Аннотация результатов, полученных в 2016 году
1. Предложен метод синтеза новых пирролоаллоколхицинов, позволяющий получать целевые продукты в 8 стадий исходя из природного колхицина с сохранением конфигурации при С-7 асимметрическом центре. Для этого на первом этапе колхицин подвергали бромированию, что приводило к 4-бромколхицину, который подвергали сужению трополонового цикла, что завершалось образованием 4-бромоаллоколхициновой кислоты с суммарным выходом 85%. 4-Бромоаллоколхициновая кислота вступала в перегруппировку Курциуса с применением системы NaN3/Boc2O, что приводило к образованию 4-бромоаллоколхамина с суммарным выходом трех стадий 39%. На следующей стадии осуществляли йодирование 4-бромоаллоколхамина с участием NIS, завершающееся образованием орто-йодоанилина с выходом 70%. После введения в это производное трифторацетатной группы (93%), полученный амид вступал в каталитическую реакцию Соногаширы с терминальными алкинами, с последующей in situ циклизацией, что приводило к целевым пирролоаллоколхицинам с хорошими выходами. Установлено, что полученные соединения демонстрируют значительную антипролиферационную активность, при этом соединение 1ʹ-бромо-2ʹ,3ʹ,4ʹ-триметоксибензо[5ʹ,6ʹ:4,5]1H-(aR, 1S)1-ацетамидо-6, 7-дигидроциклогепта[3,4-f]1H-1-метил-2-гидроксиметилиндол обладает чрезвычайно высокой активностью в нано- и субнаномолярном диапазоне концентраций. 2. Разработан синтетический подход, позволяющий исходя из природного колхицина в 8–9 стадий получать фураноаллоколхициноиды, содержащие две реакционноспособные функциональные группы в бензильных или псевдобензильных положениях (карбонильная и гидроксильная или два гидроксильных фрагмента). Для этого природный колхицин был превращен в две стадии в йодоколхинол с суммарным выходом 88%. Фенольный гидроксил и амидный N-H фрагмент в этом производном был защищен метоксиметильной и Вос – группой соответственно. Полученное производное было подвергнуто деацетилированию в основной среде с последующим удалением защитных групп в кислотных условиях, что привело к деацетилйодоколхинолу с суммарным выходом 45%. Амин превращали в кетон с применением реакции трансаминирования с использованием реагента Рапопорта. Кетон вступал в каталитические реакции Соногаширы с терминальными алкинами с последующей in situ циклизацией, что позволило получить ряд фураноаллоколхицинов, карбонильная группа в которых подвергалась восстановлению с применением NaBH4, с образованием целевых продуктов. Установлено, что 1',2',3'-триметоксибензо[5',6':5,4]-1H-1-оксо-6,7-дигидроциклогепта[3,2-f]-2''-гидроксиметилбензофуран, 1',2',3'-триметоксибензо[5',6':5,4]-1H-1-оксо-6,7-дигидроциклогепта[3,2-f]-2''-ацетоксиметилбензофуран и 1',2',3'-триметоксибензо[5',6':5,4]-1H-1-гидрокси-6,7-гигидроциклогепта[3,2-f]-2''гидроксиметилбензофуран обладают высокой цитотоксичностью в наномолярных концентрациях по отношению к клеткам BxPC, PANC-1, Colo-357, MiaPaca-2, карциномы легких A549, мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, эндотелиальных клеточных линий EA.hy 926 и кератиноцитам. Эти факты свидетельствуют о важности наличия гидроксильной группы в псевдобензильном положении по отношению к бензофурановому циклу для противоопухолевой активности данного класса соединений. 3. С хорошими – высокими выходами синтезированы сульфиды колхициноидов по реакциям фураноаллоколхицинов, содержащих псевдобензильные гидроксилы с S-нуклеофилами - циклопентилмеркаптаном, защищенным тиогликолевой кислотой, и защищенным цистеином. Показано, что в отличие от исходных фураноаллоколхицинов, их сульфиды практически не обладают антипролиферационной активностью, что свидетельствует о том, что псевдобензильные гидроксилы в структуре гетероциклических аллоколхициноидов являются важными фармакофорными группами. 