Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Быстрая хромосомная эволюция полевок рода Lasiopodomys. Родовой статус Lasiopodomys и его разделение на подроды Lasiopodomys (L. mandarinus, L. brandtii) и Stenocranius (L. gregalis, L. raddei) не являются общепризнанными из-за противоречий в морфологических и молекулярных данных. Чтобы получить цитогнетические доказательства родового статуса Lasiopodomys и его разделения на подроды, а также для того, чтобы проверить гипотезу о происхождении комплекса половых хромосом у L. mandarinus путем транслокации аутосом на половые хромосомы, мы гибридизовали хромосомные пэйнтинг-пробы темной полевки (Microtus agrestis, MAG) и копытного лемминга (Dicrostonyx torquatus, DTO) на метафазные хромосомы самки китайской полевки (L. mandarinus, 2n = 47) и самца полевки Брандта (L. brandtii, 2n = 34). Дополнительно мы провели локализацию набора проб копытного лемминга на хромосомы самки узкочерепной полевки (L. gregalis, 2n = 36). Межвидовой хромосомный пэйнтинг позволил выявить 3 цитогенетические ассоциации (MAG12/18, 17a/19 и 22/24), которые могут подтверждать родовой статус Lasiopodomys и указывают на эволюционную принадлежность L. gregalis этому роду. Кроме того, в кариотипах всех трех видов сохранились ассоциации MAG1bc/17b и 2/8a, выявленные ранее в кариотипах всех изученных полевковых. Ассоциации MAG2a/8a/19b, 8b/21, 9b/23, 11/13b, 12b/18, 17a/19a и 5 разрывов предковых сегментов характерны для подрода Lasiopodomys. Мы также подтвердили гипотезу о происхождении комплекса половых хромосом у L. mandarinus путем транслокации аутосом на половые хромосомы. Две последовательные транслокации аутосом на предковую Х хромосому у L. mandarinus привели к формированию комплекса, состоящего из neo-X1, neo-X2 и neo-X3 элементов. Наши результаты показывают, что род Lasiopodomys представляет собой яркий пример быстрой хромосомной эволюции, затрагивающей как аутосомы, так и половые хромосомы. Множественные перестройки кариотипа, включавшие Робертсоновские слияния, разрывы хромосом, инверсии и накопление гетерохромосматина, привели к формированию кариотипов современных видов за очень короткий эволюционный промежуток времени около 2.4 млн. лет. Хромосомы и геномы ящериц рода Anolis. У ящериц зафиксировано удивительное разнообразие систем определения пола. Чешуйчатые с точки зрения геномов изучены недостаточно хорошо: геном только одного вида был секвенирован, проанализован и отчасти собран (Anolis carolinensis). Род Anolis является разнообразным таксоном ящериц состоящим из более чем 400 видов, который часто используют в качестве модельного рода рептилий. Большинство видов этого рода обладают гомоморфными половыми хромосомами, причем система XY по-видимому эволюционировала из одной и той же пары аутосом и является общей для всего рода. В этой работе мы обнаружили основные тенденции эволюции половых хромосом у анолисов, цитогенетически проанализировав 9 видов. Особо интересными случаями оказались виды A. sagrei и A. pogus. С помощью проточного сортинга мы получили хромосом-специфические библиотеки A. carolinensis, A. sagrei и A. pogus. Сравнительный пэйнтинг между A. carolinensis (ACA) и A. sagrei показал наличие сигнала нескольких аутосом ACA на половых хромосомах A. sagrei, тогда как у A. pogus была обнаружена система X1X2Y, также включающая районы гомологии с аутосомами ACA. С помощью секвенирования нового поколения хромосомспецифических библиотек мы охарактеризовали содержание и структуру микрохромосом A. carolinensis и A. sagrei. Это позволило нам провести картирование незаякоренных скэффолдов A. carolinensis на микрохромосомы ACA. В итоге, объединив данные полученные из FISH и секвенирования мы смогли выяснить генетический состав хромосомспецефичных