно-ориентированная система исследования почвенных образцов, включая пользовательский интерфейс создания и редактирования структурных элементов базы данных, генерации форм ввода данных, анализа данных в табличном виде и интеллектуальной обработки данных методом k-средних. Предложенное информационное решение по организации данных исследования почвенных образцов реализует возможность структурированного хранения данных, создавая основу для сопоставления результатов смежным исследований, аналитической обработки данных и развития предложенной базы данных, сообразно выбранному направлению научных изысканий. Выбранная программная Платформа консолидации данных обеспечивает сохранность научных данных, их согласованность и многопользовательский доступ к информации;
6. проведена оценка перспектив и ограничений предлагаемых подходов по сравнению с известными методами. Предложенный способ мониторинга почв является конкурентоспособным по сравнению с существующими аналогами и превосходит отечественные и зарубежные аналоги по скорости и точности анализа, простоте проведения процедуры анализа, позволяет проводить анализ загрязнения почв не только в лабораторных, но и в полевых условиях;
7.разработаны рекомендации по применению полученных результатов для решения проблем мониторинга разного типа почв и состояния почвенного покрова с использованием комплексной методики биолюминесцентного ферментативного тестирования;
8. ссылки на информационные ресурсы в сети Интернет (url-адреса), посвященные проекту:
http://news.sfu-kras.ru/node/20978 ; http://news.sfu-kras.ru/node/19863; https://tass.ru/nauka/5713416; http://news.sfu-kras.ru/node/20914; http://gazeta.sfu-kras.ru/files/gazeta/U_Life_201-1.pdf; https://gnkk.ru/news/krasnoyarskie-uchenye-predlagayut-polu/; http://newslab.ru/article/854451.
Публикации
1. Есимбекова Е.Н, Калябина В.П., Кратасюк В.А. APPLICATION OF BIOLUMINESCENT ENZYMATIC TESTS IN ECOTOXICOLOGY International Scientific Publications. Ecology & Safety., - (год публикации - 2018)
2. О.С. Сутормин, Е.М. Колосова, Е.В. Немцева, О.В. Искорнева, А.Е. Лисица, В.С. Матвиенко, Е.Н. Есимбекова, В.А. Кратасюк Ферментативное биотестирование почв: сравнение чувствительности к токсикантам моно-, би- и триферментной систем Цитология, №10, том 60, стр. 826-829 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.7868/S0041377118100132
3. Сачкова А.С., Ковель Е.С., Чурилов Г.Н., Стом Д.И., Кудряшёва Н.С. Biological activity of carbonic nano-structures—comparison via enzymatic bioassay Journal of Soils and Sediments, - (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1007/s11368-018-2134-9
4. Сутормин О.С., Суковатая И.Е., Панде Ш., Кратасюк В.А. Effect of viscosity on efficiency of enzyme catalysis of bacterial luciferase coupled with lactate dehydrogenase and NAD(P)H:FMN-Oxidoreductase Molecular Catalysis, - (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1016/j.mcat.2018.08.012
5. Шпедт А.А., Аксенова Ю.В. Soil Exhaustion Criteria for Central Siberia Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, - (год публикации - 2018)
6. Я.В. Фрицлер, Е.Н. Есимбековаа, В.А. Кратасюк Bioluminescent enzyme inhibition based assay of metal nanoparticles Журнал Сибирского федерального университета. Биология, - (год публикации - )
7. Е.Н. Есимбекова, В. А. Кратасюк, Е.В. Немцева, Н.С. Кудряшёва, С.Е. Медведева, М.А. Кириллова Биолюминесцентные биотесты: современное состояние и перспективы Сибирский федеральный университет, г. Красноярск, - (год публикации - 2018)
8. Есимбекова Е.Н., Кратасюк В.А. Rapid Bioluminescent Enzymatic Assay for Toxicological Assessment of Metal Nanoparticles Сборник тезисов 20 International Symposium for Bioluminescence and Chemiluminescence, - (год публикации - 2018)
9. Колоcова Е.М, Римацкая Н.В., Лисица А.Е., Сутормин О.С., Кратасюк В.А. The comparison of enzyme systems for soil contamination bioassay Сборник тезисов SETAC Europe 28th Annual Meeting, - (год публикации - 2018)
