Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Для анализа архитектуры активного центра известных ферментов, гидролизующих фосфорорганические соединения и совмещение активных центров выбранных ферментов с активным центром антител на первом этапе был проведен выбор наиболее подходящего фермента, способного гидролизовать фосфорорганические соединения. В результате анализа литературы было найдено 4 группы ферментов, способных к гидролизу фосфорорганических соединений. Все ферменты были использованы в качестве потенциальных биологических антидотов при терапии отравления фосфорорганическими токсинами. Группа 1, включает в себя параоксоназу из плазмы крови человека [Mackness et al., Gen. Pharmacol, 1998] и диизопропилфторфосфатаза (ДФФаза) из каракатицы Loligo vulgaris [Blum et al., J Am Chem Soc, 2006]. В группу 2 входит фермент ангидролаза фосфорорганических кислот из Alteromonas sp (АФК). [Vyas et al., Biochemistry, 2010] Группа 3 - метилпаратионгидролаза из Pseudomonas sp (МПГаза). [Dong et al., J Mol Biol, 2005] Группа 4 - фосфотриэстераза из Pseudomonas diminuta (ФТЭаза) [Benning et al., J Biol Chem, 2000]. Для решения поставленной в проекте задачи, было проведено совмещение структур антитела A17 (PDB 2XZC) и структур ферментов, используя в качестве точки совмещения атом фосфора. После совмещения в структуре абзима при помощи написанного на языке Python скрипта, использующего модуль pymol, был выполнен автоматический поиск наиболее подходящих для замен соседних остатков. Было установлено, что наиболее подходящей структурой активного центра является структура фермента диизопропилфлуорофосфатазы из каракатицы Loligo vulgaris. Это обусловлено наиболее компактным размещением всех необходимых для катализа аминокислотных остатков и минимально возможный размер активного центра упрощает его воссоздание в остове другого белка. В результате совмещения активных центров были обнаружены позиции аминокислотных остатков для замены с целью реконструкции активного центра. В качестве критерия были выбраны близость Сα атомов и направление аминокислотных радикалов. После этого проводили минимизацию энергии структуры антитела А.17 с дистанционными ограничениями на расстояния между всеми Сα и Сβ атомами выбранных для внесения мутаций остатков. В результате конформация остова изменялась таким образом, чтобы туда точно помещался референсный активный центр. Значение силы дистанционных ограничений подбиралось эмпирически из диапазона 103 – 108 с логарифмическим шагом в 1. Для дальнейшей работы использовалась структура с лучшим RMSD по отношению к Сα-атомам активного центра. Значения RMSD, число и сила дистанционных ограничений представлены в таблице 2. Для полученных вариантов проводили дополнительный мутагенез с целью заполнения координационной сферы катиона Ca2+. Для двадцати лучших вариантов проводили QM/MM анализ протекания реакции, анализировали вероятность успеха протекания реакции (successful rate, SR), т.е. отношение количества запусков QM/MM системы приводящих к образованию продукта, к общему количеству запусков. В результате расчетов были предложены три варианта для экспериментальной проверки mut_231, mut_255, mut_432. С использованием последовательных ПЦР с перекрывающийхся праймеров и клонирования в вектор pFUSE по сайтам NcoI-XhoI (для тяжелой цепи) и XhoI-AvrII (для легкой цепи) были получены генетические конструкции для экспрессии гибридных антител в виде scFv-Fc в клетках линии HEK293T. На основании, полученных расчетов была создана библиотека активного центра БуХЭ, в которой замене подвергались остаток E325 и окружающие его остатки A328, F329, N397 и F398. Библиотека была создана с использованием перекрывающихся праймеров и клонирована в вектор pPic9k-α-SfiI-FLAG-anchor с использованием сайтов рестрикции SfiI. После трансформации клеток дрожжей P.pastoris штамм GS115 была получена клеточная библиотека БуХЭ с заякоренным на поверхности биокатализатором. Полученная библиотека инкапсулировалась в капли двойной эмульсии с использованием микрофлюидных чипов с диаметром каналов 60 мкм совместно с субстратами: экотиофатом и флуоресцентным субстратом HCAAME (Hydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-ylcarbamoyl)acrylic acid methyl ester, Millipore) или параоксон-резоруфином (Par-R). Было отобрано по 2000 событий для субстрата HCAAME и 438 событий для субстрата Par-R. Уровень сигнала для Par-R был существенно ниже. Отобранная фракция переносилась на чашку с YPD-агаром. После чего по 50 единичных колоний переносили в 24-луночный планшеты с жидкой средой YPD для наработки клеточной массы и криоконсервирования