Аннотация результатов, полученных в 2016 году
1. В отчетном году мы проводили совершенствование технологии продукции антираковых антител: растительных биосимиляров трастузумаба (РБТ) и пертузумаба (РБП), а также их гликомодифицированных вариантов, РБТ-ΔXTFT и РБП-ΔXTFT полученных в трансгенных растениях N. benthamiana ΔXTFT с нокаутированными генами β1,2- xylose-transferase (ΔXT) и α1,3-fucose-transferase (ΔFT). Мы использовали два способа выращивания растения N. benthamiana: гидропоника и почва. Оба способа обеспечивали примерно одинаковый выход антител. Проведено совершенствование технологии очистки антител, связанное с отработкой оптимальных условий для ионообменных этапов очистки антител, следующих за аффинной хроматографией. Разработан оптимальный протокол продукции, выделения и очистки растительных биосимиляров. Мы столкнулись с проблемой масштабирования продукции, когда с увеличением массы листового материала мы наблюдали частичное протеолитическое разрезание тяжелой цепи антитела в ее шарнирной области. Определена стадия очистки, где возможно действие протеаз. Разработаны рекомендации для предотвращения протеолиза антител. 2. Нами разработан новый дизайн вектора, основанного на геноме вируса табачной мозаики крестоцветных (крВТМ), для продукции РБТ. Организация генома крВТМ, который в отличие от штамма U1, содержит участок внутренней инициации трансляции и область перекрывания в 25 кодонов между геном транспортного белка и геном белка оболочки, важные для репродуктивной функции крВТМ. Ранее наши коллеги из Icon Genetics, нарушив природную геномную структуру крВТМ, значительно модифицировали нуклеотидную последовательность генома, чтобы вектор на основе крВТМ обеспечивал высокий уровень продукции целевого белка. Более того, ввели растительные интроны в геном крВТМ в составе вектора. Сейчас мы показали, что добиться такой же эффективности в продукции РБТ можно, сохраняя природную геномную структуру крВТМ. 3. Воздействие на ядерно-цитоплазматический транспорт мРНК с помощью коротких некодирующих РНК (кнРНК) и сигнала ядерной локализации (NLS) может быть использовано для повышения продукции растительных биосимиляров кодируемых вирусными векторами. Нами показано, что в основе действия NLS, например, протимозина альфа человека (NLSpTα), лежит стимуляция в клетке мРНК гамма-тионина. Этот вывод был сделан на основании результатов поиска механизма стимулирующего действия NLSpTα. Использование метода субтрактивной гибридизации позволило нам получить клон кДНК, кодирующий гамма-тионин N.benthamiana. Для проверки предположения, что NLSpTα стимулирует мРНК гена гамма-тионина, мы с помощью агроинфильтрации ввели в лист плазмиду, направляющую в клетке синтез GFP:NLSpTα, и оказалось, что это резко стимулирует накопление эндогенной мРНК гамма-тионина. Подобный результат был получен также при введении в растительную клетку NLS из различных источников, включая NLS большого Т-антигена вируса SV40 (NLSSV40). Во всех случаях это приводило к индукции мРНК гамма-тионина. Для объяснения полученных результатов мы обратили внимание на то, что мРНК гамма-тионина - это короткая мРНК, и ее стимулирующее вирусную репродукцию действие возможно связано с конкуренцией за выход из ядра мРНК, кодирующих белковые факторы сайленсинга. Нами показано, что введение в лист плазмиды, кодирующий мРНК гамма-тионина, совместно вирсуными векторами, кодирующими ЛЦ и ТЦ РБТ, повышает продукцию РБТ. Мы заключили, что в основе стимулирующего эффекта кнРНК и NLS лежит общий механизм – конкуренция за выход из ядра с клеточными мРНК, кодирующими белковые факторы сайленсинга. 