Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Целью данного проекта является разработка основ для создания лекарственных средств на основе информации о взаимодействии с Cys-петельными рецепторами различных белковых и пептидных соединений с перспективой пептидного синтеза их активных фрагментов и расширения исследований с помощью синтеза аналогов. В качестве мишени лекарств выбраны мышечные и нейрональные никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР), а в качестве их лигандов белки семейства Ly6 (эндогенные модуляторы активности нАХР), а также α-конотоксины, ценность которых состоит в избирательности взаимодействия с различными (мышечными и нейрональными) подтипами нАХР. Составными частями проекта в 2016 году являлись: - Моделирование пространственных структур эндогенных белков семейства Ly6 (Lynx1, SLURP-1 и SLURP-2), а также их комплексов с нАХР; - Синтез центральных петель этих белков и фиксация их структуры введением по С- и N-концам остатков цистеина и замыканием дисульфидных связей; - Анализ биологической активности синтезированных фрагментов Lynx1, SLURP-1 и SLURP-2; - Разработка условий для анализа различных подтипов нАХР методами электрофизиологии и кальциевого имиджинга; - В ходе выполнения проекта появилась идея, и были синтезированы фрагменты не только лигандов, но и С-петли из активного центра Cys-петельных рецепторов; - Синтез набора α-конотоксинов, имеющих выраженную специфичность в отношении определенных подтипов нейрональных нАХР, а также их аналогов; - Анализ взаимодействия синтетических конотоксинов с соответствующими рецепторами методами радиолигандного анализа и электрофизиологии, а также методом рентгеноструктурного анализа с ацетилхолин-связывающим белком (АХБ) -моделью лиганд-связывающих доменов нАХР и всех остальных Cys-петельных рецепторов; - В протеомных исследованиях различных ядов оценка присутствия фосфолипаз А2 – потенциальных модуляторов активности нАХР и как возможного источника новых биологически активных пептидных фрагментов. В результате выполнения указанных работ получены следующие результаты: 1. Были выбраны для синтеза три фрагмента центральной петли из трех белков семейства Ly-6, а также 6 представителей группы α-конотоксинов, обладающих различной селективностью по отношению к разным подтипам нАХР, включая неприродные аналоги α-конотоксинов RgIA , PnIA и GIC. 2. В процессе выполнения работ по данному проекту нами была сформулирована гипотеза о том, что для восстановления нарушенного в разнообразных патологиях баланса между эндогенными лигандами и соответствующими рецепторами могут быть использованы и синтетические фрагменты рецепторов. Такие молекулы могут стать новым направлением в заместительной терапии состояний, характеризующихся повышенной экспрессией эндогенных трехпетельных лигандов семейства Ly6. Начальным этапом стало исследование по рациональному конструированию пептидов на основе фрагментов нАХР, связывающих Ly6-подобные нейротоксины из ядов змей. К настоящему моменту нами проведен скрининг различных производных таких пептидов, осуществлен синтез 10 из них на основе С-петли нАХР и АХБ и в радиолигандных и электрофизиологических тестах выяснены важные закономерности их структурно-функциональных отношений. 3. Были синтезированы пептидные фрагменты Lynx1, SLURP-1 и SLURP-2 - Cys[Lynx1,29-43]Cys; Cys[SLURP1,31-48]Cys и Cys[SLURP2,50-65]Cys в количестве 10, 5 и 16 мг, соответственно. Чистота пептидов составила более 96 %. 4. Синтезирована серия природных α-конотоксинов – PIA, RgIA, TxIA, BuIA, а также аналог RgIA с неприродным замыканием дисульфидной связи в количестве от 2 до 5 мг. Чистота пептидов составила более 94%. Проведено исследование их биологической активности методами рентгеноструктурного анализа, электрофизиологии и радиолигандного анализа. 