Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Исследовали новые биополимеры внеклеточного матрикса медуз Aurelia aurita и Bougainvillia superciliaris. Исследовали сходство кДНК мезоглеинов, полученных из образцов медуз A. aurita, собранных в акваториях Белого (WsA) и Японского морей (JsA). Установлено, что мезоглеин JsA достоверно отличается от ранее выделенного мезоглеина медуз Белого моря. Сравнение аминокислотных последовательностей подтверждает высокую степень различий между мезоглеинами WsA и JsA. Для идентификации причин выявленных различий препаратов, полученных из разных популяций медуз, морфологически идентифицируемых как один вид, провели генетический анализ видовой идентичности. Секвенировали последовательности генов 18S и 28S рРНК медуз Aurelia из Белого, Японского и Черного (BsA) морей. Обнаружено, что 18S и 28S рРНК JsA при всех использованных типах анализа располагаются отдельной группой, а последовательности WsA и BsA формируют смешанную группу. Проведено кариотипирование образцов A. aurita. Показано, что кариотип A. aurita из Белого и Черного морей содержит 38 хромосом (19 пар), тогда как кариотип медуз из Японского моря — 34 хромосомы (17 пар). Выявленные различия, вопреки морфологическим данным, свидетельствуют о другой видовой принадлежности медуз рода Aurelia, обитающих в Японском море. Установленный факт объясняет существенные различия кДНК мезоглеинов Aurelia, полученных от разных популяций. Провели анализ транскриптома Aurelia на разных стадиях развития. Для анализа использован массив данных GBRG00000000.1, полученный на материале Aurelia aurita из Красного моря (Brekhman et al., 2015). В транскриптоме нашли 11 ZP доменных белков, уровень транскрипции которых сильно зависит от стадии жизненного цикла. Выявлено, что 2 транскрипта содержат DSL домен, и соответствуют мезоглеину и его изоформе. Самые длинные из найденных транскриптов (190987_c1_seq4 и seq1; Mr <90 kDa), вероятно, представляют собой белки пластины контакта, участвующие в оплодотворении. Несмотря на большую длину, у них нет известных доменов, кроме участков пониженной сложности. Среди ZP доменных белков найдены белки с доменами EGF_CA – кальций-связывающие EGF-подобный домен (Calcium-binding EGF-like domain), FGB – фибриноген-подобные домены (Fibrinogen-related domains), MNNL – N концевой участок домена лигандов Notch (N terminus of Notch ligand domain). Проведен поиск оптимальных условий экстракции белков внеклеточного матрикса медузы Aurelia aurita. Экспериментально установлены значения pH и ионной силы экстрагирующих растворов для наиболее эффективного получения конечного белкового препарата: рН 3.5, 150мМ NaCl и pH 7.5, 300мМ NaCl. С применением результатов исследования данных физико-химических свойств, получен препарат мезоглеина, пригодный для проведения тестирования на клеточных культурах. Для создания технологии получения препарата фактора агрегации личинок Bougainvillia superciliaris (LAF – larval aggregation factor) разработали методику лабораторного получения стадий индивидуального развития, позволяющую эффективно получить зрелые планулы данного вида, индукция метаморфоза которых сопровождается выделением LAF (Demidenko, Kumeiko, 2016). Изучен переход от личиночной стадии к полипоидной у гидроида B. superciliaris и получены препараты LAF, изолированные в ходе данного процесса запуска механизмов метаморфоза. Анализ физико-химических свойств препарата позволил определить молекулярную массу мажорного полипептида LAF, которая соответствует 126 кДа. Получены специфические поликлональные антитела к LAF и проведен их анализ методом вестерн-блоттинга (Western blot). Проведена оценка влияния препаратов мезоглеина из медуз Aurelia Японского моря на динамику клеточного роста, жизнеспособность и адгезионные свойства культур клеток нейрального ряда млекопитающих (глиомы С6, нервных стволовых клеток). Количественный анализ результатов культивирования проводили методом автоматизированной in vivo микроскопии с программным модулем “машинного зрения” (Cell IQ). Установлено, что адгезированный, на поверхность многолуночного планшета, белковый препарат из мезоглеи Aurelia aurita не является токсичным, сохраняя высокую жизнеспособность клеток. Установлено, что при краткосрочном культивировании