4. Разработана технология получения гликомодифицированных антител РБТ и РБП с использованием трансгенных растений с нокаутированными генами β1,2-xylose-transferase (ΔXT) и α1,3-fucose-transferase (ΔFT). Полученные данные показывают, что продукция РБП-ΔXTFT и РБТ-ΔXTFT в трансгенных растениях N. benthamiana ΔXTFT практически не отличается от продукции в растениях дикого типа. 5. Способность растений N. benthamiana ΔXTFT обеспечивать формирование антитела с составом гликанов, отличным от производимого в растениях дикого типа, была подтверждена нами при определении содержания углеводных остатков в препарате антител. Результаты показывают, что препараты РБТ-ΔXTFT полностью лишены остатков ксилозы и фукозы. Кроме того, в этих препаратах также существенно снижено содержание остатков N-ацетилглюкозамина, глюкозы и галактозы, что может указывать на изменение содержания сахаров не только в константной части, но и в антиген-связывающем фрагменте антитела, продуцируемого в трансгенных растениях N. benthamiana ΔXTFT с нокаутом генов XT и FT. 6. Проведен анализ присутствия α1,3-фукозы и ксилозы в Asn297-связанном гликане РБП-ΔXTFT и РБТ-ΔXTFT. Вестерн-блот анализ с использованием антител к α1,3-фукозе и ксилозе, а также тест с использованием пептид-N-гликозидазы F подтвердили отсутствие фукозы и ксилозы в составе РБП-ΔXTFT и РБТ-ΔXTFT. Пептидный анализ с последующей идентификацией модифицированных пептидов при использовании тандемного времяпролетного масс-спектрометра с лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF/TOF) показал, что Asn297-связанные гликаны РБП-WT и РБТ-WT представляют собой, главным образом, гликаны сложного типа GnGnXF. Сердцевинный участок Asn297-связанного гликана типа GnGn у РБП-WT и РБТ-WT содержит по остатку α1,3-фукозы и β1,2-ксилозы, что, наряду с отсутствием терминальной галактозы и сиаловой кислоты, отличает эти растительные биосимиляры от иммуноглобулина G человека. 7. Масс-спектрометрия N-гликозилированных пептидов тяжелой цепи РБТ и РБП показывает, что среди пиков пула легких гидрофильных пептидов были найдены сигналы около 3000 m/z. Серии этих пиков по расчету соответствовали пептидам полного и неполного протеолиза трипсином (EEQYNSTYR и TKPREEQYNSTYR, соответственно) с присоединенными гликанами GnGn, GnGnXF или GnGnX. В случае тяжелой цепи РБТ-WT и РБП-WT наблюдались сигналы, соответствующие присоединению GnGn, GnGnXF3 или GnGnX, причем два последних, характерных для гликопептидов с фукозой и/или ксилозой, отсутствовали в спектрах белка, продуцированного в растениях N. benthamiana ΔXTFT: РБТ-ΔXTFT и РБП-ΔXTFT. Важно отметить, что после обработки PNGase ТЦ РБТ-ΔXTFT были обнаружены только пики, соответствующие негликозилированным пептидам EEQYNSTYR и TKPREEQYNSTYR, при этом в случае РБТ-WT сохранялись пики, соответствующие пептидам EEQYNSTYR и TKPREEQYNSTYR с присоединенным гликаном GnGnXF3. Дополнительно были получены спектры фрагментации этих пептидов, которые подтвердили их принадлежность к гикозилированным формам пептида TKPREEQYNSTYR и стандартную форму гликоантенны GnGnXF3 и GnGn. Таким образом, полученные результаты показывают, что Asn297-связанные гликаны РБТ-WT и РБП-WT, представляют собой, главным образом, гликаны сложного типа GnGn и GnGnXF3, а гликаны РБТ-ΔXTFT и РБП-ΔXTFT – GnGn – не содержат ни ксилозы, ни фукозы. 8. Методом проточной цитофлуориметрии мы показали, что нет существенных различий в способности связываться с раковыми клетками между РБТ-WT, РБТ-ΔXTFT и герцептином. Препараты РБП-WT и РБП-ΔXTFT также с одинаковой эффективностью связывают HER2/neu-позитивные клетки. Таким образом, мы можем заключить, что продукция в растениях ΔXTFT гликомодифицированных антител РБП-ΔXTFT и РБТ-ΔXTFT не сказывается существенно на их способности взаимодействовать с онкобелком HER2/neu на поверхности опухолевых клеток ВТ-474. 