Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Для создания фоточувствительных композиций на основе хитозана для получения структур методом лазерной стереолитографии был синтезирован ряд реакционноспособных непредельных производных хитозана – аллилхитозаны с различной структурой и степенью замещения. Твердофазный синтез аллилхитозана проводили совместным деформированием в экструдере хитозана и бромистого аллила без катализа или в щелочной среде. Исследование синтезированных производных методами ИК и ЯМР-спектроскопий, а также элементным анализом показало, что проведение реакции без щелочного катализа позволяет получить N-замещенные непредельные производные хитозана со степенью замещения до 20 мольных %. Проведение твердофазного синтеза в условиях щелочного катализа приводит к получению производных хитозана с содержанием аллильных фрагментов в растворимых в разбавленных кислых водных растворах фракций от 5 до 50 мольных %. Для создания фоточувствительных композиций для получения структур методом лазерной микростереолитографии высококонцентрированные ( 20 мас-%) растворы синтезированных непредельных производных хитозана смешивали с фотоинициатором Irgacure 2959. Структурирование полученных фоточувствительных композиций проводили методом двухфотонной лазерной микростереолитографии. В результате были получены хитозановые матриксы , представляющие из себя совокупность цилиндров с характерными параметрами: высота -80 мкм и внешний диаметр- 160 мкм. Технология получения скаффолдов позволяет варьировать размеры отдельных структурных единиц (цилиндров), что в свою очередь позволяет варьировать пористость трехмерных полученных образцов. Исследовались механические характеристики пленок полученных на основе фоточувствительных композиций. Показано, что механические свойства (прежде всего модуль Юнга) пленок снижаются, при увеличении степени замещения групп хитозана. Полученные образцы полимерных матриксов из хитозана исследовали на цитотоксичноть in vitro экстракционным методом с использованием линейной культуры клеток, рекомендованной ГОСТ Р ИСО 10993-5–2009. На клеточной линии Vero (CCL 81) были проведены 2 серии исследований экстрактов материалов на цитотоксичность. На основе испытаний предолжены методы подготовки материалов на основе матриксов из хитозана для их использования в экспериментах на животных. На основании первичного скрининга и данных по цитотоксиности было проведено тестирование образцов на культурах клеток MCF7 и Vero на 3 сутки культивирования клеток непосредственно на исследуемом материале. МТТ-тестирование показало, что исследуемые образцы из хитозана не обладают цитотоксичностью и пригодны для использования в качестве подложки, однако применяемые линейные культуры демонстрируют лучшую адгезию и пролиферацию на культуральном пластике по сравнению с исследуемыми образцами. Работа с клеточными культурами мезенхимальных стромальных клеток костного мозга проводилась в соответствии с общими принципами осуществления культуральных исследований в ЦКП «Регенеративная медицина» Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Все манипуляции с клетками проводили в стерильной зоне класса А (5 класс по ISO. Были отработаны и оптимизированы технологические этапы по получению мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека: забор костного мозга (уменьшена травматизация зоны забора - значительно снижен объем аспирата костного мозга до 10 мл); транспортировка с контролем температуры; выделение мезенхимальных стволовых клеток из небольшого объема образца КМ; культивирование (экспансия), заморозка; криохранение при температуре жидкого азота; разморозка (жизнеспособность более 95%); характеризация с помощью проточной цитофлоуриметрии (CD45 1.68%; CD73 99.50%; CD90 99.57%; CD105 99.43%); и подтверждена способность к дифференцировке в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях при использовании стандартных дифференцирующих сред.