4. С целью изучения биораспределения фураноаллоколхициноидов в органах и клеточных органеллах нами синтезирован конъюгат фураноаллоколхицина с родамином В. Полученное соединение эффективно флуоресцирует в красной области спектра и является водорастворимым. 5. С целью улучшения биораспределения и снижения системной токсичности колхициноидов синтезирован конъюгат фураноаллоколхицина с нетоксичным, биосовместимым и биоразлагаемым природным полимером хитозаном с молекулярной массой ~40 kDa. Полученный конъюгат индуцирует in vitro ингибирование полимеризации тубулина, остановку клеточного цикла в G2/M фазе и ингибирует пролиферацию клеток в 2D и 3D культурах. Установлено, что конъюгат демонстрирует значительно более эффективное in vivo ингибирование роста опухоли по сравнению с «интактной» молекулой, предположительно, в результате лучшей аккумуляции в опухоли.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1. Синтезированы фуран-замещенные колхициноиды 1 и 2, содержащие две гидроксильные или карбонильную и гидроксильную группы в бензильных и псевдобензильных положениях, в качестве нового класса аналогов природного колхицина. Эти соединения получены в девять стадий исходя из коммерчески доступного колхицина. Полученные соединения демонстрируют цитотоксическую активность в наномолярном диапазоне концентраций по отношению к эпителиальным клеточным линиям. Низкопролиферирующие клетки, такие как эндотелиальные клетки EA.hy 926, а также мезенхимальные стволовые клетки демонстрируют более низкую чувствительность по отношению к указанным терапевтическим агентам. Аллоколхициноиды 1 и 2 эффективно подавляют клеточный цикл и индуцируют накопление клеток в G2/M фазе в 2D, и в 3D культурах, что является следствием их эффективного взаимодействия с тубулином (метафазный эффект). Кроме метафазного эффекта, колхицин, 1 и 2 индуцируют ряд интерфазных эффектов, таких как избыточная экспрессия тубулина, F-актина, гиперполяризация митохондриального и лизосомального мембранных потенциалов и повышенная гиперполяризация клеточной мембраны. 2. Исходя из природного колхицина в восемь и десять стадий синтезированы пирроло-аллоколхицины 3 и 4 в нерацемическом виде, обладающие высокой противоопухолевой активностью. Колхициноид 4 проявляет цитотоксическую активность в пикомолярном диапазоне концентраций, эффективно останавливает клеточный цикл в G2/M фазе, увеличивая тем самым число клеток подвергающихся апоптозу по сравнению с колхицином. При кратковременном инкубировании производного 4 показано, что цитотоксический эффект сильно зависит от времени инкубирования и типа клеток. Сделано предположение, что меньший цитотоксический эффект производного 4 по отношению к некоторым клеткам по сравнению с колхицином (например, по отношению к клеткам кишечника) является результатом его меньшей гастротоксичности, что, несомненно, увеличивает потенциал данного противоопухолевого агента. 3. Разработан эффективный шести-стадийный синтез пирролоаллоколхицинов исходя из коммерческого колхицина с применением реакции Фишера в качестве ключевого этапа для создание пиррольного фрагмента. На первой стадии происходит превращение природного (-)-(аR, 7S)-колхицина в аллоколхициновую кислоту, которая на следующей стадии подвергалась перегруппировке Курциуса с образованием соответствующего анилина. Последний по реакции Зандмеера был превращен в йодарен, который участвовал в каталитической реакции аминирования с NH2NHBoc в присутствии каталитической системы CuI/1,10-фенантролин/Cs2CO3 в ДМФ, приводя к региоизомерным аллоколхицин-замещенным гидразинам. Их реакции с алифатическими ациклическими и циклическими кетонами, а также с ароматическими кетонами в условиях реакции Фишера приводят к образованию региоизомерных пирроло-аллоколхицинов, которые могут быть легко разделены методами колоночной хроматографии на силикагеле. Некоторые из синтезированных молекул демонстрируют in vitro цитотоксическую активность в наномолярных концентрациях по отношению к клеткам MSC (стволовые клетки мезенхимы) и Colon-26 (карцинома кишечного эпителия). 