Аннотация результатов, полученных в 2016 году
С помощью методов оптической микролитографии получены магнитные наноструктуры с высокой намагниченностью насыщения и минимальной остаточной намагниченностью. Установлены магнитные и физико-химические свойства магнитных наноматериалов (МНМ), найдены оптимальные технологические процессы их получения для целей проекта. Разработана теоретическая модель для выбора оптимальных режимов наиболее чувствительной детекции таких наноматериалов. Разработаны экспериментальные образцы детекторов МНМ нового поколения, основанные на двухчастотном возбуждении и регистрации отклика на комбинаторных частотах. Для удобства исследований и расширения области применения подобных устройств был разработан новый алгоритм обработки сигналов одновременно с трех измерительных катушек индуктивности, которые опрашивались единым процессорным блоком. Разработанные новые математические алгоритмы обработки сигналов и их реализация с применением передовых электронных компонентов позволили создать экспериментальные образцы детекторов с рекордным порогом чувствительности - 0,4 нг магнитных наночастиц, а также рекордно широким линейным динамическим диапазоном – 7 порядков для каждого из каналов объемом 0,2 мл. Отметим, что на данный момент устройства с такими параметрами не имеют мировых аналогов. Разработанные регистраторы использованы для биофизических исследований эволюции магнитных наноматериалов, введенных в кровоток лабораторных животных. Начаты исследования динамики магнитных объектов в организме лабораторных животных и токсикологические исследования МНМ in vivo. Методами коллоидной химии был проведен синтез ферромагнитных материалов с высокой намагниченностью насыщения за счет добавления элементов из группы лантаноидов и ряда переходных металлов. Кроме того, магнитные наночастицы были получены с помощью лазерной абляции твердых мишеней. Взаимодействие биофункционализованных магнитных и золотых наночастиц в растворах впервые контролировалось по смещению спектров локализованного поверхностного плазмонного резонанса золотых частиц. Показана высокая эффективность впервые предложенного метода для мониторинга динамики образования комплексов указанных наночастиц и их управляемой дезинтеграции. Получены фунционализированные магнитные структуры за счет конъюгации МНМ с рецепторными молекулами, в частности антителами и стрептавидином, которые способны биоспецифично распознавать и связываться с комплементарными молекулами и соединениями. Разработаны принципиально новые биофизические подходы к многопараметрическому биохимическому определению биологически активных агентов в средах сложного состава. На основе применения МНМ в качестве меток иммунохимических реакций была разработана новая аналитическая система с применением «сухих реагентов» для быстрого (менее 30 мин) количественного измерения концентрации одновременно нескольких агентов в широком динамическом диапазоне (более 3 порядков). Разработаны иммунохроматографические тест-полоски с магнитными наномаркерами для измерения концентрации серотипов А, B и Е ботулинических нейротоксинов (BoNT), представляющих опасность для человека. Достигнутые концентрационные пороги детекции составляют 0.22, 0.11 и 0,32 нг/мл для BoNT-A, -B и -E, соответственно. Разработанный метод анализа обладает простотой, возможностью проведения в полевых условиях, не требует высокой квалификации персонала, а также имеет долговременную сохранность тест-полосок за счет сухих реагентов. В то же время, по совокупности достигнутых характеристик разработанный метод превосходит параметры традиционных трудоемких количественных анализов, имеющих такую же продолжительность, но выполняемых только в лабораторных условиях квалифицированным персоналом. Развит подход к мультиплексированию анализов, использующий оригинальный трехканальный регистратор МНМ. Разработан алгоритм несложного и быстрого мультиплексирования иммунохимического анализа путем объединения однопараметрических тест-полосок, используемых в качестве модулей. Разработанный мультиплексный анализ продемонстрировал пороги детекции 0.20, 0.12, 0,35 нг/мл для BoNT-A, -B и -E, соответственно, что практически совпадает со значениями, достигнутыми в однопараметрических анализах. Эффективность магнитного мультиплексного анализа в сложных средах была подтверждена