библиотек. Хромосомспецефичные библиотеки сложно изучать с помощью методов секвенирования, в первую очередь, из-за кросс-контаминаций. В этой работе был использован новый биоинформатический метод, который позволяет связывать цитогенетические данные и данные секвенирования посредством хромосомспецефичных проб. Этот метод может быть применен к любым видам, для которых необходимо провести геномное картирование скэффолдов. На все двенадцать микрохромосом ACA были картированы ранее незаякоренные скэффолды. Впервые было показано, что тринадцатая микрохромосома ACA является половой X хромосомой этого вида. Сравнительный анализ показал, что половые хромосомы A. sagrei претерпели слияние с тремя микроаутосомами, а часть материала Y-хромосомы была потеряна в результате вырождения. Что является неординарным случаем, слияния аутосом с половыми хромосомами происходят нечасто, а у близкородственных A. carolinensis и A. sagrei за короткий эволюционный период было обнаружено три слияния. У ACA все гомологи генов, регулирующих каскад определения пола у других позвоночных, были обнаружены на аутосомах. Половой каскад может регулировать сильно измененый паралог одного из этих генов, либо в каскад встроился новый ген-регулятор (как например у некоторых коститстых рыб). Кроме того, в первый год проекта мы начали работу по локализации специфических BAC-клонов на аутосомы и половые хромосомы видов разных таксонов китопарнокопытных, начали работу по конструированию карт хромосом верблюдов (альпака и одногорбый верблюд) с помощью радиационных гибридов, получению микродиссекционных библиотек и их локализации у видов полевок, получению с помощью DOP-PCR и WGA методов специфических библиотек В- и половых хромосом у различных видов позвоночных, продолжили изучение образцов древней ДНК лошадей, лосей и медведей.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
За текущий год была проделана работа по картированию Х хромосом 18 представителей Китопарнокопытных. Был поведен анализ перестроек, поиск филогенетических маркеров, построены предковые Х хромосомы. На основании этой работы была опубликована статья «X chromosome evolution in Cetartiodactyla». Так же в ходе работы по изучению Х хромосом было выявлено уникальное расположение ядрышкового организатора на половых хромосомах яванского оленька, а так же выявлено разнообразие морфологии Х хромосомы представителей Bovidae. В рамках этого проекта были локализованы библиотеки хромосом одногорбого верблюда и человека на хромосомах овцебыка - единственного сохранившегося представителя мегафауны.Сейчас идет активная подготовка к публикации этих данных. Началась работа по выявлению эволюционных точек разрывов хромосом жвачных локализацией BAC-клонов на метафазных хромосомах яванского оленька и жирафа. На данный момент уже локализована большая часть зондов. Закончена локализация проб, соответствующих q-плечу хромосомы MOEC1 (=MAG2/8=AAK1) и хромосоме MOEC7 (=MAG3=AAK3), на хромосомах 17 оставшихся видов полевковых. Выполнено полное описание внутрихромосомных перестроек внутри консервативных сегментов, гомологичных этим участкам хромосом у 28 видов полевковых. Показано преобладание сдвигов центромер в участках, гомологичных предковых хромосомам полевковых AAK1 и AAK7 (= MAG1=MOEC1p) и парацентрических инверсий в районе, гомологичном AAK3. Опубликована статья, содержащая часть результатов работы по изучению района AAK7 Проведено детальное описание кариотипа хомячка Соколова с использованием С- и G-бэндинга, хромосомного пэйнтинга. Данные подтверждают видовой статус хомячка Соколова и указывают на то, что его кариотип сформирован, по крайней мере, за счет 4 робертсоновских событий и одного центромерного сдвига. Результаты представлены в статье Ведется работа