Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Начала теории диффузионного экстрагирования пористых тел были разработаны к середине 70-х годов XX века. Ее суть заключается в том, что массоперенос целевых компонентов в пористых частицах осуществляется исключительно в результате молекулярной диффузии. Эта теория определила направление традиционных способов интенсификации процесса экстрагирования: 1. рациональный подбор растворителей; 2. оптимизация температурных параметров; 3. ускорение пропитки сырья экстрагентом; 4. оптимальное измельчение сырья и преобразование его пористой структуры. Если по первым трем пунктам в настоящее время существую достаточно серьезные как экспериментальные, так и обобщающие работы, то работ по исследованию оптимального измельчения сырья и преобразованию его пористой структуры очень мало. Известны отдельные сообщения по оптимизации размера частиц конкретного сырья при экстракции конкретным растворителем. При этом обобщающей теории не существует. Проведенные работы были направлены на то, чтобы закрыть данный пробел и углубить понимание процессов экстракции из пористых тел и растительного сырья в частности. Исследование проводилось на модельных системах лигноцеллюлозных матриц и целевых веществах, способных вступать в два типа реакций – гликозилирование и нейтрализации. Исходя из имеющихся моделей определен ряд параметров, затрудняющих исследование кинетики экстракции. На основе перечисленных параметров разработаны критерии и проведен отбор модельного сырья. На первой стадии отбор проводился на основе результатов анализа химического состава лигноцеллюлозных матриц. В сырье с удовлетворительным химическим составом изучалось внутреннее строение (морфология). Для этого проводились исследования методами оптической, электронной просвечивающей и сканирующей микроскопии. На основе проведенных исследований выбраны кандидаты для создания модельных матриц – солома пшеницы и тростник. Для получения матриц с желаемой внутренней структурой и одинаковой формой частиц проведены исследования по термомеханической обработке растительного сырья. В настоящее время данные по разупорядочению клеточной стенки на макроуровне основываются на субъективном визуальном анализе просвечивающих микрофотографий. Методов численного анализа упорядочения клеточной стенки на макроуровне (единицы мкм) не существует. С целью создания нового, не имеющего аналогов в мире, инструментария для обработки результатов электронной микроскопии и получения количественных данных о степени разупорядочения клеточной стенки совместно с Институтом систем информатики СО РАН проведены работы по анализу текстурных признаков изображений на основании развиваемых в информатике методов компьютерного анализа изображений. Исследовался вопрос о применимости существующих к настоящему времени наборов текстурных признаков для рассмотрения экспериментальных микрофотографий с целью выявить на изображениях характерные участки, которые в будущем можно будет связать с пористостью, реакционной способностью, проницаемостью и т.д. Предложены алгоритмы и разработан исходный код, который в будущем послужит для создания новых программных средств: 1. программы для вычисления текстурных признаков; 2. программа для спектральных преобразований микрофотографий, позволяющая проводить преобразования шести основных используемых в смежных областях подходов: косинусный, Адамара порядка 2^n, Адамара на основе символа Лежандра, Хаара, наклонный, Добеши-4. 3. прототипы программ, реализующие R/S-анализ и фрактальный анализ. Проведены первичные эксперименты, показавшие применимость методов R/S- анализа и фрактального анализа для обработки микрофотографий растительного сырья. Отбор модельного флавоноида проводился на основании его устойчивости к механическому воздействию, сродству к лигноцеллюлозной матрице и возможности проведения твердофазной реакции гликозилирования. На первой стадии вещества подвергали механической обработке в чистом виде и нанесенные различными методами на матрицы. Кверцетин был отобран как наиболее перспективное соединение для более глубокого исследования. 