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Получения и характеризация скаффолдов Современное биомедицинское материаловедение определяет для себя в качестве одного из стратегически важных направлений создание материалов и структур на основе биостабильных и биорезорбируемых полимеров. Продукт деацетилирования природного полисахарида хитина – хитозан – достаточно широко используют для получения матриксов для регенеративной медицины из-за его способности к биорезорбции под действием ферментов и высокой афинности к животным клеткам. Одним из методов формирования трехмерных микроструктур, обеспечивающим высокое пространственное разрешение 3х мерных структур является метод 2х фотонной полимеризации или микростереолитографии, основанный на эффекте двухфотонного поглощения. Развитием метода 2х фотонной полимеризации, позволяющим формировать структуры с высоким пространственным разрешением значительно повысив эффективность процесса является метод микромолдинга. Целью представленной работы было разработать подходы к формированию 3х мерных структур на основе хитозановых гидрогелей обладающих высоким пространственным разрешением. Микроструктурирование производили для материалов на основе хитозана, его сополимеров и производных, полученных методом твердофазного синтеза.На первом этапе на основе синтезированного аллилхитозана были получены пленочные структуры с возможностью подкожной имплантации, подходящие для формирования плоских тканей. Прочность при разрыве пленок из модифицированного хитозана практически не меняется по сравнению с исходным хитозаном (37±2 МПа) и составляет 36-40 МПа при модуле упругости 1.8-2.1 Гпа. Сшитые под действием УФ-излучения пленки существенно теряют свои эластические свойства. Наиболее выражен этот процесс для образцов с большим содержанием ненасыщенных фрагментов в структуре хитозана, что приводит к росту числа поперечных сшивок макромолекул при облучении. На следующем этапе выполнения работы были сформированы 3х мерные пространственные матрицы. Образцы демонстрировали пик поглощения в УФ области и отсутствие пика поглощения в области 520 нм, что делает их полностью пригодными для двухфотонной полимеризации. Благодаря механизму фотоиндуцированного распада инициатора, при структурировании методом пленок, и включении люминесцирующих нетоксичных фрагментов в сформированную структуру, материал обладал интенсивной флуоресценцией, что позволило начать разработку не извазивного метода анализа скорости деградации На примере сополимеров хитозана и L,D-лактида с различной степенью полимеризации привитых цепей показано, что макромолекулярные характеристика синтезированных сополимеров влияют на проведение процесса микроструктурирования: увеличение степени замещения аминогрупп хитозана и степени полимеризации олиголактида в сополимерах благоприятствует трехмерной сшивке. Основные результаты по сополимерам хитозана, а также 3-мерным скаффолдам приведены в публикациях, ссылки на которые приведены ниже. 1. Shashkova et al, Synthesis of polylactide acrylate derivatives for the preparation of 3D structures by photo-curing, (2016) Mendeleev Communications, 26 (5), pp. 418-420. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959943616301134 2. Demina et al, Fabrication of microstructured materials based on chitosan and D,L-lactide copolymers using laser-induced microstereolithography. (2016) High Energy Chemistry, 50 (5), pp. 389-394. http://link.springer.com/article/10.1134/S0018143916050088 3. Тимашев П.С. и др, Микроструктурирование производных хитозана методами микромолдинга и двухфотонной полимеризации, (2016) ИЗВЕСТИЯ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАН, 3 (1), 129- 133. http://elibrary.ru/item.asp?id=26586435 Исследования на культурах клеток Полученные образцы полимерных матрицы из хитозана исследовали на цитотоксичноть in vitro экстракционным методом с использованием линий клеток 3Т3 (фибробластоподобные клетки) и MCF-7 (эпителиальные клетки). Метод экстракции показал, что образцы из хитозана не обладают цитотоксичностью и пригодны для использования в качестве подложки, при этом клетки в культуре культуре не повреждаются при использовании любых концентраций экстрактов. Образцы полимерных матриц из хитозана были исследованы на цитосовместимость с использованием мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МСК КМ). Используемая клеточная культура МСК КМ ранее была подготовлена на предыдущем этапе и охарактеризована с помощью проточной цитофлоуриметрии; подтверждена способность к дифференцировке в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях при использовании стандартных дифференцирующих сред. МСК КМ адгезировались и сохраняли пролиферативный потенциал при культивировании на матрицах на основе хитозана, что позволяет рассматривать такие материалы в качестве эффективных носителей клеток и предполагает их возможное использование для создания тканеинженерных конструкций. Теоретические концепции применения клеточных технологии в урологии изложены в работе П.