клеток глиомы на поверхности с иммобилизованным препаратом мезоглеина в течение 1 часа доля адгезированных клеток составила в среднем 61%, что выше данного показателя по сравнению с контрольными образцами на полистирольной поверхности планшета (43%). Культура нервных стволовых клеток эмбрионов крыс на поверхности мезоглеина характеризовалась выраженной адгезией нейросфер, идентифицированной по активному высеванию и распластыванию клеток на периферии нейросфер. Разработана и апробирована схема эффективного выделения нового Ca2+-зависимого растворимого лектина из гемолимфы двустворчатого моллюска Modiolus kurilensis с сохранением его высокой агглютинирующей активности. Протокол включает индукцию повышения содержания агглютининов в плазме моллюсков инъекцией бактериальных антигенов, взятие гемолимфы в фазу наивысшей агглютинирующей активности (Grinchenko et al., 2015), первичное грубое фракционирование белков гемолимфы высаливанием растворами сульфата аммония различной степени насыщения, обессоливание и аффинную хроматографию на неподвижной фазе с иммобилизованным полисахаридами, обогащенными полигалактуронатом. Получены антитела к выделенному лектину высокой активности и специфичности. Определены основные физико-химические свойства лектина. Установлено, что мономер лектина представлен полипептидом с молекулярной массой 19 кДа, обладает Ca2+-зависимой агглютинирующей активностью, проявляющейся более выражено при рН 5-6. Исследование термолабильности лектина позволило установить его высокую активность при температуре до 50°С и ее существенный спад при 60°С и выше. Методом секвенирования по Эдману установлена N-концевая последовательность, состоящая из 15 аминокислотных остатков. Исследование препарата тандемной масс-спектрометрией в варианте лазерной матричной дессорбции/ионизации с времяпролетным детектором (MALDI TOF/TOF) пептидов после трипсинолиза лектина, показало отсутствие достоверных совпадений с белками, представленных в базах данных. Полученные результаты помогут в исследовании биологической активности выделенного вещества, в том числе при анализе его взаимодействия с различными клеточными поверхностями. Полученные результаты позволят сконструировать специфические праймеры для получения кДНК и ее секвенирования. Другой задачей данного проекта являлось исследование продуцентов тетродотоксина. Тетродотоксин - важный исследовательский инструмент, потенциальное терапевтическое соединение и ключ для понимания поведения животных и естественного отбора. Роль тетродотоксина в бактериях-продуцентах является одной из актуальных проблем для данной отрасли знаний. До настоящего момента не было никаких данных ни о местах синтеза, ни о распределении тетродотоксина (ТТХ) в бактериях, что приводило к потере бактериями способности синтезировать ТТХ в лабораторных условиях. Ультрамикроскопические исследования жизненного цикла бацилл, ассоциированных с морскими гидробионтами, подбор оптимальных условий формирования спор для Bacillus sp. 1839 (Shokur et al., 2016), а также миграция токсина в процессе спорообразования проведены впервые. Согласно полученным данным, при стимуляции спорообразования Bacillus sp. 1839 в растворах уже через час после начала инкубации в культуре обнаруживаются свободные споры. Установлено, что во время созревания эндоспоры синтез ТТХ значительно увеличивается. Так, если у ранних эндоспор мы выявили лишь единичную диффузно локализованную метку, то уже у зрелых – метка многочисленна и локализована в основном в оболочке эндоспоры. Так как зародыш эндоспоры метаболически неактивен, то именно оболочка эндоспоры и является основным местом синтеза ТТХ; а наличие ТТХ в самом зародыше и в цитоплазме материнской клетки связано с диффузией токсина. Впервые прослежена динамика накопления ТТХ во время спорогенеза. ТТХ начинает синтезироваться сразу после активации процесса спорообразования. Выявлено что наиболее интенсивная метка наблюдается уже через час после начала эксперимента, и она локализована в оболочке бактерий. Нами впервые было проведено ультрамикроскопическое исследование распределения тетродотоксина в немертинах (Magarlamov et al., 2016). ТТХ был выявлен в конечных органах-мишенях, то есть органах, которые являются его конечным депо и выполняют «токсическую» функцию. Исследование