9. Тестирование препарата РБТ-ΔXTFT в эксперименте по ингибированию пролиферации клеток SK-BR-3 показало ослабление его антираковой активности по сравнению с немодифицированным препаратом РБТ-WT. Тестирование препарата РБТ-ΔXTFT в эксперименте по торможению роста билатерально имплантированных подкожных ксенографтов рака молочной железы человека SK-BR-3 также показало снижение его антираковой активности по сравнению с немодифицированным препаратом РБТ-WT, что может быть связано с (а) пониженной стабильностью РБТ-ΔXTFT в организме мыши и низким уровне накопления в опухоли; (б) пониженной способностью связывать Fc рецепторы и обеспечивать другие эффекторные функции антитела. Детальное исследование поднятых вопросов будет проведено в 2017 году. 10. Определен дизайн и созданы генетические конструкции, кодирующие биспецифическое антитело «два в одном», способное в одном антителе совместить свойства РБТ и РБП.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1. Усовершенствована процедура очистки антираковых антител при их масштабном выделении из килограммовых количеств листового материала. Разработан протокол очистки антител, предотвращающий их деградацию. 2. Проведена модификация технологии продукции антираковых антител с использованием различных клеточных факторов N. benthamiana, влияющих на экспрессию генома и межклеточный транспорт: 2.1. Мутаротаза (альдоза 1-эпимераза). Трансгенные растения с нокдауном AELP могли бы быть использованы в качестве растений-фабрик для продукции антител с помощью вирусных векторов благодаря тому, что они характеризуются повышенной чувствительностью к вирусной инфекции. 2.2. Фактор, ассоциированный с некрозом листьев (ФАНЛ), или гомолог ингибитора протеазы Кунитца (ГИПК), вовлечен в межклеточный транспорт вирусной РНК, его повышенная экспрессия создает благоприятные условия для репродукции вируса, а, следовательно, повышается и эффективность экспрессии генов ЛЦ и ТЦ антител с вирусных векторов. 2.3. Гамма-тионин: выделение гена и его транскрипционного промотора. На основе этого промотора можно создать индуцируемую систему экспрессии, т.к. промотор чувствителен к появлению в клетке чужеродных белков с сигналом ядерной локализации, что приводит к активации транскрипции гена под его контролем. 3. Создана система векторов на основе промотора гена ФАНЛ (LNAF) для продукции антираковых антител. 3.1. Созданы векторы для продукции антител под контролем Pro-NbLNAF. На первом этапе мы создали генные конструкции, направляющих в клетке синтез РБТ под контролем транскрипционного промотора ФАНЛ. На втором этапе мы тестировали способность этого промотора направлять синтез легкой (ЛЦ) и тяжелых (ТЦ) цепей в агроинокулированных листьях N. benthamiana. Полученные результаты убедили нас в возможности использовать Pro-NbLNAF для продукции антител. В противоположность ранее полученным результатам с GUS (см. наш отчет за 2016 год), уровень синтеза антител ниже по сравнению с конструкциями под контролем 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты даже при использовании конструкции, кодирующей антисайленсинговый белок р19 вируса кустистой карликовости томатов. Тем не менее, мы считаем, Pro-NbLNAF может быть эффективно применен для продукции антител при использовании вирусных векторов. 3.2. Создан новый экспрессионный вектор, в котором под контролем промотора Pro-NbLNAF находится последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из ЛЦ и ТЦ РБТ, соединенных между собой 33-а.к. мостиком (KP6pp), узнаваемым эндогенной протеазой kex2p N. benthamiana (Hamorsky et al., 2013). На первом этапе мы создали вектор Pro-LNAF:PBT-KP6pp, кодирующий процессируемый РБТ (пРБТ). На втором этапе мы установили, что промоторы Pro-NbLNAF и 35S в описанном дизайне вектора имеют сходную способность направлять синтез пРБТ. 4. Методом плазмонного резонанса (SPR) определены константы связывания РБТ, взаимодействующего с 4-м доменом экзоклеточной части HER2/neu (ErbB2) и РБП, взаимодействующего со 2-м доменом экзоклеточной части HER2/neu (ErbB2) и препятствующим гетеродимеризации ErbB2 и ErbB3. Нами установлено, если константа диссоциации (Kd) для коммерческого препарата трастузумаба (Герцептина) и пертузумаба (Перьета) составляют, соответственно, 0.173± 0.095 нМ и 0.033 ±0.024 нМ, то для РБТ и РБП величины, соответственно, 0.017 ±0.002 нМ и 0.039 ±0.014 нМ. Kd исследованных антител находятся в пределах показателей, принятых для модифицированного трастузумаба (Kd=10-8–10-10 М). (Bostrom et al., 2011; Troise et al., 2008). 