1. при механической обработке кверцетина без матриц происходит разложение вещества и уменьшение его содержания в образце. В случае механической смеси с соломой пшеницы устойчивость кверцетина при механической обработке дополнительно понижается, но в случае, когда кверцетин сорбирован на матрице, стабильность увеличивается; 2. по-видимому, в матрице растительного кверцетин-содержащего сырья кверцетин находится в сорбированном состоянии; 3. компоненты лигноцеллюлозной матрицы соломы (целлюлоза кристаллическая аморфная, лигнин) по отдельности снижают устойчивость кверцетина при механическом воздействии; 4. матрицы, полученные из соломы удалением гемицеллюлозы и лигнина с сохранением исходной структуры, увеличивают устойчивость кверцетина; 5. на устойчивость кверцетина влияет тип взаимодействия кверцетина с матрицей. Кверцетин, сорбированный на матрице, более устойчив, чем в механической смеси с матрицей; 6. устойчивость кверцетина в матрице определяется степенью аморфизации целлюлозы. Методом компьютерного моделирования рассмотрены структуры гликозидов, образующихся при взаимодействии кверцетина в качестве модельного агликона с аномерами углевода на примере D-глюкопиранозы. Для проведения кинетических исследований был отобран ресвератрол. Проведен расчет кинетических параметров в соответствии с развиваемой теорией при условии наличия стационарного режима экстракции. При перерасчете кинетических данных в спрямляющих координатах возможно вычислить как форм-факторные, так и диффузионные характеристики частиц. Определены параметры перемешивания, после которых скорость перемешивания перестает влиять на кинетические параметры экстракции.Таким образом, отработана методика нанесения и экстракции модельных веществ, расчета кинетических параметров процесса экстракции. В настоящее время идет расчет кинетических данных для растительного сырья с различной упорядоченностью структуры. Изучена зависимость динамики экстракции ресвератрола от размера частиц. Для частиц большого размера лимитирующей стадией процесса является диффузия во внутрипоровой жидкости. Для частиц малого размера лимитирующей стадией является диффузия через клеточную стенку. Для частиц среднего размера обе стадии процесса – диффузия через клеточную стенку и диффузия в поре вносят значительный вклад. Построена модель частицы, в которой вещество диффундирует последовательно в порах и стенках в приближении равномерного градиента концентрация внутри частиц. Рассчитанная величина константы эффективной диффузии совпадает с экспериментально полученным значением. Показано, что предложенная модель диффузии в растительном сырье хорошо описывает экспериментальные результаты. В настоящее время ведутся работы по учету длинных пор (клеток проводящих тканей) в модели диффузии. На основе литературных и экспериментальных данных по изменению спектра люминесценции при протекании реакции нейтрализации проведен отбор модельных биологически активных антрацен-производных. Исследование спектров люминесценции проводилось на микроскопе – спектрофотометре МСФУ-6 ЛОМО. Из исследованных веществ были отобраны два соединения, у которых изменение спектра наиболее ярко – эмодин и гиперицин. Для гиперицина, спектры которого были исследованы ранее, только на образцах микрокристаллической целлюлозы, изучено влияние степени нейтрализации на спектры люминесценции гиперицина на различных лигноцеллюлозных матрицах. Показано, что контроль соотношения полос интенсивности при 600 и 680 нм позволяет судить о степени нейтрализации гиперицина. Для двух выбранных антрацен-производных поставлена методика контроля протекания реакции нейтрализации в твердой фазе люминесцентным методом. Результаты представлены в 6 статьях отправленных в редакции журналов, входящих в список WoS и Scopus. На втором году проекта будут проведены следующие работы: 1. изучение условий протекания твердофазных реакций нейтрализации и гликозилирования целевых веществ, помещенных в матрицу, в зависимости от условий механического нагружения и физической свойств матрицы; 2. уточнение модели экстракции на основе данных по разупорядочению клеточной стенки и протекания реакций во время механохимической обработки.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проведены исследования зависимости диффузионных характеристик от степени разупорядочения растительного сырья. Построена модель частицы, в которой компакт из клеток пронизан сквозной порой. Для частиц большого размера лимитирующей стадией процесса является диффузия во внутрипоровой жидкости. Для частиц малого размера, лимитирующей стадией является диффузия через клеточную стенку. Для частиц размером около 140 мкм обе стадии процесса – диффузия через клеточную стенку и диффузия в поре – вносят равноценный вклад. Вещество диффундирует последовательно в порах и стенках в приближении равномерного градиента концентрации внутри частиц. Рассчитанная константа эффективной диффузии совпадает с экспериментально полученными данными. При механической активации альфа-целлюлозы