показало, что конечными клетками-мишенями ТТХ являются мукоидные и псевдокнид-содержащие клетки железистого эпителия хобота и бациллярные клетки I типа эпителия кожи. Это хорошо согласуется с предыдущими результатами, полученными на других видах немертин: наибольшая концентрация ТТХ наблюдается в железистых клетках покровного эпителия и эпителии хобота (Tanu, 2004; Camnbell, 2009). Электронномикроскопический уровень детализировал полученные данные, и позволил выявить более строгую локализацию токсина. Данные о наличии токсина в органоидах, ответственных за пластический обмен в клетке, позволили нам впервые выдвинуть гипотезу внутриклеточной миграции ТТХ и его последующей экскреции. В результате проведенных исследований ассоциативной микрофлоры немертин выделено 64 штамма гетеротрофных бактерий. Некоторые особенности исследуемых штаммов (мультирезистентность к антибиотикам, антимикробная активность, потеря продуктивности вне организма животного) позволяют предположить наличие симбиотических взаимоотношений с организмом хозяина. Генетический анализ 10 штаммов показал преобладание в ассоциативной микрофлоре изолятов, принадлежащих к группе Proteobacteria, что характерно для микробных ценозов морских экосистем. Способность синтезировать ТТХ была проанализирована только на 43 штаммах из выделенных 63. Остальные 19 штаммов давали скудный рост на питательной среде, что сделало невозможным выявление ТТХ в образцах. На сегодняшний день ни один из 43 проанализированных штаммов не показал положительной реакции на ТТХ. В дальнейшей работе мы планируем подобрать условия обильного роста для оставшихся 19 штаммов и проверить их на наличие ТТХ. Кроме того, нами будут отдельно еще раз проанализированы штаммы из рода Bacillus, для которых мы сначала получим насыщенную спорами культуру, а затем уже проверим способность на продукцию токсина. Показано, что накопление токсина у Bacillus sp. 1839 происходит главным образом в эндоспорах и свободных спорах, т.е. количество токсина напрямую зависит от бактериальной биомассы. Понимание особенностей жизненного цикла и спорообразования бактерий, изучение особенностей биологической продукции, динамики распределения и миграции ТТХ является важным заделом для развития биотехнологического производства эффективного анестетика на основе споровой культуры бацилл.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Исследование биополимеров внеклеточного матрикса является важной задачей молекулярной и клеточной биологии, поскольку позволяет раскрыть фундаментальные механизмы взаимодействия клеток с окружающей средой. Межклеточные коммуникации, обеспечивающие ключевые процессы управления делением и дифференцировкой клеток опосредованы внеклеточным матриксом, таким образом, изучение его молекулярного состава у низших многоклеточных животных позволяет раскрыть базовые механизмы молекулярного распознавания и клеточных взаимодействий. В рамках работ по настоящему проекту исследовали биополимеры внеклеточного матрикса кишечнополостных животных. Ранее авторами проекта обнаружены новые биополимеры внеклеточного матрикса – белки мезоглеин и Gf180 у сцифоидных медуз Aurelia aurita и фактор агрегации личинок (LAF) гидроидов Bougainvillia superciliaris. В рамках выполнения задач данного этапа установили, что в жизненном цикле A. aurita экспрессия мезоглеина начинается на стадии сцифистомы. Экспрессия доказана на уровне синтеза РНК методом ПЦР на специфичных праймерах; локализацию мезоглеина с помощью антител проследили в мезоглеальных клетках, которые именно на этой стадии выделяются как отдельный клеточный тип (Kotova et al., 2016). Недавно опубликованы данные о транскриптомах 6 стадий развития медузы, сделанные методом Illumina RNA-Seq, и наши данные совпадают с опубликованными, но дополняют их точными морфологическими характеристиками. Анализ опубликованного транскриптома A. aurita позволил сконструировать праймеры для секвенирования полной кДНК гена Gf180, продукт которого является основой пластины контакта (первым аналогом Zona pellucida (ZP), принципиальным для оплодотворения) и также как мезоглеин содержит ZP домен. На следующем этапе работ предполагается получить полный ген белка Gf180. В ходе изучения развития гидроидной медузы B. superciliaris