5. В процессе выполнения проекта была проведена экспрессия функциональных рецепторов в клеточных культурах и ооцитах шпорцевых лягушек. Экспрессионная систем была оптимизирована с помощью описанного недавно в литературе шаперона NACHO. Данный шаперон повышает количество экспрессированного на поверхности трансфицированных клеток нАХР α7 подтипа, что позволяет существенно улучшить данные флуоресцентного анализа цитоплазматического кальция в соответствующих тест-системах. 6. Биологическая активность пептидных фрагментов Lynx1, SLURP-1 и SLURP-2 - Cys[Lynx1, 29-43]Cys; Cys[SLURP1, 31-48]Cys и Cys[SLURP2, 50-65]Cys была оценена методом конкурентного радиолигандного анализа с меченным α-бунгаротоксином (125I-Bgt) в качестве радиолиганда. В качестве мишеней для связывания использовали мембраны электрического органа ската T. californica, содержащие холинорецепторы мышечного типа, а также клетки линии GH4C1, гетерологически экспрессирующие гомоолигомерный нейрональный α7 нАХР человека. Наибольшее сродство к мишеням обнаружено для пептидного фрагмента Lynx1. При этом его сродство к мышечному рецептору из T. californica оказалось более чем в 30 раз выше, чем к нейрональному α7 нАХР. 7. Была создана виртуальная библиотека производных бромтриптофана, включающая более 800 соединений. 8. Показано присутствие фосфолипаз А2, потенциальных модуляторов активности никотиновых рецепторов, практически во всех проанализированных ядах.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Поскольку в основе проекта проекта лежит использование в качестве потенциальных лекарственных средств синтетических соединений на основе природных пептидов и фрагментов белков, работа в отчетном году проводилась по следующим направлениям: 1. Cинтез природных α-конотоксинов, различающихся по специфичности в отношении нескольких подтипов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР), их аналогов и радиоактивных производных. Так как α9 подтип нАХР рассматривается целевым при разработки новых анальгетиков, а α7 подтип нАХР служит мишенью для поиска соединений, облегчающих протекание болезни Альцгеймера, были получены радиоактивно меченные иодированные производные α-конотоксинов RgIA и GeXIVA, специфичных к первому подтипу рецептора, и аналогов α-конотоксина PnIA, взаимодействующего со вторым подтипом, которые могут выполнять роль маркеров этих рецепторов. Были продолжены работы по созданию на основе конотоксинов аналогов устойчивых в физиологических условиях, что привело к синтезу α-конотоксина RgIA с заменными дисульфидными связями на тиоэфирные, который сохранил способность взаимодействовать с α9 подтипом нАХР и при этом оказался в несколько раз стабильнее в сыворотке крови человека. 2. На основе структуры белка Lynx1 смоделирована и синтезирована стабилизированная дисудьфидом центральная петля белка дрозофилы SSS (sleepless). Этот фрагмент показал способность эффективно взаимодействовать с мышечным, α7 и α9 подтипами нАХР и при этом не обладал цитотоксичностью и влиянием на пролиферацию клеток, предполагая дальнейшее тестирование данного пептида в экспериментах in vivo. 3. Для белка SLURP1 (так же, как Lynx1 и SSS , принадлежащего к семейству Ly6 белков) была получена серия флуоресцентых производных с метками FITC, Alexa Fluor 546 и TMR и оценена возможность использования их как флуоресцентных маркеров для соответствующих подтипов нАХР на различных клеточных линиях. 4. В дополнение к основной теме проекта на отчетном этапе были продолжены исследования низкомолекулярных биологически активных соединений из различных источников. Так, из яда серой жабы Bufo bufo были выделены N-субериларгинин, N-пимелоиларгинин и N-адипиларгинином. активирующие α1β3 рецептор γ-аминомасляной кислоты, а также ди- и триметильные производные серотонина (5-гирокситриптамина) - буфотенин и буфотенидин, которые оказались эффективными агонистами α7 нАХР, но антагонистами мышечного подтипа рецептора. 