в активаторе с ударно-сдвиговым типом воздействия происходит измельчение и аморфизация целлюлозы, степень которой растет пропорционально продолжительности обработки. В активаторе со сдвиговым типом воздействия наблюдается агломерация частиц. В случае целлюлозы, входящей в состав соломы пшеницы, значительная аморфизация происходит лишь при высокоэнергетичных режимах, агломерация частиц не наблюдается. Методом молекулярной механики проведены модельные исследования изменения потенциальной энергии системы, состоящей из кверцетина и аномеров D-глюкопиранозы и L-рамнопиранозы, определены предпочтительно образующиеся структуры. Методами термогравиметрии и дифференциальной сканирующей калориметрии впервые показана возможность твердофазного механохимического гликозилирования кверцетина глюкозой. Реакция происходит при механической обработке смеси в присутствии катализатора и последующем нагревании. Образование растворимых в воде гликозидов с различающейся степенью гликозилирования наблюдается при использовании в качестве катализатора сильных оснований. При помощи просвечивающей электронной микроскопии сырья, подвергнутого термомеханической обработке, показаны изменения ультраструктуры, связанные с разложением и выделением лигнина. Высказано предположение, что в результате воздействия повышенной температуры лигнин клеточной стенки плавится и образует скопления в клеточных стенках. Механическое воздействие, прикладываемое к материалу, выдавливает лигнин из клеточных стенок с нарушенной структурой. В клеточных стенках наблюдаются поры диаметром 10-20 нм, а лигнин локализуется на поверхности частиц в образованиях размером около 200 нм. Данные легли в основу предложенного механизма термомеханических процессов, используемых в химии получения целлюлозы. Модельные вещества, в частности, кверцетин и эмодин, наносились на компоненты лигноцеллюлозных матриц различного состава и ультраструктуры. Показано, что кверцетин на различных матрицах и в различных условиях разрушения разлагается при механической обработке с различными скоростями. Планируется исследовать реакцию гликозилирования и роль щелочных катализаторов реакций и образования солевых форм реагентов в гликозилировании в зависимости от типа разрушения матрицы. Нейтрализация эмодина, адсорбированного на целлюлозу, протекает в условиях значительного снижения индекса кристалличности. Проведено математическое моделирование диэлектрической проницаемости матриц, состоящих из органического вещества и воды, в которых блоки органического вещества разделены прослойками воздуха, замещаемого водой с ростом влажности системы. Диэлектрическая проницаемость системы ожидаемо возрастает по мере поглощения воды и заполнения пустых (воздух) прослоек. Определенное ранее экспериментально равновесное значение предельной влажности, примерно равное 20 %, отвечает ячейкам с размером 12-14 мкм при единичной относительной толщине прослойки. Рассчитанная эпсилон для этого случая – порядка 20. Это означает, что пористая структура описывается соотношением «размер зерна – толщина прослойки» как 12-14 к 1. Экспериментально исследована ёмкость конденсатора, заполненного исследуемым веществом, в зависимости от влажности образца в различных диапазонах частот. В районе 13 % масс. происходит ускорение роста диэлектрической проницаемости, отражающее как изменение подвижности диполей воды в образце, так и образование агломератов молекул воды. Показана возможность использования эмодина как модельного вещества при люминесцентно-спектроскопическом исследовании реакции нейтрализации в системе «целлюлозная матрица – эмодин – щелочь». Проведены эксперименты, в которых эмодин наносился на целлюлозу, предварительно обработанную веществами, имеющими различные кислотно-основные свойства. Спектр люминесценции эмодина изменяется в зависимости от щелочности подложки. Изучено влияние воды, адсорбированной в целлюлозной матрице, на люминесцентные спектры исследуемых образцов. Анализ спектров свидетельствует о наличии двух центров депротонирования эмодина, что подтверждается литературными данными по исследованию кислотно-основных свойств эмодина в растворах. Первая стадия депротонрования наступает при влажности сырья боле 5,5 %, а полное протекание реакции происходит при влажности более 13%. Протекание реакции при фиксированном диэлектрическом потенциале среды только до первой стадии свидетельствует о том, твердофазная реакция нейтрализации имеет активационную природу. При росте влажности за счет повышения диэлектрической проницаемости образца активационный