5. Впервые установлено влияние углеводного состава Asn297-связанного гликана на (а) накопление растительных биосимиляров в организме мыши с опухолями-ксенографтами; (б) способность взаимодействовать с FcγRIIIa рецептором на поверхности клеток; (в) антипролиферативный эффект по отношению к HER2-позитивным клеткам ВТ474. 5.1. Проведено исследование стабильности РБТ-ΔXTFT, меченных 125I, в организме мыши и уровня их накопления в опухоли. Мы установили динамику распределения радиоактивности РБТ-ΔXTFT в опухоли в сравнении с контрольным препаратом РБТ. Полученные результаты не выявили существенных различий между РБТ и РБТ-ΔXTFT в стабильности и накоплении меченных 125I антител в опухоли. 5.2. Проведенное исследование с использованием метода проточной цитофлуориметрии не выявило отличий биосимиляра трастузумаба РБТ-ΔXTFT от варианта РБТ, выделенного из растений дикого типа, в способности взаимодействовать с рецептором FcγRIIIa (CD16), экспонированным на поверхности клеток СНО-К1.С16. Биосимиляры пертузумаба (РБП-WT и РБП-ΔXTFT) также примерно с одинаковой эффективностью связывают рецептором FcγRIIIa (CD16). 5.3. Проведенное сравнительное исследование показало, что модификация углеводного состава Asn297-связанного гликана не повышает ингибирующую активность РБТ-ΔXTFT. Наоборот, гликомодификация приводила к снижению его антираковой активности, однако, не ниже уровня герцептина. 5.4. Совсем другой эффект гликомодификации мы обнаружили у биосимиляров пертузумаба (РБП). В случае РБП модификация углеводного состава Asn297-связанного гликана (РБП-ΔXTFT) усиливает антираковый эффект в сравнении не только с РБП, но и коммерческим препаратом пертузумаб (перьета). 6. Впервые установлена роль генов, контролирующих метаболизм эндогенных альдегидов в раковых клетках, в проявлении антираковой активности антител. В поиске факторов, влияющих на эффективность HER2 (ErbB2)-специфических антител, мы обратили внимание на гены раковых клеток, контролирующих метаболизм спиртов и альдегидов. Известно, что плохой прогноз при HER2-позитивном раке молочной железы связывают (Khoury et al., 2012; Liu et al., 2015) с высоким содержанием в раковых клетках мРНК гена ALDH, контролирующего метаболизм эндогенного ацетальдегида и формальдегида (Dorokhov et al., 2015). 6.1. Для установления роли генов, контролирующих метаболизм эндогенных альдегидов в раковых клетках, в проявлении антипролиферативного действия антител мы провели анализ содержания мРНК гена ErbB2 и генов CYP2E1, ALDH2, CAT, ADH5 (FDH), контролирующих метаболизм спиртов (этанола и метанола) и альдегидов (ацетальдегид и формальдегид), в клетках линии ВТ474, обработанных антителами, продуцированными в растении. Мы показали, что указанные антитела в концентрации 1 мкг/мл и 10 мкг/мл вызывают статистически достоверное снижение уровня мРНК ALDH2 в клетке. Мы предположили, что (а) антираковая активность антител, включая растительные биосимиляры, определяется не только их способностью взаимодействовать с экзоклеточной частью ErbB2, интернализацией и понижением экспрессии ErbB2 (Cuello et al., 2001), а также ингибированием пути PI3K/Akt (Nagata et al., 2004), но и их способностью снижать уровень мРНК ALDH2. 6.2. Проведено исследование уровня ингибирования пролиферации линий HER2/neu-позитивных раковых клеток (BT474, SKBR3, SKOV3) растительными биосимилярами, а также оценены изменения содержания мРНК ErbB2 и ALDH2. Установлена корреляция между уровнем ингибирования пролиферации клеток, вызванного растительными биосимилярами, и их способностью вызывать снижение содержания мРНК ErbB2 и ALDH2 в клетках. 