5. Кроме того, успешно продолжены работы по синтезу первых соединений из сконструированной виртуальной библиотеки аналогов 6-бромогипафорина (производное триптофана) с различными комбинациями заместителей. Подтверждение функциональной активности в отношении α7 и α4β2 подтипов нАХР для ожидаемых по теоретическим расчетам аналогов свидетельствует о правильном выборе расчетного метода. Некоторые из аналогов показали сродство к α7 нАХР на полтора порядка большее, чем для исходного 6-бромогипафорина. 6. Испытания биологической активности α-конотоксинов и их радиоактивных аналогов, производных аминокислот из яда жабы, синтетических фрагментов эндогенных белков ( SSS) и флуоресцентных производных белков (SLURP-1) проведены на клеточных линиях, содержащих нАХР или рецептор γ-аминомасляной кислоты, на лиганд-связывающем экстрацеллюлярном домене (ЭД) α9 субъединицы нАХР, а также на ацетилхолин-связывающих белках, моделирующих ЭД не только никотиновых, но остальных представителей Cys-петельных рецепторов.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Кристаллизация пептидов с моделями нАХР С разрешением 2.26 Å установлена кристаллическая структура комплекса дегликозилированного экстрацеллюлярного домена (ЭД) альфа9 субъединицы нАХР человека с глобулярным изомером альфа-конотоксина RgIA. Структура связанного с конотоксином белка практически не отличается от структуры несвязанной формы этого же белка, но структура конотоксина отличается от его индивидуальной ЯМР структуры. Причина: подвижность в последнем случае С-концевого Arg13, а также возникновение альфа-спиральной структуры в центральной части связанного RgIA за счет образования внутримолекулярного солевого моста между Asp5 и Arg7 у связанного конотоксина RgIA. Полученная структура близка к другими структурам альфа-конотоксинов в комплексе с ацетилхолин-связывающими белками (АХСБ), вне зависимости от длины и аминокислотного состава этих конотоксинов, с наибольшим расхождением в С-концевой части пептидов. Принципиально важно, что взаимодействие RgIA с мономерным ЭД альфа 9 субъединицы происходит при сходной ориентации и в том же участке связывания, что и для других конотоксинов на пентамерной форме АХСБ, например, альфа-конотоксина ImI . Это означает, что структура комплекса с ЭД должна соответствовать ориентации альфа-конотоксина RgIА на полноразмерном альфа9/альфа10 нАХР с альфа9- субъединицей в качестве (+)-интерфейса сайта связывания. На основании установленной структуры комплекса альфа9 ЭД/RgIA, с привлечением методов компьютерного моделирования и молекулярной динамики были сконструированы все возможные стехиометрические модели комплексов данного конотоксина с соответствующими пентамерными рецепторами человека - (альфа9)2(альфа10)3 и (альфа9)3(альфа10)2. Моделирование показало возможность образования и структурную схожесть всех трех вариантов. Анализ механизмов связывания конотоксинов, ингибирующих α9/α10 нАХР, являющихся мишенями для разработки анальгетиков Другое достижение за 2018 г. в исследовании конотоксинов касается как уже рассмотренного альфа-конотоксина RgIA, так и открытого сравнительно недавно необычного αO-конотоксина GeXIVA. Они были синтезированы в виде изомеров с разным положением дисульфидных связей. Также синтезированы их йодированные аналоги. Радиолигандным анализом (по конкуренции с радииодированным альфа-бунгаротоксином) исследована их активность в отношении экстрацеллюлярного домена α9 нАХР и АХСБ Aplysia californica, а электрофизиологическими методами с использованием ооцитов Xenopus исследована активность в отношении гетерологически экспрессированного полноразмерного рецептора α9α10. Установлено, что конотоксины RgIA и GeXIVA связываются с ортостерическим сайтом α9 LBD, но высокий уровень сорбции их на Ni2+-NTA-агарозе не позволил определить точную константу связывания по конкуренции с[125I]-αBgt. Получены иодированные производные обоих конотоксинов как в «холодном» варианте (127I), так и в радиоактивном (125I). С первыми электрофизиологические опыты на α9/α10 нАХР показали, что