В. Глыбочко с соавторами «Использование клеточных технологий в терапии урологических заболеваний» (Урология, 2016, 3, с.34-40) (http://elibrary.ru/item.asp?id=26379077). Исследования на животных Морфологическое изучение хитозановых имплантатов, выполненное с целью изучения биорезорбции, возможных токсических и провоспалительных свойств, а также тканевой реакции на имплантацию различных образцов хитозановых матриц позволило получить следующие результаты. 1. Биосовместимость всех образцов матриц хорошая: они не вызывают заметной воспалительной реакции, полностью отсутствуют некротические и дистрофические изменения в окружающих тканях, соединительнотканная капсула к 30м суткам становится тонкой и зрелой, что также свидетельствует о хорошей биосовместимости. Все образцы вызывают умеренную макрофагальную реакцию (как и подавляющее большинство применяемых в медицине материалов), гигантоклеточная реакция очень слабая. 2. Биорезорбция матриц к 30м суткам практически отсутствует. Имеются лишь очень небольшие фокусы, где макрофаги и гигантские клетки инвагинируют внутрь матрицы, резорбируя его материал. 3. В матриксе обнаруживаются поры, которые, в основном, заполнены соединительной тканью такого же зрелого характера, как и капсула, либо менее зрелого, но богатого сосудами. Это свидетельствует о том, что размеры пор благоприятны для прорастания через матрикс соединительнотканных клеточных и волокнистых структур и сосудов и удовлетворительной васкуляризации. 4. Использование таких микроскопических методов, как фазово-контрастная, темнопольная и поляризационная (при окраске пиросириусом) микроскопии позволяют выявить тонкую структуру не только матрикса соединительной ткани, но и матрицы из хитозана.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Среди основных требований к тканеинженерным матриксам можно выделить биосовместимость, обеспечение клеточной адгезии и пролиферации, оптимальная скорость биоразлагаемости и механические свойства нативной ткани [Cao X., Wang J., Liu M., et al. //Frontiers of Materials Science. 2015. V. 9. No.4. P.405-412.]. Несомненный интерес представляют материалы на основе коллагена – основного органического компонента межклеточного матрикса, – которые в значительной степени удовлетворяют перечисленным выше требованиям. Для ряда медицинских задач, как и для задач связанных с выполнением работ по гранту существующие биоматериалы имеют ограничения, включая недостаточную механическую прочность и эластичность, и нуждаются в улучшении этих свойств. В 2015 и 2016 году, нами были проведены работы связанные с формированием на основе полисахаридов 3х мерных матриц для задач реконструктивной урологии. В отчетный период (2017 год) был разработан новый перспективный биодеградируемый материал, сформированный методом лазерной стереолитографии для реконструктивно-пластической урологии, который потенциально может быть использован для лечения таких социально значимых заболеваний мочеполовой системы, как стриктурная болезнь уретры, врожденные аномалии мочеполовой системы (гипоспадии, эписпадии, экстрофии), что является основным направлением работ по гранту. На базе коллагеновой пленки, при формировании армирующих слоев реакционноспособного гликалида были получены анизотропные материалы, главной особенностью которых, помимо сохранения манипуляционных характеристик, была регулируемая скорость резорбции. Предложенный подход никак не влиял на манипулятивные свойства коллагеновых материалов, возможность их подшивки как подкожно, так и при моделировании дефекта уретры на кроликах. Был сформирован типоряд армированных структур для проведения экспериментов на малых лабораторных животных, установлены их механические и физико-химические свойства, совместимость с клеточными популяциями и тканевой ответ на их имплантацию. Завершились эксперименты проведением операции по заместительной терапии повреждений уретры на кроликах. Важно отметить что предложенный способ позволяет создавать материалы обладающие высоким пространственным разрешением, с одной стороны, а с другой стороны по любой заданной программе, т.