10. Коробко А.,Коробко А., Колосова Е. Constructing the model-driven system for scientific researches support on the original software platform for primary data consolidation International Multidisciplinary Scientific GeoConference: SGEM, - (год публикации - 2018)
11. Кратасюк В.А., Есимбекова Е.Н. Can living organisms in bioassays be replaced on enzymes? Сборник тезисов 20 International Symposium for Bioluminescence and Chemiluminescence, - (год публикации - 2018)
12. Кратасюк В.А., Есимбекова Е.Н. Applications of Luminous Bacteria Enzymes in Toxicology and Ecology Сборник тезисов SETAC Europe 28th Annual Meeting, - (год публикации - 2018)
13. Немцева Е.В., Чмурина О.С, Герасимова М.А. The correlation between fluorescent properties of water extract from soil and its effect on bioluminescent enzymatic bioassay Сборник тезисов SETAC Europe 28th Annual Meeting, - (год публикации - 2018)
14. О.В. Искорнева, А.Е. Лисица, В.С. Матвиенко, Е.М. Колосова, Е.В. Немцева, Е.Н. Есимбекова, В.А. Кратасюк Ферментативное биотестирование почв: сравнение чувствительности к токсикантам моно-, би- и три-ферментной систем Сборник тезисов VI Молодежной конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН, - (год публикации - 2018)
15. Степанова Л.В., Колосова Е.М., Матвиенко В.С, Римацкая Н.В., Шпедт А.А. Кратасюк В.А. BIOLUMINESCENT ENZYMES IN TESTING OF THE SOILS CONTAMINATION Сборник тезисов 20 International Symposium for Bioluminescence and Chemiluminescence, - (год публикации - 2018)
16. Шпедт А.А., Кратасюк В.А., Римацкая Н.В., Колосова Е.М. Chernozems of Krasnoyarsk territory: modern state and direction of evolution The Proceedings of the 10th International Soil Science Congress on “Environment and Soil Resources Conservation”, - (год публикации - 2018)
17. Шпедт А.А., Кратасюк В.А., Римацкая Н.В., Колосова Е.М., Степанова Л.В., Матвиенко В.С. Оценка степени загрязнения урбиквазиземов промышленных районов Современное состояние черноземов: материалы 2 Международной научной конференции, - (год публикации - 2018)
18. - Наука ставит рекорды Газета "Новая университетская жизнь", - (год публикации - )
19. - Красноярские ученые предложили получать автомобильное топливо из канализационных осадков Краевая государственная газета «Наш Красноярский край», - (год публикации - )
20. - «Наука на страже экологии»: как сибирские ученые помогают спасти окружающую среду Интернет-газета «Newslab», - (год публикации - )
21. - Проекты учёных СФУ признаны лучшими на форуме «Инновации-2018» Пресс-служба Сибирского федерального универститета, - (год публикации - )
22. - Биолюминесцентную экспресс-лабораторию учёных СФУ представили на инновационной выставке в Москве Пресс-служба Сибирского федерального универститета, - (год публикации - )
23. - Ученые СФУ создали в лаборатории внутриклеточную среду светящихся бактерий ТАСС, - (год публикации - )
24. - Биофизики СФУ создали имитацию внутренней среды клетки светящихся бактерий Пресс-служба Сибирского федерального универститета, - (год публикации - )
Возможность практического использования результатов
Результаты, полученные в настоящем проекте могут быть основой для разработки прикладной НИР, чтобы использоваться в реальном секторе экономики. Разработанный биотест ФМО после доведения его до реального продукта должна входить как неотъемлемая часть в систему мониторинга загрязнения пахотных земель почв Красноярского региона для определения пределов устойчивости агроэкосистем и достижения цели рационального природопользования, предотвращения снижения продуктивности сельскохозяйственных культур, обусловленного снижением плодородия почв, снижения потенциального риска негативного воздействия на здоровье человека сельскохозяйственной продукции, выращенной на загрязненных почвах. Поэтому были разработаны рекомендации и предложения по использованию результатов НИР в дальнейших исследованиях и разработках.