по описанию хромосомного веера Ellobius alaicus. Сборка геномов млекопитающих до уровня хромосом является чрезвычайно актуальной проблемой учитывая, чточисло полностью отсеквенированных геномов уже приближается к сотне. На настоящий момент нет генома верблюжьих собранного до уровня хромосом. Одним из проверенных методов физического картирования необходимого для полноценной хромосомной сборки генома является построение карты радиационных гибридов. Мы продолжили работу с полученными клонами радиационных гибридов одногорбого верблюда. Мы протестировали 186 клонов 5000 РАД и 93 клона 15000 РАД с помощью 44 маркеров, равномерно распределенных по геному. Проанализировав результаты мы отобрали клоны с наилучшей воспроизводимостью ПЦР, с наименьшим числом расхождений между повторными ПЦР и с продуктивной для дальнейшего анализа частотой удержания фрагментов. В результаты мы сформировали финальные панели радиационных гибридов Camelus dromedarius 5000 РАД и 15000РАД со средней частотой удержания фрагментов 50% и 39%. Комбинация панелей может быть использована для получения карт высокого уровня разрешения. Мы продолжили работы по разработке маркеров для картирования хромосомы 16 верблюда и работы по применению методик сборки генома третьего поколения. Мы дополнительно провели анализ карт радиационных гибридов для хромосом Х и 16 альпаки. Получены суспензии хромосом для эндемичного вида Camelus ferus. Разработка таких ресурсов необходима для дальнейшего шага исследования геномов верблюжьих. Полный сиквенс генома позволяет обнаруживать генетические основы биологических особенностей различных видов млекопитающих, а также сложных процессов таких как видобразование и доместикация. В сотрудничестве с Университетом Урбана-Шампейн (США) в составе международной команды, мы провели полное секвенирование генома лисицы (Vulpes vulpes). Для анализа геномных данных мы использовали полученные ранее данные сравнительного хромосомного пейнтинга и тонкого картирования хромосом лисицы. Создание сборки генома позволило провести дальнейший анализ генетических основ доместикации в рамках многолетнего эксперимента по выведению контрастных линий доместицированных и агресивных лисиц и выявить 113 районов генома, различающих данные популяции. Многие из генов в этих районах связаны наследственными растройствами у человека. Идентификация таких таргетных районов позволит проводить дальнейшие исследования генов, отвечающих за доместикацию направленно. Исследование половых и добавочных хромосом разных видов позвоночных с использованием методов высокопроизводительного секвенирования выявило необычные детали эволюции этих необычных элементов генома: мы предположили происхождение добавочных хромосом из половых хромосом у желтогорлой мыши Apodemus flavicollis и копытного лемминга Dicrostonyx torquatus ; выявили неравномерные скорости эволюции добавочных хромосом лисицы и енотовидной собаки, а также обнаружили необычно высокие скорости преобразований половых хромосом у игуановых ящериц. Мы разработали технологию поиска хромосомспецифичных повторов для характеризации кариотипов с большим числов похожих элементов. Для лошади Оводова, возрастом 32 тыс. лет из Денисовой пещеры, Алтай, проведено выделение ДНК, высокопроизводительное секвенирование библиотек, обогащенных целевыми фрагментами. Биоинформационный анализ показал, что E. ovodovi ближе к зебрам, чем к ослам (E. asinus, E. hemionus) или киангу E. kiang, в то время как предыдущее исследование (Vilstrup et al., 2013) указывает на базальное положение среди них. Наши данные расширили географический ареал и время существования вида E. ovodovi. Анализ фрагмента Д-петли митохондриальной ДНК из 17 овечьих костей (~ 4000-1000 лет), обнаруженных в археологических комплексах на юге Алтая (Западная Сибирь), показал, что 15 образцов относятся к ранее описанным линиям A, B, C, D и E и два образца имеют уникальные гаплотипы и имеют базальное положение относительно остальной части анализируемых образцов. Большое разнообразие гаплотипов может свидетельствовать, что Алтайский регион, был транспортным путем более 1000 лет назад.