Аннотация результатов, полученных в 2015 году
1) Разработаны препаративные и селективные методы получения новых кислород-, сера-, хлор- и бромсодержащих производных 2(5Н)-фуранона, фрагмент которого входит в состав многих природных и синтетических биологически активных веществ. Из высоко реакционноспособных и коммерчески доступных 3,4-дигалоген-5-гидрокси-2(5Н)-фуранонов Ф1 и Ф2 с помощью спиртов, серосодержащих моно- и бинуклеофильных реагентов в условиях основного или кислотного катализа синтезированы и охарактеризованы серии 5-алкоксифуранонов, тиоэфиров и бис-тиоэфиров с различными SR-заместителями в 3, 4 и 5 положениях γ-лактонного цикла, а также ряд новых сернистых моно- и бициклических конденсированных гетероциклов. Найдены условия селективного окисления моно- и дитиопроизводных 2(5Н)-фуранона до соответствующих сульфонов и сульфоксидов. 2) Скрининг синтезированных фуранонов позволил отобрать соединения, максимально подавляющие рост и образование биопленок клетками S. aureus, S. epidermidis и B. subtilis 168. Максимальную эффективность продемонстрировал фуранон Ф105, подавляющий образование биопленок клетками золотистого стафилококка в концентрации 1 мкг/мл при цитотоксичности, сравнимой с другими соединениями (СС50 в 8 и 48 раз превышает МБПК для фибробластов кожи и клеток линии MCF7). Ф105 представляет интеерс как объект интеллектуальной собственности. 3) Оптимизированы условия для получения полимикробных биоплёнок, состоящих из а) S. aureus и P. Aeruginosa; б) M. luteus и B. subtilis. Наличие кокковых и палочковидных форм для упрощения задачи идентификации бактерий в смешанной пленке по форме клеток и возможности идентифицировать мертвые и жизнеспособные клетки в ее составе. Значения МБПК фуранона Ф105 против составляющих смешанную биопленку бактерий отличаются в несколько раз, что позволяет подавлять образование биопленки только одним видом бактерии в составе полимикробной биопленки. 4) Нами продемонстрировано, что в составе полимикробных биопленок повышается жизнеспособность бактерий. При совместном культивировании S. aureus и P. aeruginosa в смешанной биопленке не идентифицировались жизнеспособные клетки псевдомонады. В присутствии Ф105 уже в концентрации 1 мкг/мл не образовывалось биопленки стафилококка в монокультуре, и значительно возрастало количество нежизнеспособных клеток. P. aeruginosa еще образовывала биопленку при концентрации 10 мкг/мл. Однако, в составе полимикробной биопленки, включающей S. aureus и P. аeruginosa, при концентрации Ф105 до 10 мкг/мл образовывалась биопленка, в составе которой бактерии обоих штаммов оставались жизнеспособными, и идентифицировалось большое количество жизнеспособной псевдомонады. Такие же результаты были получены для биопленок, образованных бациллами и микрококком. Так, в присутствии F105 большинство клеток микрококка оказывалось нежизнеспособным, тогда как в составе смешанной биопленки клетки выживали, а также не оказывали антагонистического действия против клеток бацилл. Таким образом, нами показана смена взаимоотношений бактерий в составе полимикробной биопленки в зависимости от присутствия стрессорного фактора. Так, в отсутсвтии фуранона, в моделях смешанных биопленок S. aureus/P. aeruginosa и B. subtilis/M. luteus стафилококк и микрококк подавляли присутствие P. aeruginosa и B. subtilis, соответственно. Напротив, присутствие фуранона F105 приводило к гибели значительной части клеток S. aureus и M. luteus в монокультуре, однако клетки были способны выживать в полимикробной пленке и переставали оказывать антагонистический эффект на другие бактерии. Следовательно, при разработке лекарственных средств необходимо учитывать подобные комменсальные взаимодействия бактерий. 5) Нами показано, что использование фуранонов приводит к повышению чувствительности бактерий к антибиотикам, по всей видимости, благодаря повышению доступности бактериальных клеток для антимикробных соединений. Если в контрольной пробе внесение хлорамфеникола приводило к гибели лишь незначительной части адгезированных клеток, при внесении фураннов наблюдалось значительное снижение количества жизнеспособных клеток, вероятно, благодаря разрушению биопленки и повышению доступности клеток бактерий для антибиотика. Таким образом, использование антибиотиков в сочетании с фуранонами представляет интерес для борьбы с бактериальными биопленками. 