Для устранения научно-технических рисков проекта необходимо провести следующие НИОКР:
1. Разработать технологический регламент производства многокомпонентного иммобилизованного реагента «ЭнзимолюмФМО», отвечающий современным требованиям биотехнологии и соответствующий российскому и международному стандарту качества, как самих ферментов, так и технологических процессов их производства. Для разработки технологического регламента необходимо:
• выбрать из Коллекции светящихся бактерий Института биофизики СО РАН штамм светящихся бактерий, отличающийся стабильными показателями по свечению и содержанию ферментов – NADH:FMN-оксидоредуктазы и люциферазы. Подобрать условия хранения штаммов, обеспечивающие сохранение их характеристик;
• стандартизовать условия получения биомассы светящихся бактерий, создать регламент для условий культивирования бактерий;
• стандартизовать условия получения из биомассы светящихся бактерий NADH:FMN -оксидоредуктазы;
• стандартизовать условия получения из биомассы светящихся бактерий люциферазы;
• стандартизовать условия получения смеси ферментов NADH:FMN-оксидоредуктазы и люциферазы для осуществления биферментной биолюминесцентной реакции;
• стандартизовать условия совместной иммобилизации ферментов светящихся бактерий и их субстратов в крахмальный или желатиновый гель;
• написать текст технологического регламента получения многокомпонентного иммобилизованного реагента, с описанием требований к условиям его производства (помещение, оборудование, реагенты, персонал и т.п.)
2. Для аттестации метода ферментативного биотестирования оценки токсичности почв ФМО для целей государственного экологического контроля необходимо:
• Сконструировать многокомпонентный реагент «ЭнзимолюмФМО» для проведения оценки токсичности почв на основе новой технологии иммобилизации ферментов светящихся бактерий. Это позволит максимально упростить проведение биотестирования на основе биотеста ФМО; получать многокомпонентные иммобилизованные реагенты, содержащие необходимый для анализа набор ферментов и субстратов; максимально снизить стоимость анализа за счет низкой себестоимости реагентов.
• Апробировать методику оценки токсичности почв с использованием многокомпонентного иммобилизованного реагента «ЭнзимолюмФМО», и откорректировать методику в соответствии с требованиями метрологической аттестации.
• Провести метрологическую аттестацию методики выполнения измерений на базе ФБУ «Государственный региональный центр стандартизации, метрологии и испытаний в Красноярском крае».
• Обратиться в ФЦАО «Федеральный центр анализа и оценки техногенных воздействий» (г.Москва) для внесения методики в федеральный реестр природоохранной нормативной документации (ПНДФ) для присвоения федерального номера и рекомендации методики для целей государственного экологического контроля.
• Апробировать биолюминесцентный метод ФМО для оценки токсичности почв с использованием лиофилизованного и иммобилизованного реагентов. Адаптировать биотест ФМО к существующим и активно продающимся экологическим службам страны приборам-биолюминометрам, создать формы реагента, пригодные для измерения на разных типах приборов-биолюминометров.
Исполнители проекта разработали чёткую стратегию по защите прав на интеллектуальную собственность. Патентный поиск и полный поиск публикаций по тематике проекта показал новизну предлагаемых решений, возможность защиты интеллектуальной собственности в России и за рубежом.
В условиях Красноярского края наибольшему техногенному загрязнению подвергнуты земли сельскохозяйственного использования, расположенные в радиусе 5-10 км от города Красноярска, в Назаровском и Ужурском районах, где используются химические средства защиты растений. Здесь имеются отдельные загрязнения кадмием, мышьяком, цинком, медью до 0,5-1,0 ПДК и даже более 1 ПДК.
Основными специфическими загрязняющими веществами являются фтористые соединения натрия, которые в окрестностях Красноярска подвергают почвы локальному техногенному загрязнению, преимущественно в северо-восточном по розе ветров направлении. В настоящее время в разной степени загрязнено более 129 тыс. га сельскохозяйственных угодий, из них до уровня чрезвычайно высокой степени (более 2,5 ПДК) – 3,5 тыс. га (2,6%); высоко опасной (1,0-2,5 ПДК) – 10,1 тыс. га (7,8 %). Кроме того, в зоне влияния КрАЗа 25,4 тыс. га земель имеют степень загрязнения немногим ниже 1 ПДК и еще на 48,0 тыс. га превышено фоновое содержание. К этому необходимо добавить, что почвенный покров в зоне загрязнения представлен в основном хорошо гумусированными обыкновенными и выщелоченными черноземами.
В связи с прогрессирующей антропогенной нагрузкой на землю и требованием устойчивого развития территорий, экологические регламенты в землепользовании становятся приоритетом. Необходимы современные производительные, экономически выгодные методики экологической оценки сельскохозяйственных земель и информативные комплексные показатели оценки, которые в режиме мониторинга позволят оперативно решать проблемы современного землепользования. Предлагаемый биолюминесцентный экспрессный анализ загрязнения почв может использоваться Центрами лабораторного анализа Росприроднадзора, референтными центрами Россельхознадзора, Государственными центрами и станциями агрохимической службы для ведения государственного экологического, комплексного мониторинга и охраны почв и земель разных категорий.