впервые установлено, что фактор агрегации личинок LAF и серотонин локализованы в одних и тех же клеточных депо – крупных мукоидных клетках, большая часть которых выявляется на переднем полюсе личинки. Экспериментально доказали, что в ответ на серотониновую внешнюю стимуляцию зрелых личинок гидроида происходит совместное высвобождение LAF и серотонина из мукоидных клеток, что обеспечивает синхронизацию метаморфоза в массе личинок, культивируемых совместно. Для изучения молекулярной структуры LAF, идентификации его транскриптов и расшифровке структуры гена провели масс-спектрометрический анализ и частичное секвенирование N-концевого полипептида препарата LAF, подвергнутого предварительному дегликозилированию. Изучение полипептидных фрагментов LAF, полученных в результате трипсинолиза, методом масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбцией-ионизацией не позволило идентифицировать полипептид LAF и отнести его к какому-либо классу белков внеклеточного матрикса. Секвенирование очищенного полипептида по Эдману позволило расшифровать N-концевой гексапептид. На основании полученных результатов микросеквенирования полипептида LAF будут сконструированы праймеры для амплификации и секвенирования его кДНК. Работы по расшифровке полной молекулярной структуры и идентификации LAF будут продолжены на следующем этапе проекта. Другой задачей проекта являлось изучение свойств обнаруженного нами нового лектина из гемолимфы морского двустворчатого моллюска Modiolus kurilensis. Для расшифровки молекулярной структуры лектина на основе данных проведенного ранее N-концевого микросеквенирования очищенного белка были сконструированы вырожденные праймеры, выделена тотальная РНК, получена кДНК методом обратной транскрипции, проведены полимеразные цепные реакции и осуществлено секвенирование полученного ампликона кДНК предполагаемой длины. Расшифровка ампликона и его анализ с помощью ресурсов биоинформатики свидетельствовал об ошибочном секвенировании последовательности и идентификации продукта одного из митохондриальных генов. С целью решения проблемы и получения валидных результатов было проведено повторное секвенирование N-концевого пептида лектина по методу Эдмана с использованием секвенатора новой модели с предварительным дегликозилированием, восстановлением и алкилированием препарата. В результате проведенных работ была получена достаточно протяженная последовательность пептида, состоящая из 22 аминокислотных остатков. Результаты повторного секвенирования по Эдману позволили уточнить идентификацию 4 аминокислотных остатков. В результате ПЦР анализа были получены и секвенированы 6 фрагментов целевой длины, один из которых длинной 900 п.н. обладает существенным сходством с последовательностью гена предсказанного белка в геноме Mytilus galloprovincialis. Проведено уточнение спектра и степени углеводной специфичности исследуемого лектина. Установлено, что наибольшую специфичность исследуемый лектин имеет к полимерным молекулам – препарату пектина, имеющего в качестве основного молекулярного паттерна полигалактуронид, а также маннану из пекарских дрожжей. Ингибирующая активность пектина была наиболее значительной и отличалась более чем на порядок от таковой маннана. Некоторые моносахариды, используемые в концентрациях на два порядка выше полигалактуронида, также оказывали ингибирующий эффект: уроновые кислоты, являющиеся мономерами пектинов, N-ацетилированные амины глюкозы и галактозы, сама галактоза, ее эпимер гулоза и дезоксигалактоза. Получен конъюгат лектина с флуорохромом – FITC, и проведен анализ сродства лектина к поверхности мембран восьми клеточных линий: HeLa, RKO, HEK 293, HTC 116, N2a, первичной глиальной опухоли пациента (Gli 1 FEFU), мышиным и крысиным перитонеальным макрофагам. Выявлена локализация конъюгата лектин-FITC на поверхности всех опухолевых клеточных линий в виде многочисленных достаточно крупных конгломератов, отсутствующих на поверхности макрофагов. Проведен количественный анализ влияния лектина на рост популяции опухолевых клеток HeLa. Выявлено ингибирование роста клеточной линии HeLa, зависящее от концентрации лектина. Наблюдали трехкратный ингибирующий эффект 4мкМ раствора лектина. Выявили агглютинирующую активность лектина в отношении грамположительных (Bacillus