путем детектирования нейротоксинов в молоке, а также в яблочном и апельсиновом соках. Подчеркнём, что за счет применения высокочувствительного регистратора МНМ достигаются высокие характеристики мультиплексного анализа, по совокупности параметров превосходящие параметры существующих лабораторных методов, требующих высокой специализированной квалификации персонала. Разработанные прототипы многоканальных магнитных биосенсоров могут использоваться для быстрых и высокочувствительных количественных измерений концентрации иных биологически активных вещества для in vitro диагностики заболеваний как в лабораторных условиях, так и в непосредственной близости от пациента, а также для ветеринарии, сельского хозяйства, анализа продуктов питания, мониторинга окружающей среды, биобезопасности и т.д. Результаты разработки и тестирования магнитных биосенсоров опубликованы в авторитетном профильном журнале: A.V. Orlov, S.L Znoyko, V.R Cherkasov, M.P. Nikitin, P.I. Nikitin. Multiplex biosensing based on highly sensitive magnetic nanolabel quantification: rapid detection of botulinum neurotoxins A, B and E in liquids. Analytical Chemistry. 2016, 88, 10419−10426. http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.6b02066

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В соответствии с планом в течение второго года выполнения проекта проведена оптимизация сверхчувствительных методов регистрации магнитных наноматериалов (МНМ), а также существенно расширена сфера научных исследований с применением методов детекции, разработанных в первый год проекта, а также новых перспективных МНМ для решения актуальных аналитических и биомедицинских задач: 1. Разработаны новые способы многоканального считывания результатов для in vitro диагностики с применением МНМ в качестве нанометок реакций как развитие оригинального метода сверхчувствительной регистрации МНМ по нелинейному перемагничиванию и регистрации отклика на комбинаторных частотах. Характерные пределы детекции составляют доли нанограмма магнетита в объеме 0,2 мл, а линейный динамический диапазон - 7 порядков величины. Разработаны четыре типа экспериментальных устройств, протестированных для быстрых измерений концентраций одновременно нескольких белковых маркеров социально-значимых заболеваний в сыворотке крови человека. Устройства в сочетании с синтезированными, а также коммерческими магнитными наночастицами использовались для измерения концентраций маркеров кардио- и онкозаболеваний, малых молекул и олигонуклеотидов. С помощью разработанного быстрого (менее 30 минут) иммунофильтрационного анализа продемонстрирована регистрация маркера инфаркта миокарда - кардиального тропонина I (сTnI) в плазме крови человека на уровне от 12 пг/мл при динамическом диапазоне 3 порядка. Разработаны считывающие устройства пассивных магнитных биосенсорных чипов, использующих как плоские сенсорные поверхности, так и микроколончатые 3D структуры. Такие микрофлюидные 3D структуры использованы впервые в сочетании с МНМ и позволяют удобно реализовывать потоки исследуемых образцов за счет капиллярных эффектов без применения каких-либо прокачивающих устройств. Считывание результатов иммунохимических реакций в разных зонах с различными распознающими рецепторами осуществляется индукционно с помощью микрокатушек внешних электронных устройств. Разработанный подход выгодно отличается от известных подходов создания биосенсорных чипов на основе встроенных микродатчиков магнитного поля, работающих, например, на основе эффекта гигантского магнитосопротивления (ГМС). Преимущества разработанных магнитных миклофлюидных чипов по сравнению с ГМС биочипами состоят в отсутствии внешних контактов и необходимости нанесения сверхплотных и ультратонких пленок для защиты магнитных тонкоплёночных структур от воздействия солевых растворов с различными pH, совместимость с 3D рельефом сенсорной поверхности и т. д. Показано, что аналитические характеристики разработанных мультиплексных биосенсорных методов находятся на уровне современных, гораздо более трудоемких, лабораторных методов иммунохимического анализа. Предложенные методы мультиплексной биосенсорики представляются перспективными для медицинской и ветеринарной диагностики, контроля продуктов питания, мониторинга окружающей среды, безопасности и т. д. Результаты опубликованы в статье: Nikitin M.P., Orlov A.V., Znoyko S.L., Bragina V.A., Gorshkov B.G., Ksenevich T.I., Cherkasov V.R., Nikitin P.I. Multiplex biosensing with highly sensitive magnetic nanoparticle quantification method. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. Available online 21 October 2017. https://doi.org/10.1016/j.jmmm.2017.10.078 Impact Factor =2.63, Q1. 2. Проведены исследования по функционализации МНМ на основе структур из пермаллоя, разработанных в течение первого года, имеющих рекордно высокую детектируемость по нелинейному перемагничиванию (на уровне десятков пикограмм по массе). При обеспечении корректной функционализации путем иммобилизации биомолекул на поверхности такие МНМ представляются перспективными для разнообразных биосенсорных применений. Проведенные исследования использованных ранее авторами проекта 4-х способов иммобилизации биомолекул (Burenin et al. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2015. vol. 407. pp. 3955–3964, Орлов А.В. и др. Acta Naturae. 2014, т.6, с.91-102) показали, что их реализация на поверхности пермаллоя приводит к значительному неспецифическому связыванию. Уменьшить этот эффект планируется с помощью дополнительного нанесения на пермаллоевые структуры покрытий из золота. Для исследования этой возможности разработаны прямые (безметочные) оптические способы контроля многокаскадной динамики связывания взаимодействующих биомолекул и мониторинга функционирования «интеллектуальных» интерфейсных слоев, обеспечивающих адресность связывания наноагентов. Продемонстрирована возможность переноса разработанных протоколов на наночастицы для создания корректно взаимодействующих интерфейсных молекулярных слоев. В частности, показано, что прямой перенос разработанных интерфейсных слоев на наночастицы золота позволяет получать «интеллектуальные» метки для новых форматов иммунохроматографического анализа. Разработанные методы мониторинга динамики многокаскадных молекулярных взаимодействий представляются перспективными для создания новых биосенсорных систем на основе наночастиц, в том числе на основе магнитных наноструктур с золотым покрытием. Часть полученных результатов опубликована в статье: Orlov A.V., Pushkarev A.V., Mochalova E.N., Nikitin P.I., Nikitin M. P. Development and label-free investigation of logic-gating biolayers for smart biosensing. Sensors and Actuators B: Chemical. 257 (2018) 971–979. Available online 10 November 2017. https://doi.org/10.1016/j.snb.2017.11.025 IF=5.401; Q1. 3. С помощью разработанных прототипов регистраторов МНМ развиты неинвазивные методы изучения долговременной эволюции различных МНМ в организме лабораторных животных с возможностью модуляции откликов внешним магнитным полем. Экспериментально зарегистрировано, что ультрамалые магнитные наночастицы с характерными размерами 3 нм, 6 нм и 9 нм, синтезированные методами коллоидной химии, могут циркулировать в кровотоке мелких лабораторных животных (мышей) в течение полутора часов. Такие частицы, функционализированные биораспознающими рецепторами, представляются перспективными для диагностики in vivo. Полученные результаты сравнены с циркуляцией более крупных наночастиц, которые могут быть более эффективны с точки зрения доставки лекарственных препаратов. Для этой цели разработан новый способ синтеза гибридных магнитных наночастиц с пористыми оболочками на основе металлоорганических каркасов, имеющих малый разброс гидродинамических размеров, которые, в зависимости от условий синтеза, составляют от 100 до 700 нм. С помощью количественных измерений регистраторами МНМ установлено, что время циркуляции их в кровотоке сокращается до 7-20 минут, причем они накапливаются, в основном, в селезенке, печени и легких. На данном этапе продемонстрирована перспективность синтезированных гибридных наночастиц для применения в качестве мультимодальных агентов для контрастирования при магнитно-резонансной томографии (МРТ), магнитной и оптической маркировки, а также для многофункциональных наноструктур для применений in vivo, обеспечения адресности доставки за счет связанных распознающих рецепторов, для иммунохроматографического анализа. Простота изготовления, контролируемые свойства биоконъюгации и низкий уровень неспецифического связывания указывают на высокий потенциал подобных наночастиц для применений в качестве агентов-носителей терапевтических препаратов, для биосенсорики, контрастирования МРТ и т.