барьер переноса протона понижается, что и приводит к полному протеканию реакции. Доказано, что диэлектрическая проницаемость среды является ключевым фактором успешности протекания твердофазной реакции нейтрализации и образования щелочных форм эмодина. При помощи механической активации в отличающихся условиях получены образцы, состоящие из матрицы растительного сырья (соломы пшеницы) различной разупорядоченности с нанесёнными на них целевыми веществами. Электронно-микроскопические исследования аморфизованных образцов показали глубокие изменения структуры клеток и клеточных стенок независимо от размера и формы. Клетки теряют сферическую форму, деформируются и выглядят сплюснутыми. Очевидно, что в процессе аморфизации происходит снижение жесткости клеточных стенок. Особенностью препаратов является формирование агрегатов обломков клеточных стенок, которые плотно прилегают друг к другу. По-видимому, процедура аморфизации нарушает структуру поверхностных слоев частиц, которые при контакте формируют вытянутые образования или комки, в зависимости от размера обломков. Осуществлен компьютерный анализ изображений механически обработанного растительного сырья, полученных просвечивающей электронной микроскопией. Усовершенствована созданная в 2016 году программа для вычисления различных текстурных признаков. В рамках поиска оптимального алгоритма выделения участков с различной текстурой реализована новая программа R/S-анализа изображений. Показано, что упорядоченные и разупорядоченные клеточные стенки не значительно отличаются по показателю Хёрста, но имеют различное распределение данных в диаграмме. Для калибровки программ по определению степени разупорядочения текстур требуется проведение машинного обучения. Эксперименты с использованием нейронных алгоритмов (нейросетей) – показали перспективность данного направления.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе выполнения работ по Проекту в 2018 году был осуществлен подбор реального растительного сырья, содержащего биологически активные вещества, химическая структура которых наиболее близка к изученным ранее модельным веществам. В качестве основного исследуемого вещества использовался эмодин (1,3,8-тригидрокси-6-метилантрацен-9,10-дион), содержащийся в листьях Алоэ настоящего (лат. Aloe vera). Выбор объяснялся возможностью использования люминесцентного метода для определения концентрации продукта реакции нейтрализации. Вторым отобранным веществом являлся куркумин (1,7-бис(4-гидрокси-3-метоксифенил)-1,6-гептадиен-3,5-дион), содержащийся в корне Куркумы (лат. Curcuma longa). При взаимодействии со щелочью происходит образование енолят-аниона куркумина, что приводит к сильному батохромному сдвигу в спектрах поглощения и смене окраски с желтой на красно-оранжевую, что также позволяло контролировать протекание реакции нейтрализации. Третьим отобранным веществом был кверцетин (3,3',4',5,7-пентагидроксифлавон), содержащийся в корнях Софоры японской (лат. Styphnolóbium japónicum). Для кверцетина, выделенного в чистом виде в течение предыдущих двух лет выполнения Проекта, были проведены масштабные физико-химические исследования, включающие изучение и компьютерное моделирование ИК-спектров. На выбранном реальном растительном сырье проведена проверка закономерностей, выявленных ранее на модельных системах. Морфология отобранного растительного сырья сравнивалась с морфологией модельных образцов (соломина злаков – регулярная, упорядоченная пористая структура; жмых винограда – нарушенная пористая структура). Строение листа Алое настоящего отражало накопление воды и биологически активных веществ в его толще. Крупные клетки водоносного слоя имели неправильную форму, размеры 200-350 мкм, электронно-прозрачную цитоплазму, клеточные стенки толщиной 0,2-2 мкм. Клетки палисадного слоя (диаметр 45-70 мкм), лежащие под эпидермой, также имели электронно-прозрачную цитоплазму, содержали хлоропласты, придающие зеленый цвет листу, зерна крахмала и не известные в литературе листовидные скопления тонко-гранулярного вещества размером 0,5-1,2 мкм, возможно, отражающие накопление биологически активных соединений. Предварительно измельченное корневище куркумы состояло из двух типов частиц: округлых крупных, в структуре которых просматриваются неоднородности, и мелких палочковидных. Размеры крупных частиц находятся в диапазоне 30х100 мкм. Размеры палочковидных частиц варьируют: 1–3 мкм в толщину и 2-10 мкм в длину. Электронно-микроскопическое исследование порошка куркумы показало, что крупные частицы идентифицируются как остатки цитоплазмы