subtilis) и грамотрицательных (Vibrio alginolyticus) бактерий с использованием флуоресцирующего конъюгата лектин-FITC. Полученные результаты изучения взаимодействия нового лектина с различными антигенами и его ингибирующий эффект на рост популяции раковых клеток свидетельствуют о том, что о данный белок действительно может представлять интерес для прикладных разработок, в том числе для создания систем диагностики злокачественных новообразований. Проводили фундаментальные исследования, направленные на изучение повторяющихся последовательностей геномов морских беспозвоночных, их транскрипции и роли в организации генных ансамблей (Подгорная, 2016; Podgornaya et al., 2016). Начаты исследования по изучению транспозонов (transposable elements, TE) в геноме морского ежа, важного модельного объекта биологии развития. На основе данных секвенирования транскриптома Strongylocentrotus intermedius, генома и транскриптома S. purpuratus, доступных в базе данных Sequence Read Archive, провели анализ ТЕ оригинальными методами биоинформатики, разработанными ранее для анализа повторов в любом прочитанном геноме (Остромышенский и др, 2016; Kuznetsova et al., 2016; Galaktionov et al., 2016). Идентифицированы фрагменты, а также почти полные последовательности 200 мобильных элементов генома S. intermedius, пригодные для конструирования праймеров с целью проверки стадий специфичной транскрипции элементов. Выделена РНК и кДНК 5 стадий развития S. intermedius; 100 пар праймеров проверено на матрице тотальной ДНК морского ежа S. intermedius; 90 из них пригодны для использования на матрице кДНК. Другим направлением проекта являлось изучение особенностей продукции тетродотоксина (ТТХ) симбиотическими бактериями ТТХ-содержащих животных, а также пути его поступления от бактерий в животное-носитель. ТТХ – гуанидиновый нейротоксин, впервые выделенный из рыбы фугу, а затем обнаруженный в различных морских организмах, является перспективным лекарственным агентом для использования в терапевтической практике в качестве высокоэффективного обезболивающего и миорелаксанта. Отсутствие экономически целесообразного способа получения ТТХ является существенным препятствием на пути его внедрения на рынок лекарств. Исследования последних лет неопровержимо доказывают, что первичным источником ТТХ являются морские бактерии, штаммы которых, относящиеся к разным таксономическим группам, неоднократно изолировали из ТТХ-содержащих животных и морской среды. Многочисленных попытки исследователей использовать бактериальные штаммы-продуценты ТТХ для биотехнологического производства токсина не увенчались успехом, что связано с отсутствием данных об условиях его продукции в бактериях, его дальнейшей передачи в организм животного и аккумуляции в конечных органах-мишенях. В работе впервые сделан подробный анализ продукции ТТХ различными штаммами рода Bacillus, выделенными из токсичных морских червей типа Nemertea и среды их обитания (Melnikova et al., 2017, принята в печать). Установлено, что у всех представителей морских бацилл продукция ТТХ приурочена к переходу с споровую форму, как было ранее показано для штамма Bacillus sp. 1839 (Magarlamov et al., 2014; 2017, принята в печать). У трех представителей рода Bacillus, которые по данным секвенирования гена 16S рДНК относятся к разным видам, было выявлено наличие ТТХ и его аналогов тремя независимыми методами: масс-спектрометрией, иммуноцитохимией и биотестами на модельной культуре нейроглиальных клеток. Проведенные исследования показали, что морские бациллы являются единственным на сегодняшний день надежным источником получения ТТХ и других токсинов блокирующих натриевые каналы для нужд биофармацевтической промышленности. Исследованы возможные пути передачи ТТХ от бактериального продуцента к животному-носителю и показано, что поступление токсина в немертину Lineus alborostratus от ТТХ-продуцирующего штамма Bacillus sp. 1839 осуществляется через пищеварительную систему организма животного. Изучены внутриклеточные структуры, участвующие в захвате токсина и переносе его внутрь организма. Показано, что транспорт ТТХ внутрь организма животного-носителя осуществляется через «фагоцитарную» систему клеток кишечного эпителия. Конечными сайтами аккумуляции нейротоксина в органах-мишенях в