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Полный сиквенс генома позволяет обнаруживать генетические основы биологических особенностей различных видов млекопитающих, а также сложных процессов таких как видобразование и доместикация. В сотрудничестве с Университетом Урбана-Шампейн (США) в составе международной команды, мы провели полное секвенирование генома лисицы (Vulpes vulpes). Для анализа геномных данных мы использовали полученные ранее данные сравнительного хромосомного пейнтинга и тонкого картирования хромосом лисицы. Создание сборки генома позволило провести дальнейший анализ генетических основ доместикации в рамках многолетнего эксперимента по выведению контрастных линий доместицированных и агресивных лисиц и выявить 113 районов генома (включая ген SorCS1), различающих данные популяции. Многие из генов в этих районах связаны наследственными расстройствами у человека. Идентификация таких таргетных районов позволит проводить дальнейшие исследования генов, отвечающих за доместикацию направленно. Проведено секвенирование В хромосом лисы и китайской енотовидной собаки, что позволило получить список геномных районов и генов, лежащих на этих хромосомах. Результаты хорошо согласуются с более ранними исследованиями и в то же время значительно расширяют наши представления о составе добавочных хромосом этих видов. Для лисицы данные о геномных районах В хромосом впервые были верифицированы с привлечением данных полногеномного секвенирования. Секвенирование трех В хромосом с одной метафазной пластинки лисицы показало, что одна из В хромосом является частично вырожденной, в то время как две других несут полные наборы геномных районов. Сравнение состава генов на В хромосомах шести видов млекопитающих, исследованных к настоящему моменту, показало обогащение регуляторами клеточного деления, раннего развития, а также синапса нейронов. Также обнаружены пять случаев независимого повторного включения генов в состав B-хромосом у разных видов. Большинство из этих генов относятся к одной из перепредставленных категорий. Полученные данные поддерживают гипотезу об активной вовлеченности В-хромосомных копий генов в их раннюю эволюцию. В цитогенетике всегда существует потребность в быстром и эффективном методе, который одновременно выявлял бы разные особенности хромосом. Мы представили новый метод CDAG (C-banding by Denaturing After G-banding), который может быть эффективно выполнен на одной метафазе. На первом этапе получают GTG-бэндинг и регистрируют метафазу, затем препараты денатурируют при 700C в присутствии формамида, и ренатурируют в растворе соли 2xSSC при 600C и затем наносят флуоресцентные красители: DAPI и хромомицин A3. CDAG особенно ценен для идентификации AT- и GC-обогащенного конститутивного гетерохроматина у разных млекопитающих с уникальными кариотипическими характеристиками, такими как крупные центромерные и теломерные блоки, выдающийся интерстициальный гетерохроматин, полностью гетерохроматиновые хромосомные плечи и преимущественно гетерохроматиновые хромосомы. Основными преимуществами разработанного нами метода являются легкая воспроизводимость протокола, надежная идентификация C-позитивной хромосомы и характеристика состава гетерохроматина (насыщенный AT- / GC). Предложенный подход дает возможность получить более подробную характеристику конститутивного гетерохроматина в отличие от стандартныого метода CBG. Путем секвенирования микродиссектированных хромосом были исследованы малая сверхчисленная хромосома человека, а также добавочные хромосомы двух видов мышей рода Apodemus. Для добавочной хромосомы человека показана гомология с прицентромерным районом длинного плеча хромосомы 15 длиной около 12 млн п.