д. Часть результатов исследований опубликована в статье: Tregubov A.A., Sokolov I.L., Babenyshev A.V., Nikitin P.I., Cherkasov V.R., Nikitin M.P. Magnetic hybrid magnetite/metal organic framework nanoparticles: facile preparation, post-synthetic biofunctionalization and tracking in vivo with magnetic methods. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 449 (2018) 590-596. Available online 19 October 2017. https://doi.org/10.1016/j.jmmm.2017.10.070 IF=2.63, Q1. 4. Разработаны методы синтеза парамагнитных ферригидритных наночастиц (ФГН) на основе оксидов железа, стабилизированных полимерной оболочкой, обеспечивающей высокую стабильность наночастиц в физиологических средах. Установлено, что такие наночастицы проявляют ярко выраженный T2-взвешенный контраст MPT-изображений in vivo и могут служить хорошей моделью эндогенного ферритина, являющегося носителем железа в живом организме. С помощью созданных прототипов регистраторов МНМ показано, что в синтезированных образцах ферригидритных наночастиц отсутствуют ферро- и суперпарамагнитные фракции, по крайней мере, на уровне 0,4 нанограмма в объеме 0,2 мл. Проведена характеризация синтезированных наночастиц с помощью МРТ, просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии, а также исследована цитотоксичность, которую, как и использованные выше МНМ, оценивали с помощью МТТ-теста. Эксперименты показали, что жизнеспособность использованных клеток HeLa была одинаково высока независимо от концентрации наночастиц вплоть до уровней 800 мкг/мл как для синтезированных ФГН, так и для обсуждавшихся выше суперпарамагнитных наночастиц. Эти результаты сопоставимы или лучше, чем полученные при исследовании жизнеспособности клеток для коммерчески доступных магнитных наночастиц MAG-ARA (Chemicell GmbH, Германия), специально разработанных для in vivo применений. Показано, что синтезированные ферригидритные наночастицы могут быть использованы как адекватные и легкодоступные модели ядер ферритина. Их привлекательные МРТ контрастирующие свойства в сочетании со стабильностью в физиологических средах делают полученные наночастицы удобными агентами для биомедицинских применений. В частности, из-за низкой токсичности, биосовместимости и возможности функционализации с различными рецепторами синтезированные ферригидритные частицы являются перспективными для улучшения визуализации томографии, биосенсорики, разработки многофункциональных терапевтических агентов следующего поколения. Исполнителями настоящего проекта опубликована часть результатов исследований в статье: Sokolov I.L., Cherkasov V.R., Vasilyeva A.V., Bragina V.A., Nikitin M.P. Paramagnetic colloidal ferrihydrite nanoparticles for MRI contrasting. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. Available online 21 November 2017. https://doi.org/10.1016/j.colsurfa.2017.11.062 IF = 2.714 , Q2. 5. По результатам проделанных в рамках проекта исследований опубликовано 4 статьи в журналах, индексируемых в базах Web of Science и Scopus (3 статьи в журналах из Q1 квартиля и 1 статья в журнале из Q2 квартиля по данным http://www.scimagojr.com/, рекомендованным РНФ) и сделано 12 докладов на Международных и Всероссийских конференциях, 6 из которых - приглашённые или пленарные.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В соответствии с планом в течение третьего года были продолжены работы по оптимизации и усовершенствованию сверхчувствительных методов детекции магнитных наноматериалов, а также по расширению сферы научных применений как высокочувствительных магнитных методов измерений, так и новых перспективных магнитных наноструктур для решения актуальных задач биосенсорики и биомедицинских исследований: 1. Завершены серии биомедицинских экспериментов in vivo c одним из перспективных типов магнитных наноструктур (МНМ), а именно с микро- и нанодисками с вортексным состоянием намагниченности. Такие диски не имеют остаточной намагниченности, не агрегируют в растворах и обладают сильно нелинейной зависимостью намагниченности от величины слабого магнитного поля. Следует отметить, что ранее американскими исследователями в экспериментах in vitro была показана возможность подавления клеток глиомных опухолей человека с помощью микродисков при воздействии на них слабых (не