немертине L. alborostratus (Magarlamov et al., 2016) являются бациллярные клетки I типа в стенке тела и мукоидные клетки железистого эпителия хобота. При этом ТТХ-метка ассоциирована с железистыми гранулами, ядерной оболочкой и мембранами эндоплазматического ретикулума. На основании полученных результатов предложен путь внутриклеточной миграции ТТХ: после попадания в клетку кишечного эпителия ТТХ мигрирует в органоиды, ответственные за белковый синтез и постепенно накапливается в секреторных гранулах. Далее ТТХ вместе с содержимым гранул выходит из клеток за счет апокриновой секреции. Был проведен поиск молекул-переносчиков, обеспечивающих селективный трафик ТТХ в немертине C. simula. С помощью дот-блот иммуноанализа было установлено, что в экстрактах червя, полученных в ходе первичной очистки присутствуют соединения, предположительно, белковой природы, обладающие способностью связывать ТТХ. С помощью нативного белкового электрофореза было обнаружено, что ТТХ-связывающий белок из C. simula обладает молекулярной массой около 200-220 кДа, что находится в диапазоне характерном для уже обнаруженных ТТХ-связывающих белков. Полученные фундаментальные результаты позволят детально охарактеризовать молекулы-переносчики токсина, которые могут быть использованы как в биотехнологических процессах по его производству и очистке, так и выступать в качестве антидотов. Полученные результаты исследований представляют интерес для создания новых биомедицинских технологий с использованием специфических молекул морских организмов и биотехнологических процессов, связанных с их биосинтезом, аккумуляцией и механизмами молекулярного распознавания.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1. В рамках работ по изучению свойств биополимеров внеклеточного матрикса кишечнополостных Aurelia aurita и Bougainvillia superciliaris, изучение возможности их использования в биомедицинских клеточных технологиях были получены препараты исследуемых биополимеров медуз – мезоглеина и фактора агрегации личинок (LAF). Были детально исследованы условия селективной экстракции мезоглеина и установлено, что для эффективного получения его высокоочищенных нативных препаратов необходимо проводить его выделение и очистку при рН3,5 и средней ионной силе (100 мМ NaCl) в присутствии восстанавливающих реагентов. Предпринята попытка выявления транскриптов LAF с использованием ранее полученных данных о последовательности из 6 аминокислотных остатков его N-концевого фрагмента. С использованием серии вырожденных праймеров, сконструированных на основе данной последовательности, и продуктов обратной транскрипции, получаемых на основе тотальной РНК, выделенной из личинок B. superciliaris, не удалось получить специфических продуктов и расшифровать структуру соответствующей белку кДНК. Для решения проблемы секвенирования полноразмерного транскрипта новый препарат нативного LAF был подвергнут длительному ферментативному дегликозилированию, восстановлению и алкилированию для удаления модификаций, мешающих расшифровке более протяженного N-концевого фрагмента. Повторное секвенирование препарата не позволило получить данных более длинного прочтения. Очевидно, что причиной этих результатов являются существенные посттрансляционные модификации в N-концевом регионе молекулы. Для установления структуры кодирующей последовательности LAF необходимо в дальнейшем получить серию продуктов ферментативной деградации, выполнить их очистку и подробный анализ для конструирования праймеров, соответствующим внутренним регионам молекулы. Для оценки возможности использования мезоглеина в биомедицинских клеточных технологиях исследовали поведение нейральных стволовых клеток (НСК) эмбрионального мозга крыс, культивируемых на поверхности субстрата, покрытого мезоглеином. Выявили высокий уровень адгезии данных клеток на мезоглеине, в том числе в сравнении с полистиролом и поверхностью, покрытой коллагеном I. Импульсное мечение BrDU не выявило снижения ДНК-синтетической активности клеток, культивируемых на мезоглеине. Культивирование НСК на поверхности мезоглеина не способствовало выходу клеток на нейрональную дифференцировку, а напротив сохраняло клетки, маркируемые антителами против нестина и глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), даже в условиях пониженной концентрации bFGF и EGF. Наблюдаемый эффект вероятно свидетельствует о возможном влиянии мезоглеина, сходном с таковым лигандов Notch, для которых как и для мезоглеина характерно наличие в структуре DSL домена. 