н., а также локализация точек разрыва в альфа-сателлитной ДНК. Впервые показано, что разработанный метод биоинформатического анализа данных секвенирования отдельных хромосом является перспективной альтернативой существующим методам описания хромосомных аномалий человека. Добавочные хромосомы Apodemus flavicollis и A. peninsulae состоят из более чем 20 районов с десятками генов, при этом единственным общим геном является Vrk1, кодирующий киназу-регуятор клеточной пролиферации. Общие черты добавочных хромосом - обогащение повторенными последовательностями, в частности тандемными и эндоретровирусами; а также накопление большого числа мутаций, ведущих к псевдогенизации. Также выявлена вариабельность состава добавочных хромосом на уровне популяций A. flavicollis, а также между различными морфологическими типами внутри одной клетки у A. peninsulae Транслокации половых хромосом на аутосомы – редкие события. Единственный известный пример среди узконосых обезьян (Catarrhini) – гривистый тонкотел или серебристый лангур (Trachypithecus cristatus). У этого вида произошла реципрокная транслокация Y-хромосомы и аутосомы 1. В результате перестройки сформировалась система половых хромосом X1X2Y1Y2. Известно, что существует как минимум три хромосомных варианта интактной хромосомы 1. С помощью панели из более чем 150 человеческих BAC-клонов мы охарактеризовали с высокой степенью разрешения транслоцированные варианты (Y1 и Y2) и полимфорные формы интактной хромосомы 1. Выполнено описание внутрихромосомных перестроек внутри ряда консервативных сегментов у 28 видов полевковых. Показано преобладание сдвигов центромер в участках, гомологичных предковых хромосомам полевковых AAK1 и AAK7 (= MAG1=MOEC1p) и парацентрических инверсий в районе, гомологичном AAK3. Было показано необычное расположение ядрышек на двух половых хромосомах представителя Жвачных (Ruminantia) Яванского оленька (Tragulus javanicus). При помощи FISH (fluorescence in situ hybridization) анализа с пробами, содержащими последовательности рибосомной ДНК (18S, 5.8S, и 28S), выявили единственный сайт локализации на двух половых хромосомах – Х и Y. Мы продолжили работу с полученными клонами радиационных гибридов одногорбого верблюда. Мы протестировали 186 клонов 5000 РАД и 93 клона 15000 РАД с помощью 44 маркеров, равномерно распределенных по геному. Проанализировав результаты мы отобрали клоны с наилучшей воспроизводимостью ПЦР, с наименьшим числом расхождений между повторными ПЦР и с продуктивной для дальнейшего анализа частотой удержания фрагментов. В результаты мы сформировали финальные панели радиационных гибридов Camelus dromedarius 5000 РАД и 15000РАД со средней частотой удержания фрагментов 50% и 39%. Комбинация панелей может быть использована для получения карт высокого уровня разрешения. Добавочные хромосомы рептилий были описаны только на цитогенетическом уровне и никогда не были секвенированы или проанализированы на молекулярном уровне. Один из модельных видов чешуйчатых с доступной полной сборкой генома — Anolis carolinensis. Целью нашей работы являлось описание генетического материала дополнительных хромосом A. carolinensis. Мы подтвердили присутствие B хромосом у этого вида с помощью обратного пэйнтинга и анализа синаптонемных комплексов. Для анализа последовательностей B хромосомы мы применили высокопроизводительное секвенирование. Черты B хромосомы анолиса схожи с чертами дополнительных хромосом из других таксонов: на ней находятся гены связанные с клеточным делением (INCENP и SPIRE2), она обогащена специфичными повторами и сильно псевдогенезирована. В 2018 г.