6) Нами показано, что протеолитические ферменты способны разрушать матрикс биопленки, вероятно, благодаря гидролизу ее белкового компонента. Наиболее эффективными оказались протеиназы растительного происхождения - фицин и папаин. При этом ни одно из тестируемых веществ не демонстрировало мутагенного и цитотоксичного действия. Предварительные исследования влияния фицина на ранозаживление беспородных белых крысах показали, что очищение раны при применении фицина происходит достоверно быстрее, чем в контрольной группе, не наблюдается воспалительной реакции и загноения раны. Предварительные результаты цитологических исследований подтвердили эффективность использования фицина. Таким образом, фицин представляет интерес в качестве ранозаживляющего препарата, способствующего очищению раны и быстрому ее заживлению. 7) Кроме коммерческих протеолитических ферментов, нами показана возможность подавления образования биопленки клетками стафилококков протеиназой HtrA из B.subtilis. Ген фермента клонирован на экспрессионном векторе и проведение очистки с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA сефарозе с использованием имидазола в качестве элюирующего агента позволило получить белок HtrA c электрофоретической гомогенностью в количестве 10 мг. В присутствии белка HtrA-His6 уровень роста биопленок Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis оказался значительно ниже по сравнению с контролем .

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Разработан подход к синтезу серосодержащих производных 5-гидрокси-3-пирролин-2-она разного структурного типа, основанный на реакциях аммонолиза и аминирования соответствующих 5-метокси-2(5Н)-фуранонов. Все пирролиноны П1–П39 выделены в индивидуальном виде, их строение доказано комплексом физических методов (спектроскопия ИК, ЯМР 1Н, 13С), состав подтвержден данными элементного анализа или методом масс-спектрометрии высокого разрешения. Молекулярная и кристаллическая структура большого числа новых тиопроизводных пирролинона детально охарактеризована методом рентгеноструктурного анализа. В результате скрининга отобраны 2 соединения П21 и П22 с высокой активностью против клеток S. aureus, S. epidermidis и B. subtilis 168 (МБПК 2.5 и МПК 5 мкг/мл для S. aureus). Вещества не демонстрировали мутагенного действия в тесте Эймса в концентрациях до 4МБПК и не вызывали повышения SOS-ответа в UMU-тесте, что говорит об отсутствии их генотокичности. С доугой стороны оба соединения токсичны для фибробластов кожи человека (СС50 =1 мкг/мл) и требуется оптимизация структуры для снижения токсичности. Показано повышение эффективности антибиотиков за счет присутствия фуранона Ф105 против клеток, погруженных в матрикс биопленки. Клетки в составе биопленки, выращенные в присутствии Ф105, становятся более восприимчивы к биоциду бензfлкония хлориду, ампициллину и канамицину. Следовательно, применение Ф105 может значительно повысить эффективность антибиотикотерапии стафилококковых инфекций. Исследования синергизма Ф105 с антибиотиками на клетках S. aureus ATCC 29213 методом шахматной доски выявил выраженный синергизм для Ф105 и гентамицина, с FICI = 0.33±0.16. В случае с такими антибиотиками, как даптомицин, рифампицин и линезолид для Ф105 наблюдался индифферентный эффект. Эффективная концентрация (EC50) Ф105, снижающая значение МПК антибиотика вдвое гентамицина составила 0.7 мг/л. Для даптомицина, рифампицина и линезолида EC50 Ф105 были от 7.5 до 9.5 мг/л. Среди канамицина, ампициллина, эритромицина, ванкомицина, ципрофлоксацина и тетрациклина синергизм был обнаружен с канамицином со значением EC50=1.3 мг/л, при этом ванкомицин демонстрировал наихудший результат. Другие антибактериальные препараты показали индифферентное значение. Таким образом, только аминогликозиды имеют синергетический эффект с Ф105. Принимая во внимание применение гентамицина в антисептических мазях для кожных ран, где основная масса микрофлоры представлена стафилококками, Ф105 (или его производные с меньшей токсичностью) имеет