2. Методом иммуноцитохимии с использованием самостоятельно полученных и очищенных антител кролика к лектину из плазмы Modiolus kurilensis установлено, что основным источником его синтеза являются гемоциты. Анализ препаратов выявил в отдельных типах гемоцитов гранулы, проявляющие высокую реактивность с антителами против исследуемого лектина, которые вероятно являются специализированными структурами его накопления для последующего функционирования в защитных реакциях иммунитета после дегрануляции специфических гемоцитов. Методом двумерного электрофореза установлена изоэлектрическая точка (pI) белка, соответствующая 6,6. Другим важным биохимическим параметром лектинов является спектр и степень их аффинитета к углеводам. Проведен уточняющий анализ специфичности лектина к схожим по структуре полисахаридам, гомологичным пектину (полигалактурониду), к которому ранее был показан наибольший аффинитет. Установлено, что специфичность возрастает при увеличении степени этерификации пектинов, а также наиболее выражена к производным полигалактуронидов небольшой молекулярной массы. Крайне важным в исследованиях белков является обнаружение и расшифровка их кодирующих структур. Проведена значительная работа по поиску и расшифровке транскрипта исследуемого лектина. Применение полученных различным способом матриц, разных полимераз и условий ПЦР, а также разнообразных праймеров, сконструированных на основе ранее полученных двух последовательностей N-концевого фрагмента лектина не выявили искомого продукта. Повторные 2 секвенирования белка по Эдману позволили с высокой точностью установить пептидную последовательность длиной 40 аминокислотных остатков, среди которых в положениях 5, 8 и 12 были выявлены остатки с неизвестной модификацией. Все ранее использованные праймеры были сконструированы на основании пептидных последовательностей, включающих в том числе ошибочные аминокислотные остатки, что привело к негативным результатам. Длина последнего полученного N-концевого фрагмента белка позволяет провести биоинформатический поиск гомологичных структур. Однако ни одной схожей структуры не найдено ни в базе нуклеотидных последовательностей (TBLASTN), ни белковых (BLASTP), что еще раз показывает уникальность исследуемой молекулы и объясняет некоторые сложности в его изучении. Одним из наиболее важных ранее показанных свойств исследуемого белка является его избирательное связывание с клетками опухолевых линий. Аффинная хроматография с использованием носителя с ковалентно связанным лектином показала его высокую таргетность в отношении поверхностных детерминант опухолевых клеток линии N2a – во фракции специфически связывающихся молекул выявлено присутствие полипептида лишь одной молекулярной массы (51,6 кДа). Такая избирательность может являться ценнейшим свойством данного белка для изучения клеточных поверхностей опухолей и онкодиагностики. 3. Другим направлением проекта является изучение молекулярных механизмов синтеза и аккумуляции тетродотоксина (ТТХ) в морских организмах. ТТХ - один из сильных низкомолекулярных нейротоксинов бактериального происхождения, обнаруженный во многих типах животных, а также одноклеточных водорослях. Являясь высокоспецифичным блокатором потенциал-зависимых натриевых каналов в нервных и мышечных клетках, этот токсин рассматривается в качестве перспективного анестезирующего и анальгетического агента. Однако многие вопросы функционирования ТТХ в биологических системах остаются без ответа. Важнейшими аспектами исследования данного токсина на сегодняшний день являются биосинтетический путь его образования в бактериях-продуцентах и молекулярные механизмы его накопления в животном-носителе. Знание этих фундаментальных процессов может быть использовано для разработки биотехнологии получения токсина и биологических систем его иммобилизации для применения в различных научно-медицинских областях. В рамках настоящей работы впервые показано наличие ТТХ-связывающих структур во фракциях белковых экстрактов высокотоксичной немертины Cephalothrix simula и тотальном