для последующих экспериментов. Основную роль в процессе ингибирования гидролаз серпином ААТ играет петля 368-393. Основным местом разрыва пептидной связи при обработке ААТ трипсином является связь между остатками M382 и S383. Анализ литературы показал, что аминокислотные остатки P3-P1 – придают специфичность для протеазы. В случае ААТ это остатки 380-IPM-382. Таким образом они являются первыми кандидатами для мутагенеза. С другой стороны, остатки P15-P8 являются очень важными для конформационной транслокации петли после образования комплекса ацил-фермент, особую роль отмечают для остатка P14. Таким образом, остатки 368-GTEAAGAM-375 не должны входить в библиотеку. Показано, что петля может незначительно различаться по количеству аминокислотных остатков (+/- 2 а.о.). Было проведено компьютерное моделирование стадии не ковалентного взаимодействия ААТ и БуХЭ, в результате которого было установлено, что длинны петли 368-393 не достаточно для контакта с каталитическим остатком S198 активного центра БуХЭ. Эти данные также были подтверждены анализом связывания БуХЭ и серпина ААТ с использованием системы BiaCore T200. В результате проведенных компьютерных исследований и анализа литературных данных было решено проводить мутагенез в положениях P7-P4’+3 (376-FLEAIPMSIPP-386) c введением 1, 2 или 3 остатков глицина для увеличения длинны петли. Были созданы генетические конструкции для фаг-дисплея на основе вектор pHEN2 и фагов M13. Предварительный трех раундовый скрининг показал, что наблюдается некоторое обогащение библиотеки, однако уровень его недостаточный (Рис. 6). В результате было решено сменить систему фагового дисплея на T7Select. Первый раунд отбор ожидается в начале 2017 года. Для оптимизации генетических конструкций для экспрессии целевых продуктов БуХЭ и его мутантных форм были проведены модификации генетических конструкций pFUSE-MAR-PRAD-F2A-BChE. Были получены конструкции pFUSE-2Xb-globin-PRAD-F2A-BChE и pFUSE-5'lyzozyme-MAR-PRAD-F2A-BChE. Конструкции содержали исуляторную последовательности бета-глобина курицы и последовательность 5' lyzozyme MAR курицы, соответственно.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Получение гибридного антитела-фермента способного к гидролизу фосфорорганических соединений имеет важное фундаментальное значение, ни одной лаборатории мира не удалось перенести каталитический центр из белкового фолда фермента в фолд другого белка, однако наша компетенция, подкреплённая работами по созданию биокатализаторов с использованием методов квантово-механических расчетов и возможностями суперкомпьютера Ломоносов, позволит решить эту проблему. В результате выполнения проекта в 2017 году была проведена экспрессия вариантов гибридного антитела-фермента mut_231, mut_255 и mut_432 для экспрессии в виде scFv-Fc, уровень экспрессии гибридных антител составил 0,4-1 мг/л. Однако формат экспрессии гибридных антител в виде scFv-Fc был признан нецелесообразным в виду низкого выхода рекомбинантного продукта поэтому были созданы конструкции для экспрессии гибридного антитела-фермента в виде полноразмерного антитела, которые будут использованы для котрансфекции клеток HEK293F и повторной оценки экспрессии и функциональной активности гибридных антител. С помощью методов квантово-механических расчетов были установлены атомистический механизм реакции взаимодействия, полученных ранее вариантов новых каталитических антидотов на основе БуХЭ – БуХЭ-14 и БуХЭ-15. Таким образом, мы смогли наблюдать канонический SN2-синхронный гидролиз ковалентного сопряженного комплекса. На самом деле мы также смогли наблюдать восстановления протонирования каталитического Ser198 из His438, полностью восстанавливая исходное состояние фермента. Разработанный метод был использован для более широкого поиска позиций для замен, в результате было установлено, что наиболее значимые замены для создания модифицированной библиотеки являются положения W82, а также петли 116-121 и 280-288 активного центра БуХЭ. Была создана библиотека серпина антитрипсина с пятью равномерно рандомизированными положениями с дополнительным 7.8X покрытием. Был создан специальный промежуточный вектора для предварительной сборки библиотеки. Вектор были создан на основе плазмиды pUC57, содержащей ААТ, фланкированный сайтами EcoRI и HindIII, и готовый к перестановке полученной библиотеки в геном фага. На данном этапе полученные библиотеки были собраны в вирионы и проведено три раунда отбора на рекомбинантную БуХЭ человека. Была проведена наработка фермента БуХЭ препаративных количествах. В результате было получено 75 мг очищенного препарата фермента, который был