иодированные производные сохранили ингибирующую активность природных конотоксинов и потому их радиоактивные формы пригодны для детального исследования механизмов действия данных конотоксинов. Именно радиоидированые производные выявили неспецифическое связывание с Ni 2+-NTA-агарозой. Такое связывание отсутствовало с ацетилхолин-связывающими белками (не требующими каких-либо смол) и на них было показано связывание RgIA и GeXIVA по ортостерическим участкам. Таким образом, точное выяснение того, в какой мере с полноразмерными α9/α10 нАХР конотоксин GeXIVA взаимодействует по аллостерическим и/или ортостерическим центрам потребует дальнейших исследований. Олигоаргинины –новый класс ингибиторов никотиновых рецепторов Поскольку в описанных конотоксинах имеется большое число остатков Arg (9 в конотоксине GeXIVA), при выяснении причин упомянутого неспецифического связывания со смолой в качестве контроля мы проверили олигоаргининовые пептиды R8 и R16. В конкуренции с альфа-бунгаротоксином они не проявляли неспецифического связывания со смолой, но мы обнаружили их эффективное связывание с альфа9 доменом и с нАХР. Была синтезирована серия пептидов R3, R6, R8, R16, а также триптофансодержащие аналоги WR2 и W2R4. Пептиды R8 и R16 проявили определённую селективность к нАХР α9α10-типа, продемонстрировав наномолярные значения констант IC50, что важно в контексте высокой клинической значимости нАХР α9α10-типа как мишеней для разработки анальгетиков. Полученные нами результаты должны учитываться в связи с использованием олигоаргининовых пептидов для таргетной доставки терапевтических препаратов. Биологически активные синтетические фрагменты белков семейства Ly6 Поскольку белки семейства Ly6, подобно α-нейротоксинам змей, имеют трех-петельную структуру и некоторые из них связываются с нАХР, нами синтезированы фрагменты центральной петли Lynx1, SLURP1, SLURP2 человека и белка SSS Drosophila (15 аминокислотных остатков), на N- и C- концах добавлены остатки цистеина и замкнута дисульфидная связь. Наибольшую активность (IC50 около 30 мкM) против домена α9 нАХР человека и полноразмерного α9α10 нАХР крысы, экспрессированного в ооцитах Xenopus показали фрагменты SSS и Lynx1. При конкуренции за связывание с нАХР мышечного типа Torpedo californica получены IC50 4,8 и 6,6 мкM для Lynx1 и SSS соответственно. В отношении α7 нАХР, экспрессированного в клетках линии GH4C1, значения IC50 составили 13,1 and 173 мкM для пептидов SSS и Lynx1, соответственно. Активность фрагментов Lynx1 и SSS в микромолярном диапазоне коррелирует с литературными данными о микромолярной концентрации природного Lynx1 в мозге. Проведенные нами исследования показали отсутствие токсичности и цитотоксичности у синтезированных фрагментов, что указывает на перспективность их дальнейшего исследования как возможных лекарственных средств Синтетические производные аналога аминокислоты Исследована линейка низкомолекулярных аналогов 6-бромогипафорина (6-BHP), природного активатора альфа7 нАХР, в результате чего получены новые аналоги с более высокой аффинностью (8 соединений из 13 синтезированных), чем у исходного природного соединения. Ряд полученных аналогов превосходит по своей аффинности в отношении альфа7 нАхР природный эндогенный нейромедиатор ацетилхолин, а также эпибатидин, широко применяемый в лабораторных исследованиях лиганд нАХР. В результате исследования взаимодействия панели синтетических аналогов 6-ВНР с альфа7 нАхР методом радиолигандного анализа установлено соответствие параметров связывания исследованных аналогов с параметрами функционального тестирования. Эти данные свидетельствуют о том, что все изученные соединения являются агонистами альфа7 нАхР. Показан иммуномодулирующий эффект одного из полученных соединений в опытах in vitro и in vivo. Продемонстрирована принципиальная применимость препаратов данной группы для контроля воспалительных процессов путем воздействия на альфа7 нАХР.