7. Получены и исследованы биспецифические антитела «два в одном» РБТ-РБП. 7.1. Получены биспецифические антитела РБТ-РБП с двумя способами сборки, у которых вариабельная часть содержит последовательности РБП и РБТ, и названные нами как HCP-LCH и Bi-mAb. 7.2. С помощью метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR) определены константы взаимодействия с ErbB2-ECD биспецифических антител РБТ-РБП двух типов сборки (HCP-LCH и bi-mAB). Константа диссоциации (Kd) для HCP-LCH и Bi-mAb составляет, соответственно, 0.05 ±0.01 нМ и 0.181 ± 0.0761 нМ. Эти показатели находятся в пределах, принятых для модифицированного трастузумаба (Kd=10-8–10-10 М) (Bostrom et al., 2011; Troise et al., 2008). 7.3. С помощью проточной цитофлуориметрии определены параметры связывания биспецифических антител РБТ-РБП с антигеном ErbB2 на поверхности клеток ВТ474. 7.4. С помощью проточной цитофлуориметрии определены параметры связывания биспецифических антител РБТ-РБП с рецептором FcγRIIIa (CD16) на поверхности клеток СНО-К1.С16. 7.5. Проведенный нами МТТ-тест не выявил заметного ингибирования пролиферации клеток ВТ474 в присутствии антител РБТ-РБП. Низкая эффективность биспецифических антител (или ее полное отсутствие) может быть связана с их противоположным (относительно РБТ и РБП) действием на уровень мРНК ErbB2 и ALDH2. Намечен план исследований причин потери антираковой активности у биспецифических антител.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1.5.1. Усовершенствована технологическая платформа масштабированного получения растительных биосимиляров. 1.5.1.1. Разработан протокол продукции биосимиляров в растениях, выращенных на гидропонике. Подготовлено и переоборудовано в опытную теплицу помещение для размещения опытной гидропонной системы. Проведена оптимизация системы вентиляции, подачи раствора, поддержания температурного и светового режима для выращивания растений Nicotiana benthamiana, пригодных для последующей инфильтрации и продукции в них целевых белков, в т.ч. антител. Время культивирования растений до рабочего размера составляет 35-40 дней. Масса листьев без стеблей и корней составляет в среднем 25-30 грамм, что примерно на 40% больше, чем при культивировании растений в индивидуальных контейнерах с землей. Листья хорошо инфильтрируются бактериальной суспензией классическим лабораторным методом через шприц, а также могут быть инфильтрированы целыми блоками методом инфильтрации в вакуумной камере. 1.5.1.2. Определены границы использования методов агроинокуляции: (а) шприцевание; (б) нанесения суспензии агробактерий в присутствии сурфактантов (поверхностно-активных веществ); (в) вакуум-инфильтрация. При сравнении вакуум-инфильтрации и шприцевого ввода суспензии агробактерий можно сделать вывод, что вакуумный подход лучше за счет более полного и равномерного заполнения тканей листа суспензией агробактерий. Использование сурфактантов (Tween 80, 0,1%) не влияет на жизнеспособность клеток листа и оказывает положительное влияние на уровень экспрессии целевого гена. Эффективность экспрессии при использовании вакуумной инфильтрации и буфера, содержащего 0,1% Tween 80 выше, чем при использовании стандартного метода со шприцем. 1.5.2. Проведена оценка стабильности биспецифических антител РБТ-РБП (HCP-LCH и bi-mAb) в условиях функциональных тестов in vitro и in vivo, определено, в какой степени стабильность отражается на проявлении антителами антираковых свойств. При выяснении причин пониженного выхода биспецифических антител РБТ-РБП выяснилось, что большой вклад в нестабильность антител вносит протеолитическое одиночное расщепление шарнирной области (hinge region) тяжелой цепи пертузумаба, как об этом недавно сообщили американские исследователи. Это подтверждено и в наших экспериментах с биспецифическими антителами и дисульфирамом. Дисульфирам и его метаболиты способны связывать ионы меди или цинка, тем самым