потенциал включения в состав этих лекарственных средств. Синтезировано 22 аналога фуранона Ф105, из них Ф107, Ф109, Ф111, Ф113, Ф119, Ф122 проявляли высокую активность в отношении грамположительных бактерий (МПК 1-4 мкг/мл, МБПК 4-16 мкг/мл), максимально подавляя рост клеток стафилококков. На среде Muller Hinton (МН) значения МПК для S.aureus составляли 8-16 мкг/мл. МБК составляла 16-32 мкг/мл. Таким образом, можно судить о бактерицидном действии производных фуранонов, так как значение МБК не превышает значения МПК более чем в 4 раза. Все производные Ф105 имели синергизм с гентамицином, значение FICImin составляют менее 0.4. При этом вещества Ф122 и Ф123 демонстрировали противоположный эффект в зависимости от среды культивирования. Таким образом, соединения Ф107, Ф109, Ф111 и Ф119 представляют интерес для дальнейших исследований в качестве антибактериальных средств для борьбы со стафилококковой инфекций. Ф105 не демонстрировал мутагенности ни в тесте Эймса с и без метаболической активации (штаммы S.typhimurium TA98, TA100, TA102), ни в SOS хромотесте. Аналоги Ф105 также не продемонстрировали мутагенности. При этом цитотоксичность всех аналогов Ф105 была примерно на одном уровне, что свидетельствует о том, что внесенные модификации не снижают токсичность вещества. Однако многие биоциды, например, мирамистин, также имеет высокую цитотоксичность, но может использоваться для местного применения. Поэтому планируются дальнейшие исследования вещества в сравнении с известными биоцидами. Показано, что в клетках Bacillus subtilis и Staphylococcus aureus значительно изменяется протеом при их культивировании в присутствии Ф105. У бацилл количество аминоацил-тРНК-синтетаз, рибозо-фосфат пирофосфокиназы и трансальдолазы увеличивалось в присутствии фуранона Ф105. У Staphylococcus aureus содержание значительно большего количества белков в клетках изменяется в присутствии фуранона. Большинство идентифицированных белков является ферментами, участвующими в жизненно важных процессах клетки и относятся к генам домашнего хозяйства. Однако не представляется возможным выделить их в четко выраженную группу. Это в основном ферменты, преимущественно участвующие в синтетических процессах. Вероятно, фуранон Ф105 не обладает высокой специфичностью, к какой либо группе белков, однако воздействует на белки, обладающие ферментативной активностью и, скорее всего, обладает общетоксическим действием на клетки грам-положительных бактерий. Показано что фуранон Ф105 и его аналоги не подавляют экспрессию генов, участвующих в формировании биопленки у бацилл (yqxM и epsА), свидетельствуя о том, что данные вещества оказывают токсическое действие на клетку, тем самым подавляя метаболизм и образование биопленки. Проведена оценка влияния фуранонов на чувство кворума кишечной палочки с использованием репортерного штамма E. coli MG1655 pVFR1. Проведенный скрининг позволил выявить соединения F2, F3, F4, F5, F7, F8 F9, F44, F49, F57, F78, F81, F82, F87, снижающие активность кворум-зависимых процессов клеток в 2 раза и более. Оптимизированы методы иммобилизации фицина на высоко- и среднемолекулярном хитозане, получен иммобилизованный фермент и показано действие фицина (растворимого и иммобилизованного) на бактериальные биопленки. Растворимый фицин разрушал биопленки всех тестируемых штаммов уже в концентрации 10 мкг/мл за исключением P.aeruginosa. Наиболее эффективно разрушались биопленки бактерий S.aureus и S.epidermidis. Окрашивание нативных и обработанных фицином биопленок стафилококка при помощи красителя конго красным показало разрушение что белкового компонента биопленки. При этом растворимый фицин терял половину активности в течение 24 часов, что свидетельствует об его высокой стабильности в культуральной жидкости. Анализ структуры биопленки с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) показал, что обработка фицином снижает толщину биопленки, при этом не оказывая антимикробного действия. Атомно силовая микроскопия подтвердила, что в результате обработки фицином биопленки полностью разрушаются и остаются единичные скопления клеток. При этом происходит значительное снижение силы адгезии клеток. Вероятно, это может