использован для экспериментов на животных. Была продолжена работа по оптимизации продукции функционально активных ингибиторов гидролаз. Полученный таким образом протокол рефолдинга для серпина PC позволил получить выход растворимого белка до 80%. По результатам, полученным в рамках отработки наработки, выделения, очистки и характеризации препаратов ингибиторов сериновых гидролаз была подготовлена к публикации статья в журнал Fish and Shellfish Immunology, IF2016 3.148. Статья отправлена в редакцию и проходит рецензирование. В связи с тем, что одной из основных задач проекта является создание эффективных биологических антидотов против отравления ФОТ на основе ферментов и антител, то важно учитывать возможные проблемы, связанные с возможным быстрым выведением его из организма. Для антител характерна относительна высокая стабильность в кровотоке и низкая иммуногенность. Для ферментов это проблема существует. Для решения этой проблемы был разработан протокол поиска условий полисиалирования, с помощью которого было получено три серии препарата со степенью очистки от исходных соединений более 98%, и которые обладали активность 78%, 91%, 87% от активности исходного препарата аргиназы, соответственно. Соотношение белок:ПСА составило 8.1+/-0.5 для всех серий. Данный протокол будет использован на дальнейших этапах работы по проекту для создания препаратов с пролонгированным биологическим эффектом. Бытовые отравлений фосфорорганическими пестицидам и инсектицидами на основе фосфорорганических соединений является социально-значимой проблемой. Такое отравление имеет характер хронического и в большинстве случаев не приводит к летальным исходам, но вызывает длительную потерю трудоспособности и инвалидизацию. Для тестирования препаратов биологических антидотов была создана мышиная модель хронического травления параоксоном. В настоящее время не описано мышиных моделей хронического травления фосфорорганическими пестицидами. Была отработана модель хронического травления мышей параоксоном и для дальнейших исследований протективной активности препаратов наиболее эффективно использовать дозировку параоксона 2 мг/кг.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Был завершен цикл исследований, посвященный разработке алгоримов описания кинетических механизмов каталитического гидролаза фосфорорганических субстратов бутирилхолинэстеразой. Таким образом, выяснен механизм действия каталитического антидота на основе БуХЭ при отравлении фосфорорганическими соединениями (ФОС). Полученные результаты были опубликованы во Frontiers Pharmacology (Q1) и в ряде интернет-изданий https://indicator.ru/news/2018/09/11/protivoyadie-ot-himicheskogo-oruzhiya/, https://www.gazeta.ru/science/news/2018/09/11/n_12020899.shtml. Показано, что разработанный метод in silico реконструкции активного центра доказал принципиальную возможность переноса активного центра фермента в структуру антитела, однако, он требует существенного улучшения. Мутантное антитело #432, предсказанное вычислительными методами, способно взаимодействовать с параоксоном, но эффективность такой реакции крайне низка. Оптимизация метода расчета на основе алгоритма DFTb позволило предсказать мутант параоксоназного антитела А17 с заменой лейцина на лизин в 47 положении легкой цепи, что повысило эффективность взаимодействия с параоксоном более чем в двести раз. Результаты были представлены на международной конференции FEBS 2018, г. Прага, Чехия. Было проведено структурно-функциональное исследование нового серпина камчатского краба P. Camtschaticus. Посредством профилирования активности пептидаз гемоцитов и плазмы мы обнаружили, что серпин PC ингибирует по меньшей мере две R/K-специфические активности, и показали, что он ингибирует индукцию фенолоксидазной активности (РО) в гемоцитах. Результаты работы были опубликованы в журнале FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY (Q1) и представлены на международной конференции FEBS 2018, г. Прага, Чехия. Разработана биомодель, позволяющая оценить физиологические проявления воздействия пестицида параоксон при пероральном введении в режиме субхронической токсичности. Внутривенное введение биопрепарата рекомбинантной БуХЭ в дозе 20 мг/кг позволило полностью избежать смертности и способствовало быстрому восстановлению поведения мышей после отравления. Детализированное исследование нейрофизиологических характеристик, а также обратимости воздействия ФОС в рамках разработанной биомодели субхронической токсичности, представляет высокий интерес и является предметом дальнейших исследований. Результаты были опубликованы в журнале Acta Naturae (Q2).