нагревающих) низкочастотных магнитных полей (Kim et al., Nature Materials, 2010, 9, 165–171). Это вызвало бурный интерес к разнообразным биомедицинским применениям подобных наноструктур и большое число важных публикаций. В рамках работы над данным проектом была впервые продемонстрирована ещё одна интересная особенность подобных магнитных наноструктур, а именно возможность их регистрации и топографирования индукционными методами, в том числе в организме животных, с ультравысокой чувствительностью с помощью портативных устройств со сравнительно малыми возбуждающими магнитными полями. Это представляется важным и для метрологического обеспечения биомедицинских исследований с применением магнитных нанообъектов. Для проведения подобных исследований были усовершенствованы два типа регистраторов магнитных наноматериалов MPQ (сокращение термина magnetic particle quantification) по нелинейному перемагничиванию. Это позволило уверенно обнаруживать в живом организме магнитные нанодиcки на уровне суммарной массы 39 пикограмм магнитного материала в широком линейном диапазоне чувствительности - 7 порядков. Установлено, что детектируемые сигналы существенно зависят от ориентации микродисков, что связано с анизотропией их геометрии. Проведен целый ряд биофизических экспериментов по изучению динамики полученных МНМ в организме лабораторных мышей in vivo и их поведения в тканях различных органов ex vivo. Были установлены также зависимости сигналов, регистрируемых при воздействии внешним полем на диски в разных органах, для которых установлена разная степень увеличения сигнала MPQ. Эксперименты показали информативные особенности зависимости сигналов от соотношения диаметра и толщины дисков, их пространственной ориентации и т.д. Так, например, оказалось, что при слабых возбуждающих полях значительно проще регистрировать очень тонкие диски (с меньшей массой магнитного материала), чем толстые. Это связано с разными величинами полей размагничивания структур. Магнитные нанообъекты, регистрируемые с высокой чувствительностью, представляют большой интерес для применений в качестве нанометок в ДНК- и иммуноанализах, биосенсорике, антиконтрафактной защите важных препаратов и т.д. Проведённые опыты по дистанционной регистрации подобных наноструктур в организме лабораторных животных in vivo и ex vivo также подтвердили перспективность использования данного подхода в биологии и медицине. Результаты опубликованы в статье: Nikitin et al. Ultrasensitive detection enabled by nonlinear magnetization of nanomagnetic labels. Nanoscale.10 (2018) 11642-11650. (Импакт-фактор 7.233, Q1). http://dx.doi.org/10.1039/C8NR01511B 2. Продолжена разработка высокочувствительных методов биосенсорики для регистрации биологически активных веществ за счет использования функционализированных МНМ в качестве наномаркеров иммунохимической реакции. Для этого на поверхность различных наноматериалов наносились интерфейсные нанопокрытия из трех типов полимеров, к химически активным группам которых «пришивались» антитела. Для контроля эффективности нанесения полимеров на поверхность, иммобилизации на них антител, исследования распознающих свойств молекул на поверхности и измерения кинетических констант ассоциации и диссоциации взаимодействующих молекул была использована интерферометрическая методика. Были получены три типа полимерных покрытий, а длительность их химической адсорбции позволила контролировать нано-гофрированный характер реакционных поверхностей. Установлено существенное влияние наноструктурированного характера интерфейсного слоя на кинетику взаимодействия биомолекул, что является принципиально важным для создания биосенсорных систем различных типов. Эти особенности позволяют выбрать оптимально структурированные интерфейсные покрытия для функционализации наноструктур и сенсорных поверхностей для разных форматов иммунохимического анализа. Результаты опубликованы в статье: Ivanov et al. Sensors and Actuators B: Chemical. 