клеток, содержащие фрагменты разной электронной плотности. Палочковидные частицы представляют собой обломки клеточных стенок разной величины, с которыми могут быть механически ассоциированы различные клеточные структуры. Корень Софоры японской имеет структуру, значительно отличающуюся от ранее описанных объектов. Важным отличием является то, что по мере удаления от кончика корня в тканях наблюдаются участки плотного бесклеточного вещества, в котором просматриваются разнонаправленные неупорядоченные тяжи диаметром 12-14 нм. На ультраструктурном уровне бесклеточное вещество представлено материалом разной электронной плотности, отдельные участки выглядят как закрученные и деформированные клеточные стенки, но есть гомогенные участки одинаковой электронной плотности. Можно предположить, что бесклеточное вещество образовано разросшимися клеточными стенками, вытеснившими содержимое клеток. Клеточное же строение участков корня было более равномерным. Основную долю «клеточных» участков образовывали клетки, стенки которых имели примерно одинаковую толщину (около 1,5 мкм). При этом на периферии располагались округлые клетки с диаметром 48,4-61,5 мкм, а в центральной зоне – клетки неправильной формы со средним размером 13х21 мкм. Проведено исследование влияния неоднородности клеточной структуры и химического состава реального растительного сырья на процессы экстракции. В разработанную ранее модель экстракции внесены поправки, учитывающие распределение частиц по размерам и разупорядочение клеточной стенки. Показано, что при всех исследованных размерах частиц от 25 до 250 мкм и значениях индекса кристалличности от 27 до 65 %, с учетом введенных поправок, оба фактора – размер и степень кристалличности – значительно влияют на процесс массопереноса в частице при экстракции. Максимальное значение массопереноса следует ожидать при индексе кристалличности целлюлозы (по Сегалу) 39-42 %. Обсуждаемый эффект, по-видимому, объясняется наложением двух противоположно направленных процессов. При механической обработке и разупорядочении частиц происходит облегчение процесса диффузии веществ через клеточную стенку, что ускоряет массоперенос. При высоких степенях разупорядочения вместе с разупорядочением клеточных стенок происходит разрушение проводящих каналов (пор), что приводит к падению потоков вещества и снижению эффективности диффузии. Масштаб эффекта является существенным. В условиях оптимального баланса размера частиц и степени кристалличности происходит 5-7-кратное увеличение потока вещества по сравнению с частицами сырья. Обнаруженный эффект может использоваться в технологии экстракции растительных веществ для повышения скорости экстракции и выходов экстрагируемых веществ. Изучена диэлектрическая проницаемость и проводимость растительного сырья в зависимости от влажности. Показано, что диэлектрическая проницаемость растительного сырья не имеет перегибов. Перегиб на кривой «влажность – диэлектрическая проницаемость» при 13 % влажности обычно связывают с достижением в пленке из молекул воды на поверхности частиц образца перколяционного предела, после которого перенос протонов может осуществляться через непрерывные цепи молекул воды. В нашем случае данные свидетельствуют об отсутствии перколяционного эффекта в исследованном интервале влажности. Математическое моделирование диэлектрической проницаемости системы предсказывает монотонный рост диэлектрической проницаемости композита, но сопоставление теоретической величины эффекта с данными эксперимента указывает на то, что молекулы воды в системе находятся в подвижном состоянии и накапливаются упорядоченным образом. По-видимому, в твердофазной нейтрализации первичным актом является отрыв протона от молекулы фенола с последующим его переносом на щелочь. В случае эмодина, имеющего два различающихся типа фенольных групп, более кислые группы в вершинах колец должны нейтрализоваться в первую очередь, а боковая фенольная группа нейтрализуется во вторую очередь. Таким образом, процесс нейтрализации эмодина с переносом протона по матрице имеет активационные затруднения, которые снимаются при повышении диэлектрической проницаемости среды. Исследовано влияние диоксида кремния, содержащегося в реальном растительном сырье – шелухе риса, на протекание механохимических процессов. Показано, что на измельчение рисовой шелухи необходимо затратить меньшее количество энергии (доза энергии – 327 Дж/г) при большем давлении мелющих тел (529 Па), чем для объекта сравнения – соломы пшеницы – из-за наличия мембраны диоксида кремния на поверхности