опубликовано 10 статей, еще две статьи находятся на рецензии. 1. Capozzi O, Stanyon R, Archidiacono N, Ishida T, Romanenko SA, Rocchi M. Rapid emergence of independent “chromosomal lineages” in silvered-leaf monkey triggered by Y/autosome translocation. (doi: 10.1038/s41598-018-21509-4) Sci Reports 8: 3250, 2018 2. Perelman PL, Pichler R, Gaggl A, Larkin DM, Raudsepp T, Alshanbari F, Holl HM, Brooks SA, Burger PA, Periasamy K. Construction of two whole genome radiation hybrid panels for dromedary (Camelus dromedarius): 5000RAD and 15000RAD. (doi: 10.1038/s41598-018-20223-5) Sci Reports 8: 1982, 2018 3. Proskuryakova AA, Kulemzina AI, Perelman PL, Serdukova NA, Ryder OA, Graphodatsky AS. The case of X and Y localization of nucleolus organizer regions (NORs) in Tragulus javanicus (Cetartiodactyla, Mammalia). (doi: 10.3390/genes9060312) Genes 9(6): 312, 2018 4. Pavlova SV, Biltueva LS, Romanenko SA, Lemskaya NA, Shchinov AV, Abramov AV, Rozhnov VV. First cytogenetic analysis of lesser gymnures (Mammalia, Galericidae, Hylomys) from Vietnam. (doi: 10.3897/CompCytogen.v12i3.27207) Comp Cytogen 12(3): 361-372, 2018 5. Kukekova AV, Johnson JL, Xiang X, Feng S, Liu S, Rando HM, Kharlamova AV, Herbeck Y, Serdyukova NA, Xiong Z, Beklemischeva V, Koepfli K-, Gulevich RG, Vladimirova AV, Hekman JP, Perelman PL, Graphodatsky AS, O’Brien SJ, Wang X, Clark AG, Acland GM, Trut LN, Zhang G. Red fox genome assembly identifies genomic regions associated with tame and aggressive behaviours. (doi: 10.1038/s41559-018-0611-6) Nat Ecol Evol. 2018;2(9):1479-91. 6. Makunin AI, Romanenko SA, Beklemisheva VR, Perelman PL, Druzhkova AS, Petrova KO, Prokopov DY, Chernyaeva EN, Johnson JL, Kukekova AV, Yang F, Ferguson-Smith MA, Graphodatsky AS, Trifonov VA. Sequencing of supernumerary chromosomes of red fox and raccoon dog confirms a non-random gene acquisition by B chromosomes. (doi: 10.3390/genes9080405) Genes 9(8): 405, 2018 7. Makunin AI, Rajičić M, Karamysheva TV, Romanenko SA, Druzhkova AS, Blagojević J, Vujošević M, Rubtsov NB, Graphodatsky AS, Trifonov VA. Low-pass single-chromosome sequencing of human small supernumerary marker chromosomes (sSMCs) and Apodemus B chromosomes. (doi: 10.1007/s00412-018-0662-0) Chromosoma 127(3): 301–311, 2018 8. Lemskaya NA, Kulemzina AI, Beklemisheva VR, Biltueva LS, Proskuryakova AA, Hallenbeck JM, Perelman PP, Graphodatsky AS. A combined banding method that allows the reliable identification of chromosomes as well as differentiation of AT- and GC-rich heterochromatin. Chromosome Res, 2018, doi: 10.1007/s10577-018-9589-9 9. Kichigin IG, Lisachov AP, Giovannotti M, Makunin AI, Kabilov MR, O’Brien PCM, Ferguson-Smith MF, Graphodatsky AS, Trifonov VA. First report on B chromosome content in a reptilian species: the case of Anolis carolinensis. Mol Genet Genomics, 2018, doi: 10.1007/s00438-018-1483-9 10. Romanenko S, Serdyukova N, Perelman P, Trifonov V, Golenishchev F, Bulatova N, Stanyon R, Graphodatsky A. Multiple intrasyntenic rearrangements and rapid speciation in voles. (doi: 10.1038/s41598-018-33300-6) Sci Reports 8: 14980, 2018 Farré M, Kim J, Proskurjakova AA, Kulemzina AI, Zhang Y, Huang Z, Yao X, Fang X, Rando HM, Perelman P, Li X, Kukekova AV, Zhao W, Zhang G, Wang J, O’Brien SJ, Graphodatsky AS, Ma J, Lewin HA, Larkin DM Coevolution of chromosome changes and gene regulation in ruminants. Genome Res (in press) Elbers JP, Rogers MF, Perelman PL, Horin P, Corander J, Murphy D, Burger PA Improving Illumina assemblies with Hi-C and long-reads: an example with the North African dromedary. Molecular Ecology Resources (in press)