Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В рамках проекта проводится исследование микроэволюционных процессов связанных с формированием устойчивости насекомых к энтомопатогенам, а также изменением вирулентности патогенов в ходе коэволюции. В результате проведенных исследований установлено, что у насекомых, селектированных на устойчивость к энтомопатогенному грибу Beauveria bassiana, происходит увеличение активности фенолоксидаз и, соответственно, процесса меланизации, в покровных тканях при заражении грибом. Кроме того, в покровах селектированных насекомых происходит активация целого комплекса защитных реакций, таких как синтез ингибитора металлопротеаз, антимикробных белков и компонентов антиоксидантной системы, которые направлены на уничтожение прорастающих гифальных тел гриба, инактивацию его ферментов и токсинов (Dubovskiy et al., 2016). Установлено, что меланизм насекомых сопряжен с повышенной устойчивостью к грибам B. bassiana. Кутикула меланистов толще и в ней более активно идет процесс меланизации на ранних этапах микоза по сравнению с ахромистами. Кроме того, у меланистов выше активность процессов инкапсуляции в гемолимфе, и повышен конституциональный уровень антимикробных белков (Dubovskiy et al., 2016). При реализации проекта установлено, что эволюция иммунной системы насекомых, при отборе на устойчивость к грибным энтомопатегенам, идет совместно с увеличением активности систем, поддерживающих окислительно-восстановительный баланс при активной инкапсуляции патогена. При реализации проекта проведены исследования влияния температуры на взаимодействие насекомых с энтомопатогенными грибами. Показаны различия в интенсивности иммунного ответа у личинок вощинной огневки в зависимости от температуры и инфекционной нагрузки (Krukov et al., 2016). Установлено, что устойчивость насекомых линии, селектированной на устойчивость к бактериям Bacillus thuringiensis, определяется широким спектром конституциональных и индуцибельных защитных реакций иммунной и антиоксидантной систем, а также регенерационных процессов. В первую очередь изменения происходят в кишечнике насекомых, и направлены на инактивацию бактерий и их токсинов (Dubovskiy et al., 2016). В ходе выполнения проекта проведено изучение эпигенетических механизмов наследования на личинках вощинной огневки, селектированной на устойчивость к бактериям B. thuringiensis. Впервые установлено, что селекция насекомых на устойчивость к бактериям влияет на метилирование ДНК и ацетилирование гистонов, уровень экспрессии микроРНК (Krishnendu et al., in press). Установлено, что микроэволюционные адаптации грибов и бактерий к хозяину (пассажи через хозяина в течение нескольких поколений) могут приводить к изменению основных систем, отвечающих за вирулентность патогенов (Крюков и др., 2017 в печати).

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
За прошедший период был выполнен блок работ, связанный с изучением защитных реакций насекомых, формирующихся при селекции на устойчивость к бактериям. Полученные результаты свидетельствуют о том, что бактериальная инфекция Bacillus thuringiensis (БТ) вызывает в кишечнике насекомых окислительный стресс (повышение концентрации продуктов перекисного окисления липидов и окисление тиолов), для защиты от которого происходит повышение активности антиоксидантов насекомых. Таким образом, установлено, что одним из антибактериальных защитных механизмов насекомых, формирующимся в ходе микроэволюции, является повышенная продукция антиоксидантов в кишечнике. При реализации проекта за прошедший период был проведен направленный отбор личинок вощинной огневки по принципу устойчивости к грибу Metarhizium robertsii (Mr). Совместно со специалистами из Университета Суонси (Великобритания), проведены тончайшие эксперименты in vivo, названные "схватка в кутикуле", и позволяющие одновременно оценить силы противников, а именно, активность защитных систем насекомых и синтез факторов вирулентности гриба Mr в кутикуле насекомых на ранних этапах инфекционного процесса. Такой подход является новаторским, поскольку все предыдущие исследования такого плана выполнены in vitro. Метод РНК интерференции является одним из передовых для изучения функций различных генов и их продуктов. На данном этапе реализации проекта особое внимание посвящено вскрытию молекулярно-генетических маркеров резистентности при изучении механизмов устойчивости насекомых к грибу Metarhizium. Ранее установлено, при заражении селектированных личинок грибом происходит достоверная (р ≤ 0.05) активация экспрессии индуцибельного ингибитора металлопротеаз (IMPI) в покровах в 5 раз по сравнению с зараженными личинками контрольной линии. Для дальнейшего изучения вклада IMPI в эволюцию резистентности насекомых к грибам нами наработана dsRNA для блокирования экспрессии данного гена с помощью РНК интерференции. Впервые в мире проведен анализ эпигенетических изменений у насекомых при формировании устойчивости к бактериям и грибам. В ходе работ, впервые установлено, что селекция насекомых на устойчивость к бактериям и грибам приводит к увеличению метилирования ДНК, ацетилирования гистонов и уровня экспрессии ряда микроРНК, регулирующих реакции иммунной системы. Эти исследования мы проводим совместно со специалистами из Университета Гиссена (Германия). Результаты этой работы были опубликованы в 2017 году в журнале Virulence (IF 4.6). Известно, что энтомопатогенные грибы и бактерии постоянно эволюционируют для успешного преодоления защитных систем хозяина. У патогенов широко представлены гидролитические ферменты, которые позволяют проникнуть через кутикулу или кишечник насекомых, а также токсины, подавляющие иммунитет и препятствующие развитию вторичных инфекций. При реализации проекта для определения стратегий эволюции патогенов проведены шестикратные пассажи грибов Beauveria bassiana и Metarhizium robertsii через вощинную огневку с последующей оценкой фенотипических и генетических различий исходного штамма и реизолятов. Проведены эксперименты по пассированию бактерий БТ через линии вощинной огневки с повышенным уровнем устойчивости к данным бактериям (селектированная линия) и нативную линию насекомых. Установлено, что пассажи через устойчивого хозяина приводят к изменению вирулентности бактерий. Полученные за отчётный год результаты были представлены на XV съезде Русского энтомологического общества (Новосибирск), конференции «Высокопроизводительное секвенирование в геномике» (Новосибирск) и конференции по модельным системам (Греция). Кроме того, полученные данные обсуждались на круглом столе по Экспериментальной эволюции на III международной конференции «Современные проблемы биологической эволюции» (Москва).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе реализации проекта был выполнен блок работ, связанный с изучением защитных реакций насекомых, формирующихся при селекции на устойчивость к бактериям. Изучена роль антиоксидантной системы насекомых при формировании устойчивости к бактериям БТ. В частности, охарактеризован окислительно-восстановительный баланс у устойчивых и восприимчивых к бактериям насекомых. Установлено, что антиоксиданты и белки теплового шока (БТШ) принимают участие в защите организма насекомого при бактериальной инфекции. Особенно это выражено в жировом теле зараженных насекомых. Возможно, БТШ выступают дополнительным фактором, стабилизирующим работу клеток на фоне стресса, вызванного бактериальным токсикозом. Таким образом, повышенный базовый уровень экспрессии данных генов в жировом теле устойчивых насекомых может быть адаптацией защитной системы насекомых к бактериям БТ. Вопрос о роли микробиоты кишечника насекомых в развитии инфекционного процесса, вызванного бактериями БТ, до сих пор остается спорным среди ученных. Результаты проведенных нами исследований свидетельствует, что развитие бактериоза БТ приводит к резким изменениям в качественном и количественном составе кишечной микрофлоры. Происходит кардинальная смена доминантных видов бактерий. При этом селекция насекомых на устойчивость к БТ не оказывает такого эффекта. Однако, при заражении бактериями БТ у устойчивых насекомых не детектируются или обнаружены, но в меньшем количестве, представители условно-патогенной микрофлоры, которые были отмечены у чувствительных к БТ насекомых. Таким образом, установлено, что развитие инфекции, вызванной БТ, вызывает изменение состава микробиоты насекомых, но при этом поддержание постоянства состава микробиоты у насекомых при формировании устойчивости к бактериям, вероятно , является адаптивным преимуществом. Известно, что при развитии инфекций, вызванных энтомопатогенными грибами и/или бактериями, критическим этапом, определяющим исход заражения, является проникновение патогена в организм насекомых. При реализации проекта определены ключевые гены вирулентности грибов и гены резистентности насекомых на ранних этапах инфекционного процесса. Установлено, что важнейшее значение играют антимикробные белки, антиоксиданты и ингибиторы металлопротеаз насекомых. Со стороны гриба идет активный синтез факторов адгезии, белков теплового шока и протеаз. В ходе реализации проекта охарактеризованы основные показатели вирулентности штаммов бактерий БТ (образование токсинов: эндотоксин, энтеротоксины, фосфолипазы и пр.), пассированных через устойчивую и восприимчивую линии насекомых. Установлено, что пассажи бактерий через восприимчивых насекомых приводят к снижению вирулентности штаммов, а также появлению новой морфологической формы у бактерий – колоний с ровным краем. Полученные данные позволяют сделать предположение, что эволюция вирулентности бактерий БТ направлена на снижение уровня токсинообразования. По-видимому, это связано со сменой жизненной стратегии бактерий, которая позволяет им успешно персистировать в популяции насекомых. Если бактерии сталкиваются с устойчивым хозяином, то этот процесс еще более выражен. Вопрос сохранения вирулентности бактерии и условий для ее повышения остается открытым. Изучен вклад гормонов стресса-дофаминов (ДА) и роль инкапсуляции - важнейшей защитной реакции клеточного иммунитета насекомых при развитии инфекционного процесса и микроэволюционных механизмах формирования резистентности к патогенам. Полученные данные свидетельствуют, что концентрация ДА резко повышается на стадии инфекционного процесса, когда грибы проникают в организм насекомых через кутикулу. Этот этап грибной инфекции сопровождался как увеличением смертности, так и увеличением концентрации ДА. Таким образом, ДА может использоваться как маркер стресса, так и инфекционного процесса в исследованиях на насекомых.