частиц. Сопоставимые значения размеров частиц для шелухи риса и соломы пшеницы достигаются только при дозе энергии 436 Дж/г и давлении мелющих тел – 338 Па. В ходе работ по масштабированию найдены оптимальные условия для получения опытной партии экстрактов из растительного сырья. На полупромышленном оборудовании наработаны и протестированы на лабораторных животных опытные партии биологически активных продуктов, содержащих кверцетин и гликозид кверцетина, впервые полученный механохимической реакцией нами в ходе выполнения Проекта в 2017 году. Для испытания гипергликемического действия была наработана партия препарата из корневищ куркумы. Биологические исследования на модельных микроорганизмах – парамециях – показали, что, с точки зрения теста на острую токсичность по ГОСТ 31674-2012, все представленные препараты обладают токсичностью. В водном и водно-ацетоновых растворах при стандартном разведении микроорганизмы Parametium сaudatum погибали с разрывом мембраны в течении одной минуты. Однократное пероральное введение исследуемых препаратов в максимально допустимой дозе не оказывает деструктивного действия на внутренние органы и организм в целом и не оказывает угнетающего действия на кроветворную функцию и обменные процессы в организме лабораторных животных. Токсичность данных препаратов может быть классифицирована как невыраженная. Таким образом, согласно ГОСТ 12.1.007-76, по степени токсичности исследуемые препараты относятся к IV классу опасности – вещества малоопасные. Исследуемые препараты, содержащие в своем составе вещества, с точки зрения инструментальных методов анализа проявляющие антиоксидантные свойства, не оказывали выраженного защитного действия на организм животных при моделировании оксидантного стресса. Применение исследуемых препаратов с профилактической целью при моделировании оксидантного стресса у животных в ряде случаев оказывает негативное действие на осмотическую стойкость эритроцитов. Базируясь на результатах биологических испытаний, сформулирована гипотеза о том, что кверцетин в форме гликозида обладает менее агрессивным действием, чем исходный кверцетин. С учетом того, что кверцетин и углеводы повсеместно находятся в растительном сырье «рядом друг с другом», получение таких гликозидов может быть вызвано не только целенаправленной механохимической обработкой, но и более рутинными операциями, например измельчением и прессованием. В настоящее время считается, что такие подготовительные операции не изменяют состав растительного сырья, не модифицируют профиль его биологической активности. Приведенные результаты делают перспективными более глубокие исследования реакций между компонентами растительного сырья. Исследования гипергликемических свойств препарата из корневищ куркумы, проведенные на самцах крыс с модельным аллоксан-индуцированным сахарным диабетом, показали, что при приеме продукта механохимической переработки куркумы у крыс с сахарным диабетом, по сравнению с аналогичными животными, потреблявшими как стандартный корм без добавок, так и корм с добавкой куркумы без механохимической переработки, наблюдались менее выраженное повышение концентрации глюкозы в крови, более высокая концентрация инсулина и низкая - кортикостерона, а также достоверное увеличение уровня гликогена в печени. Полученные данные позволяют рекомендовать препарат механохимической переработки куркумы для профилактики и коррекции гипергликемии при сахарном диабете. Проведенные исследования влияния препарата на функции почек показали, что получаемые препараты в значительной степени не влияют на функции почек и могут применяться при острой почечной недостаточности. В ходе выполнения работы были опубликованы статьи в рецензируемых журналах, входящих в базы данных Web of Science и Scopus. В частности, в Journal of Theoretical and Applied Information Technology были опубликованы прорывные результаты по математическому распознаванию текстур и ультраструктур, представленных на микрофотографиях срезов растительного сырья. В ведущем журнале Cellulose (Q1, IF 3.809) вышла статья, касающаяся роли механического воздействия в термомеханическом удалении лигнина. Долгое время механизм данного процесса, используемого в целлюлозно-бумажной промышленности и в зарубежных технологиях получения биоэтанола из растительного сырья, был не изучен. Готовятся к печати дополнительные статьи, посвященные моделированию экстракционных процессов из растительного сырья, где структура сырья представлена как система замкнутых и открытых пор, а также публикации по результатам других разделов проекта.