282 (2019) 984-991 (Импакт-фактор 5.667, Q1). https://doi.org/10.1016/j.snb.2018.11.043 3. Была продолжена разработка высокочувствительных биоаналитических методов, основанных на применении МНМ в качестве носителей и меток иммунохимических реакций. Разработаны фундаментальные основы путей реализации быстрых и высокочувствительных методов детекции биологически активных веществ (стафилококкового энтеротоксина В) и маркеров заболеваний щитовидной железы: тиреотропного гормона и свободного тироксина. На примере регистрации гормона щитовидной железы свободного тироксина (сT4) разработан также более общий метод ультрачувствительного иммунохроматографического анализа (ИХА) для быстрого количественного обнаружения малых молекул непосредственно на месте проведения исследования. Концептуальная новизна, которая переводит ИХА в категорию высокочувствительных количественных тест-систем, связана с использованием бифункциональных лигандов в сочетании с регистрацией магнитных наночастиц со всего объема твердой фазы. Лиганды обеспечивают чрезвычайно высокую аффинность для захвата магнитных нанометок и одновременно эффективно конкурируют с анализируемыми молекулами за ограниченное число антиген-связывающих сайтов на нанометках. Разработанный анализ был продемонстрирован как первый экспресс-метод для ультрачувствительного измерения в сыворотке крови человека свободного тироксина. Предел детекции сT4 составил 20 фМ или 16 фг/мл при времени анализа менее 30 мин с динамическим диапазоном 3 порядка. Проведена оптимизация и всесторонняя характеризация разработанного быстрого магнитного ИХА с помощью нескольких техник, включающих метод количественного определения магнитных частиц, спектрально-корреляционную и спектрально-фазовую интерферометрии, динамическое светорассеяние, иммуноферментный анализ. Показана долгосрочная стабильность конъюгатов «антитело - магнитные наночастицы» и подтверждена специфичность анализа. Кроме того, впервые получены характеристики кинетических параметров взаимодействия между свободным тироксином и моноклональными антителами, а также конкурентного взаимодействия антител со свободным и биотинилированным тироксином. Разработанная универсальная биосенсорная платформа может использоваться для сверхчувствительной детекции малых молекул в медицинской диагностике in vitro, ветеринарии, биобезопасности и борьбы с терроризмом, а также для поиска новых, ранее не обнаруживаемых диагностических биомаркеров в медицине. Результаты опубликованы в статье: Znoyko et al. Ultrasensitive quantitative detection of small molecules with rapid lateral-flow assay based on high-affinity bifunctional ligand and magnetic nanolabels. Analytica Chimica Acta. 1034 (2018) 161-167. (Импакт-фактор 5.123, Q1). https://doi.org/10.1016/j.aca.2018.07.012 4. Полученные в рамках данного проекта научные результаты по биосенсорике с помощью магнитных наночастиц были обобщены в обзоре авторов в авторитетном международном журнале - Tregubov et al. Advanced Smart Nanomaterials with Integrated Logic-Gating and Biocomputing: Dawn of Theranostic Nanorobots. Chem. Rev. 118 (2018) 10294-10348. (Q1, импакт-фактор 52.613, который занимает 4 место в рейтинге мировых научных изданий. https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021%2Facs.chemrev.8b00198). Показано, что полученные результаты по распознаванию биомолекул и антигенов на патогенных клетках с помощью функционализированных наночастиц в перспективе могут быть использованы для более широкого спектра приложений медицинской диагностики и терапии, контрастирования изображений патогенных областей в живом организме, в том числе с помощью магниторезонансной томографии и т.д. В частности, результаты по сенсорике и биораспознаванию молекул могут быть использованы для более точной направленной доставки лекарственных препаратов путем одновременного анализа нескольких разноплановых факторов. Более того, конструкции из наночастиц для иммунохимического анализа могут быть заранее запрограммированы с использованием булевой логики для решения целого ряда острых вопросов современной биомедицины (концептуальный рисунок коллектива исполнителей проекта редакция журнала Chem. Rev. вынесла на обложку - https://pubs.acs.org/toc/chreay/118/20). 5. По результатам выполненных в 2018 году исследований в рамках проекта опубликовано 5 печатных работ в журналах, индексируемых в базах Web of Science и Scopus, из них 4 – в научных изданиях первого квартиля (Q1) с суммарным импакт-фактором 70,636. В течение 2018 года сделано 12 докладов, из них 2 пленарных, 2 приглашённых, 5 устных и 3 стендовых доклада на ведущих международных и всероссийских конференциях, в том числе на всех ранее запланированных конференциях.