изменяя внутриклеточный уровень этих ионов тяжелых металлов и ингибируя активность цинк- и медь-зависимых ферментов, таких как супероксиддисмутаза или матриксные металлопротеиназы. Наши эксперименты с дисульфирамом также показали, что в его присутствии значительно повышается эффективность действия биспецифических антител РБТ-РБП. После воздействия биспецифических антител РБТ-РБП в присутствии дисульфирама резко падает выживаемость раковых клеток, что сопровождается накоплением в культуральной жидкости токсичного формальдегида. Кроме того, после воздействия биспецифических антител РБТ-РБП в присутствии дисульфирама выживаемость устойчивых к действию трастузумабу раковых клеток (ВТ-474, клон 5) снижается более чем в 10 раз, при этом также наблюдается накопление в культуральной жидкости формальдегида. Мы заключили, что дисульфирам, как антираковый адъювант, ингибируя альдегиддегидрогеназы, повышает эффективность действия антираковых антител. 1.5.3. Получены результаты по исследованию влияния биспецифических антител РБТ-РБП (HCP-LCH и bi-mAb) на экспрессию генов ErbB2, ALDH2, р27, PI3K/Akt, FDH в раковых клетках. 1.5.4. Получены результаты по исследованию влияния модификацией углеводного состава Asn297-связанного гликана биспецифических антител РБТ-РБП (HCP-LCH и bi-mAb) на физико-химические и биологические свойства биспецифических антител HCP-LCH-ΔXTFT и Bi-mAb-ΔXTFT. Оказалось, что биспецифические антитела из гликомодифицированных растений снижают выживаемость клеток BT-474 в отличие от антител, выделенных из растений дикого типа. В целом, мы заключили, что эффективность ингибирования пролиферации раковых клеток биспецифическими антителами РБТ-РБП, повышается как в присутствии дисульфирама, так и при модификации их профиля гликозилирования. 1.5.5. При исследовании влияния гликомодификации РБТ-ΔXTFT и РБП-ΔXTFT на свойства антител мы подтвердили, что (а) модификация углеводного состава Asn297-связанного гликана не повышает ингибирующую активность РБТ-ΔXTFT; (б) в случае РБП модификация углеводного состава Asn297-связанного гликана (РБП-ΔXTFT) усиливает антираковый эффект в сравнении не только с РБП, но и коммерческим препаратом пертузумаб (перьета); (в) статистически значимой корреляции между уровнем ингибирования пролиферации клеток и экспрессией генов ErbB2, ALDH2, р27, PI3K/Akt, FDH не выявлено. 1.5.6. Получены результаты по изучению и совершенствованию продукции растительных биосимиляров с использованием векторной системы ProLNAF-PBT-KP6pp (процессируемые растительные биосимиляры, пРБТ), когда слитые цепи антитела соединены 33-а.к. мостиком, узнаваемым эндогенной протеазой kex2p N. benthamiana, и синтез соответствующей мРНК находится под контролем транскриционного промотора ProLNAF: 1.5.6.1. Получены данные относительно физико-химических свойств пРБТ, включая результаты масс-спектроскопического анализа. После выделения и очистки пРБТ с помощью аффинной хроматографии на протеин А сефарозе мы обнаружили присутствие дополнительного белка ~80 кДа, который по результатам масс-спектроскопического анализа соответствует непроцессированному полипептиду ЛЦ-KP6pp-ТЦ. Определена доля этого полипептида, которая составляет около 25-30% от общего количества синтезируемых рекомбинантных компонентов антител. Также мы подтвердили, что в клетках происходит корректный процессинг полипептида ЛЦ-KP6pp-ТЦ с образованием индивидуальных ЛЦ и ТЦ. 1.5.6.2. Исследована возможность использования в агроинокуляционных экспериментах in trans гена, кодирующего эндогенную протеазу kex2p для обеспечения полного процессинга слитых антител: (а) проведен поиск среди потенциальных субтилизин-подобных протеаз растений, содержащих домена S8, предпочтительно среди представителей семейства Пасленовые, по гомологии с известными kex2p-протеазами дрожжей (kexin, EC 3.4.21.61), отбор осуществляли по наличию сигнальной последовательности, направляющей в