е. воспроизводить любой рисунок армирующих линий. Такой персонализированный подход в дальнейшем позволит добиваться требуемых свойств функциональных свойств материалов, что позволяет рассматривать разработанный подход как перспективное направление разработки биоматериалов для замещения плоских тканей. При физико-химическом анализе сформированных материалов показано, что скорость лазерноиндуцированного формирования армирующих полос варьирует в широком диапазоне поверхностные свойства. Этот факт подтверждают исследования проведенные методом СЭМ и с использованием 3х мерного микроскопа. Изображения с 3Д-микроскопа наглядно демонстрируют хорошую воспроизводимость рельефа гибридов (благодаря подобранным параметрам лазерного структурирования). Армирование произведено равномерно по всей поверхности пленок, несмотря на имеющиеся дефекты у исходного коллагена. Показано, что благодаря тому, что лазерное излучение не подвергает деструкции коллаген, благодаря тому, что процесс лазерной полимеризации протекает без нагрева материала. При проведении испытаний на макромеханические свойства показано, что сформированный материал обладает механическими свойствами намного более высокими, нежели исходная губка, так для исходного материала модуль Юнга составляет 15 кПа, а для разных типов сформированного рисунка он составляет от 2,5 до 50 мПа. На следующем этапе были проведены эксперименты in vitro и in vivo для того, чтобы определить взаимодействие полученных матриц с клеточными популяциями и оценить тканевой ответ. Исследование биосовместимости экспериментальных образцов трехмерных структур на основе биорезорбируемых полимеров показало отсутствие токсического действия у 4-суточных вытяжек из сформированных материалов. Данные материалы поддерживают адгезию, распластывание и рост субстратзависимых клеток и по результатам in vitro тестирования могут быть признаны биосовместимыми. Показано, что нейтрофильная инфильтрация на сроки 7, 30 и 60 суток отсутствует при подкожной имплантации. Известковых отложений не значительное количество: несколько небольших фокусов на внутренней поверхности сосудистого протеза. Оценка скорости деградации материала показала, что к 60 суткам на месте имплантации остаются незначительные куски армирующих полос. При окрашивании гистологических срезов можно говорить о том, что резорбция материала прошла на 90 процентов. Таким образом, токсичность исследованных матриксов при подкожной имплантации не выявлена. При протезировании дефекта уретры гибридным коллагеновым матриксом на 14-е сутки после операции обнаруживается формирование слабых воспалительных изменений в тканях вокруг протеза выражены, что подтверждает данные о биоинертности сформированного гибридного материала, полученные в эксперименте с использованием подкожной имплантации крысам. Вокруг протеза формируется незрелая капсула, из которой в адвентицию слабо прорастают фибробласты, но в медиа проникают только немногочисленные макрофаги и нейтрофилы. Сосуды из окружающей ткани в протез не врастают. Интеграция протеза с окружающими тканями слабая. Биодеградация ткани протеза к 14 суткам слабая: ее признаки наблюдаются только в адвентиции и на торцах протеза (вблизи швов-анастомозов с резидентными участками уретры). Там происходит глыбчатый распад медиа протеза, частичная резорбция коллагеновых волокон и отложение там извести. На остальной территории протеза очагов отложений извести меньше, чем в подкожных имплантатах. На обоих краях протеза со стороны резидентных участков уретры уже к 14 суткам после операции происходит рост уроэпителия: сначала тонкого (1-2 слоя клеток), затем более зрелого, многослойного. В дальнейшем рост эпителия с обоих концов протеза распространяется значительно дальше к центру протеза. К 60-ым суткам на месте имплантации происходит полная деградация материала и формирование уроэпителиального слоя, в котором начинают появляться сосочковые структуры, свидетельствующие о процессе созревания эпителиальных структур. Через 90 дней после имплантации следы матрикса полностью отсутствуют; дефект уретры полностью замещён сформированным зрелым уроэпителиальным слоем. По результатам выполнения проекта в 2017 году было опубликовано 4 статей, из который 4 индексируются в базах данных WoS и Scopus. Помимо этого основными исполнителями проекта была написана глава в книгу, посвященная методам формирования 3х мерных структур, индексируемую в базе данных Scopus. Результаты выполнения проекта представлены на ведущих конференциях по регенеративной медицине: Topical Problems of Biophotonics (Нижний Новгород), VII Всероссийская Каргинская конференция «Полимеры-2017», III Национальный конгресс по регенеративной медицине и ряд других.