4. Предложен эффективный полусинтетический подход к синтезу не рацемических фурано-аллоколхициноидов исходя из природного колхицина, используя в качестве ключевой стадии каталитический каскад реакций - кросс-сочетание Соногашира/5-endo-dig циклизация. Полученные соединения демонстрируют высокую цитотоксичность по отношению к клеткам T3M4, MiaPaCa-2, Colo-357 и PANC-1. Наличие в синтезированных молекулах двух функциональных групп с различной реакционной способностью (гидроксильная и амино-группы) позволит конъюгировать фурано-аллоколхицины с системами селективной доставки, что откроет новые возможности для их терапевтического использования. 5. В восемь стадий исходя из коммерческого колхицина и хитозана массой в 40 кДа был получен флуоресцентный конъюгат колхициноида с фураноаллоколхициноидом, содержащий модифицированную родаминовую флуоресцентную метку. Полученный конъюгат имеет низкую растворимость в воде при нейтральном и близком к нейтральному pH, что делает сложным его использование для изучения биораспределения по органам и тканям. 6. Исходя из колхицина в девять – десять стадий синтезированы фурано-аллоколхициноиды, содержащие олефиновые фрагменты в положение «7» цикла В. В качестве ключевого интермедиата в синтезе целевых продуктов выступал кетон, получаемый из колхицина в семь стадий. Карбонильная группа в этом соединении трансформировалась в олефиновые фрагменты с применением реакций Виттига или Ненайденко-Шастина, приводя к алкенсодержащим колхицинам. Их последующая каталитическая каскадная циклизация с пропаргиловым спиртом приводила к целевым алкенсодержащим фурано-аллоколхицинам. Антипролиферационная активность полученных соединений находится на стадии проведения исследований. 7. По результатам работы опубликованы на этапе 2017 г три статьи в рейтинговых международных журналах, получен патент: a) Iu. A. Gracheva, E.V. Svirshchevskyaya, E.A. Zaburdaeva, A.Yu. Fedorov. Synthesis of byfunctional furano-allocolchicines. Synthesis 2017, 4335-4340 (IF 2.62). b) E. S. Shchegravina, A. A. Maleev, S. K. Ignatov, Iu. A. Gracheva, A. Stein, H.-G. Schmalz, A. E. Gavryushin, A. A. Zubareva, E. V. Svirshchevskaya, A. Yu. Fedorov. Synthesis and biological evaluation of novel non-racemic indole-containing allocolchicinoids. Eur. J. Med. Chem., 2017. 141, 51-60 (IF 4.519). c) Iu. A. Gracheva, Iu. V. Voitovich, V. I. Faerman, N. S. Sitnikov, E. V. Myrsikova, H.-G. Schmalz, E. V. Svirshchevskaya, A. Yu. Fedorov. Synthesis and cytostatic properties of polyfunctionalized furanoallocolchicinoids, Eur. J. Med. Chem. 2017, 126, 432−443 (IF 4.519). d) патент: Е.С. Щегравина, А.Ю. Федоров, Е.В. Свирщевская, Производное 1'-бромо-2',3',4'-триметоксибензо[5',6':4,5]-(aR, 1S)-1-ацетамидо-6,7-дигидроциклогепта-[3,4-f]-1Н-индола и его применение RU 2630303 C1; Опубликовано: 08.09.2017 Бюл. № 25. 8. В СМИ в 2017 году было опубликовано несколько материалов, посвящённых данному проекту РНФ: http://vestinn.ru/news/society/79607/ http://vestinn.ru/news/society/73975/?sphrase_id=2546487 https://opennov.ru/news/38093-nizhegorodskie-uchenye-razrabatyvayut-lekarstvo-ot-raka-i-fibroza-pecheni http://www.unn.ru/site/about/news/nizhegorodskie-uchenye-razrabatyvayut-lekarstvo-ot-raka-i-fibroza-pecheni

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. С применением последовательностей из 5-9 стадий, исходя из природного колхицина в не рацемическом виде получены новые бифункциональные аллоколхициноиды: гидроксиаллоколхициновая кислота 3б, аминоаллоколхициновая кислота 4г, а также фураноаллоколхициноиды 8 и 9б, содержащие в своем составе две гидроксильные и гидроксильную и аминогруппы. Установлено, что диол 8 проявляет цитотоксическую активность в низких наномолярных концентрациях по отношению к клеткам PANC-1, HaCaT и HEK293. При этом наблюдалось снижение активности бифункциональных аллоколхициноидов с «шагом» в порядок в ряду нейтральные > положительно заряженные (амины) > биполярные ионы (аминокислоты) > отрицательно заряженные (кислоты) производные. Сделано предположение, что производные со свободными группами, протонированными / депротонированными в физиологических условиях, теряют активность из-за эффекта заряда, поскольку все клетки ограничивают заряженные молекулы конкретными органеллами, такими как лизосомы, эндосомы, аппарат Гольджи (заряжены положительно) и митохондрии (заряжены отрицательно). Методами конфокальной микроскопии и проточной цитометрии установлено, что эффекты заряженных препаратов менее скоординированы по сравнению с нейтральными, что выражается в перелокализации тубулина к мембранам клеток, накоплении препаратов в аппарате Гольджи, сохранении функционирующих эндосом и митохондрий, накоплении в лизосомах. Падение активности отрицательно заряженных производных на три порядка по сравнению с нейтральными препаратами можно также объяснить их «отталкиванием» от отрицательного заряженного белка тубулина и задержке производных в цитоплазме. 2. Разработан удобный метод синтеза гидрофураноаллоколхицинов 12, содержащих экзо-кратную связь в гидрофурановом фрагменте исходя из колхицина в 4 стадии с применение каталитической реакции Хека в качестве ключевого этапа. Показано, что дигидрофуран 12а проявляет цитотоксическую активность по отношению к клеткам PANC-1, HeLa, HEK-293, Colo-357 и Colon-26 в низких нано- и субнаномолярных концентрациях. 3. Нами была сделана попытка разработать метод синтеза имидазолоаллоколхицинов 16 исходя их йодоанилина 15, полученного нами на предыдущих стадиях выполнения проекта по реакциям с амидинами и замещенными бензальдегидами. Получены соответствующие алкил- и арилзамещенные аллоколхицинимидазолы с невысокими выходами. 4. Нами сделано предположение, что коньюгаты колхициноидов с производными цетиризина будут обладать повышенной противовоспалительной активностью, так как данные препараты действуют на очаг воспаления посредством разных механизмов и их объединение позволит наблюдать синергический эффект. В связи с этим нами были синтезированы коньюгаты аллоколхицина и аналога цетиризина 18a, b, в 10 стадий с суммарными выходами 15% и 12% соответственно. В настоящее время проводится исследование противовоспалительной и антиаллергенной активности синтезированных конъюгатов. 5. Исследована цитотоксическая активность соединений 28-30, полученных на этапе 2 (2017 г) выполнения проекта РНФ (Рис. 8). Установлено, что колхициноид 30, содержащий два атома хлора при кратной связи в положении С-7 аллоколхицинового скелета, проявляет антипролиферативную активность в низких наномолярных концентрациях по отношению к клеткам HaCaT, COLO-357, PANC-1 и BxPC-3. 6. По результатом работы опубликованы 3 статьи в журналах, индексируемых в WoS (план – 3 статьи в WoS) и отправлена заявка на Российский патент (заявка зарегистрирована в Роспатенте): а) I. A. Gracheva, E. V. Svirshchevskaya, V. I. Faerman, I. P. Beletskaya, A. Yu. Fedorov. Synthesis and antiproliferative properties of bifunctional allocolchicine derivatives. Synthesis, 2018, 50 (14), 2753–2760. (Q1) б) E. S. Schegravina, E. V. Svirshchevskaya, H.-G. Schmalz, A. Yu. Fedorov. A Facile Synthetic Approach to the Nonracemic Substituted Pyrrolo-allocolchicinoids Starting from Natural Colchicine. Synthesis 2018, ID SS-2018-04-0283-OP.R3 (accepted 05-Nov-2018). DOI: 10.1055/s-0037-1610673 (Q1). в) А.С. Зотов, Е.С. Щегравина, А.Ю. Федоров, Синтез конъюгатов аллоколхицина с аналогом цетиризина, Журн. Орг. Хим., 2018, 54(10), 1486-1492. г) заявка на патент: Е.С.Щегравина, Ю.А.Грачёва, Е.В. Свирщевская, А.Ю. Федоров. Производное 1",2",3"-триметоксибензо[5",6":5',4']1H-(aR, 1S)-1-ацетамидо-6',7'-дигидроциклогепта[2',3'-f]-2,3-дигидрофурана и его применение, Дата поступления в ФИПС 23.07.2018; Входящий номер 043252, Регистрационный номер 2018127160.