аппарат Гольджи, и уровню экспрессии в листьях; (б) была выбрана последовательность субтилизин-подобной протеазы sdd1 (Nbv6.1trP14749) N. benthamiana, которая и была получена с помощью ПЦР с геномной ДНК N.benthamiana. При секвенировании полученного фрагмента мы обнаружили присутствие в нем двух интронов. Далее последовательность, соответствующая фрагменту геномной ДНК, была клонирована в бинарный вектор под контроль 35S-промотора (конструкция 35S-SBT1) для экспрессии в растении. После чего мы провели совместную агроинфильтрацию листьев N.benthamiana ProLNAF-PБT-KP6pp (или 35S-PБT-KP6pp) и 35S-SBT1. Вопреки нашим ожиданиям, доля непроцессированного белка не изменилась. Мы предположили, что процессинг полипептида ЛЦ-ТЦ может не осуществляться и по другой причине: возможно часть полипептида не попадает в аппарат Гольджи (АГ) и не встречается там с kex2p-подобной протеазой. Для проверки этой гипотезы мы применили подход, позволяющий по наличию N-связанного гликана определить, проходил ли полипептид через АГ. Так как ТЦ содержит сайт N-гликозилирования, а процессинг и созревание присоединенного гликана происходит в аппарате Гольджи, то присутствие N-связанного гликана в полипептиде ЛЦ-ТЦ укажет на то, что белок проходил через аппарат Гольджи. Для проверки, содержит ли ЛЦ-ТЦ гликан, мы использовали PNGase, которая отщепляет N-связанный гликан. Наблюдается ожидаемое изменение подвижности полипептида ЛЦ-ТЦ после обработки PNGase, следовательно, весь синтезированный полипептид ЛЦ-ТЦ проходит через АГ, где и гликозилируется. 1.5.6.3. Получены результаты по изучению биологической активности пРБТ, при использовании МТТ-теста на клетках ВТ474. пРБТ является функционально активным и статистически значимо ингибирует пролиферацию клеток, тем не менее, его активность несколько ниже, чем у герцептина. Мы связываем это с присутствием непроцессированной формы полипептида ЛЦ-ТЦ в препарате, т.к. предполагаем, что эта форма неактивна и не способна собираться в полноразмерные антитела. Возможно, удаление непроцессированного полипептида ЛЦ-ТЦ из препарата приведет к повышению эффективности ингибирования пролиферации ВТ474 антителами пРБТ. 1.5.7. Получены результаты по исследованию корреляции между экспрессией генов ALDH2, CAT, CYP2E1 и FDH линии раковых клеток ВТ474 и эффективности ингибирования пролиферации этих клеток антителами РБТ и РБП. Мы установили, что (а) РБТ в концентрации 10 мкг/мл снижает уровень мРНК гена ERBB2, а bi-mAb, наоборот, увеличивает, в то время как в концентрации 1 мкг/мл ни одно из антител не влияет на уровень мРНК ERBB2; (б) все упомянутые антитела снижают уровень мРНК ALDH2; (в) при обработке клеток РБТ дикого типа или гликомодифицированным РБТ повышение концентрации формальдегида незначительно, в то время как в присутствии дисульфирама его содержание резко увеличивается; (г) аптечные препараты HER2-cпецифичного герцептина увеличивают концентрацию формальдегида; (д) в образце с герцептином также наблюдается повышение содержание этанола по сравнению с контролем, а в присутствии дисульфирама концентрация этанола увеличивается. Мы заключили, что образование формальдегида клетками рака молочной железы после их обработки HER2-cпецифичными антителами является следствием ингибирования альдегиддегидрогеназ. Использование дисульфирама как ингибитора альдегиддегидрогеназ резко увеличивает как накопление формальдегида в культуре, так и степень ингибирования пролиферации раковых клеток. 1.5.8. Получены результаты по исследованию HER2/neu-экспрессирующих клеточных линий (BT474, SKBR3) и показано, что (а) уровень экспрессии генов, контролирующих метаболизм спиртов и альдегидов, разных линий HER2-позитивных клеток сильно варьируется и (б) чувствительность клеточных культур к воздействию HER2/neu-специфических антител против HER2/neu коррелирует с уровнем экспрессии генов, контролирующих метаболизм спиртов и альдегидов.