белковом экстракте бактериального штамма-продуцента Bacillus sp. 1839. С использованием афинной хроматографии с последующим ОФ ВЭЖХ и иммуноблоттингом были выделены индивидуальные ТТХ-связывающие белки, молекулярная структура которых была изучена с помощью MALDI-ToF MS и H1 ЯМР. По результатам анализов было выявлено, что данные белки не имеют гомологии с уже известными белками, а значит, могут быть отнесены к семейству новых для науки белков. Обнаружение ТТХ-связывающих белковых структур в ТТХ-содержащей немертине C. simula и бактериальном штамме Bacillus sp. 1839 свидетельствуют об универсальности механизма связывания токсина, как для эукариотических, так и прокариотических организмов. Впервые проведено полногеномное секвенирование бактериального штамма-продуцента токсина. По результатам анализа штамм Bacillus sp. 1839 отнесен к виду Bacillus pumilus. С помощью NGS получены транскриптомы исследуемой бактерии в условиях стимуляции продукции токсина и без таковых и проведен их сравнительный анализ. С помощью методов и ресурсов биоинформатики проведен анализ генома исследуемого штамма с ориентацией на геном близкородственного растительного штамма B. pumilus TUAT1. По результатам проведенных исследований в геноме ТТХ-продуцирующего штамма Bacillus sp. 1839 выявлен уникальный кластер генов, предположительно участвующих в синтезе ТТХ. Анализ генов, входящих в эту область, позволил предположить механизм сборки молекулы ТТХ на основе объединения двух молекул лизина. На основании анализа литературы и данных, полученных в ходе всего срока выполнения проекта, была предложена гипотеза о путях поступления ТТХ от бактерий в животное-носитель (Magarlamov, Melnikova, Chernyshev 2017), включающая механизм поступления токсина в окружающую среду для бактерий рода Bacillus (Magarlamov et al., 2017), путь миграции токсина в животном носителе (Magarlamov et al., 2016) и вклад собственной микрофлоры животного в его токсичность (Melnikova et al., 2017). 4. Продолжаются фундаментальные исследования, направленные на изучение повторяющихся последовательностей геномов морских беспозвоночных, их транскрипции и роли в организации генных ансамблей (Подгорная, 2016; Podgornaya et al., 2016; Подгорная и др., 2018). Понимание этих процессов необходимо для возможности управлять программами индивидуального развития организмов. Выявлены и классифицированы транспозоны (transposable elements, TE) в геноме морского ежа Strongylocentrotus purpuratus. На основе данных секвенирования транскриптома S. intermedius, генома и транскриптома S.purpuratus, доступных в базе данных Sequence Read Archive, проведен анализ ТЕ оригинальными методами биоинформатики, разработанными ранее для анализа повторов в любом прочитанном геноме (Остромышенский и др, 2016; Kuznetsova et al., 2016; Galaktionov et al., 2016). Определено количество ТЕ разных классов в геноме S. purpuratus и доступном в базах данных транскриптоме целомоцитов взрослого ежа S. intermedius. Показана ассиметричность расположения ДНК транспозонов в геноме и транскриптоме взрослого организма. Идентифицированы фрагменты, а также почти полные последовательности 264 ТЕ генома морского ежа S. intermedius. Произведен отбор пригодных для конструирования праймеров ТЕ, который необходим для анализа стадия-специфичной транскрипции элементов. Транскриптомы разных стадий развития ежа S.purpuratus взяты из открытых баз данных. Выявлено две группы ТЕ, экспрессия которых зависит и не зависит от стадии развития организма. Показано, что также как в транскриптоме взрослого организма S.purpuratus, в транскриптомах эмбриональных стадий значительное место занимают разные ДНК транспозоны. Выявлена взрывная транскрипция ТП (MSAT_1), что, видимо, является общебиологической закономерностью. Транскриптомы эмбриональных стадий S. intermedius находятся в процессе секвенирования. Таким образом, проведена вся подготовительная работа для выполнения следующего этапа – экспериментального доказательства роли конкретных ТЕ в регуляции развития. (1) по геному S. purpuratus рассчитаны и проверены ТЕ генома S. intermedius; (2) определены максимальные изменения транскрипции отдельных ТЕ на разных стадиях развития S. purpuratus; (3) проводится секвенирование транскриптомов ранних стадий развития S. intermedius.