быть связано с разрушением белков адгезинов. Также установлено, что антимикробная обработка биопленок стафилококков ципрофлоксацином вместе с фицином значительно повышает эффективность антибиотика. Проанализирована ранозаживляющая активность фицина на модели повреждения кожи крыс. Результаты цитологических исследований подтвердили эффективность использования фицина. Так, в контрольной группе область раны составила 15.3±1.6 мм2 (57% от исходных значений), с химотрипсином - 11.4±2.56 мм2 (54%от исходных значений), в группе с фицином – область раны составила 9.0± 2.8 мм2, (56% от исходных значений). Средний показатель анизотропии коллагеновых волокон для здорового участка кожи составлял 0.80-0.94, для рубца обработанного химотрипсином – 0.47(±0.05), обработанного фицином 0.55(±0.04), иммобилизованным фицином – 0.85. Значения анизотропии для растворимого фицина были выше, чем у химотрипсина, что свидетельствует о более выраженном ранозаживляющем действии этого фермента. Минимальная разница в показателях наблюдается для ран, обработанных иммобилизованным фицином, что говорит о его достоверном преимуществе в терапевтическом эффекте при оптимизации заживления ран. Также проведена влияния белка HtrA на ранозаживление проводили на моделях повреждения кожи у крыс. При обработке раствором белка HtrA ранозаживление проходило медленнее, чем в случае химотрипсина, но на 4 сутки была заметна разница с ранами, обработанными только диализным буфером. Также в контрольных ранах не наблюдалось снижения количества бактерий с течением времени. На ранах, которые обрабатывались растворами протеазы HtrA и химотрипсина, на 8 сутки наблюдалось резкое уменьшение количества бактерий примерно в 5 раз. Также наблюдалось резкое снижение бактерий Staphylococcus sp. Следовательно, обработка протеолитическими ферментами приводит к снижению общей микрофлоры обрабатываемых поверхностей. Протеаза HtrА оказывает менее выраженный ранозаживляющий эффект по сравнению с химотрипсином. Тем не менее, данный белок может представлять интерес в качестве потенциального ранозаживляющего препарата. Исследованы возможности моделирования комменсальных взаимодействий бактерий S.aureus и P.aeruginosa в смешанной биопленке. Ф105 при концентрации 2.5-5 мкг/мл подавляет образование биопленок стафилококка, не оказывая влияния на псевдомонаду. При совместном культивировании S.aureus и P.aeruginosa в смешанной биопленке практически все бактерии оставались жизнеспособными. В присутствии Ф105 наблюдалось образование скоплений живых клеток стафилококка в составе биопленки. Таким образом, внесение фуранона Ф105 способствовало подавлению образования мономикробных биопленок S.aureus и гибели значительной части клеток. Однако клетки были способны интегрироваться в матрикс, продуцируемый P.aeruginosa и выживать в его составе.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Синтезировано 4 новых сульфонильных производных 3-пирролин-2-она, из них два вещества П40 и П41 показали антибактериальную активность. Для них не выявлено мутагенного воздействия в тесте Эймса и СОС-хромотесте, однако показана высокая цитооксичность. Методом шахматной доски был установлен индифферентный эффект с FICI = 0.5-1 пирролинонов П21, П22, П40 и П41 с антибиотиками (гентамицин, тетрациклин, ванкомицин и ципрофлоксацин). Тем не менее П22, П40 и П41 в концентрациях 0.1-1 мкг/мл снижали МПК данных антибиотиков в два раза, что позволяет рассматривать возможность их использования для повышения эффективности антибиотиков. Показано что присутствие в среде фуранона Ф105, несущего сульфонильный и ментильный фармакофоры, повышает эффективность большинства антибиотиков (Гентамицин, Амикацин, Ципрофлоксацин, Ванкомицин, Цефтриаксон, Тетрациклин, Ампициллин) в отношении клеток S.aureus в составе биопленки за счет подавления ее образования и повышения доступности клеток для антибиотиков. Этот факт позволяет предложить Ф105 для повышения эффективности антибиотикотерапии стафилококковых инфекций. Однако, ввиду высокой токсичности Ф105 может быть использовано лишь для наружного использования, например, для обработки кожных ран. Исследование антибактериальной активности Ф105 in vivo на модели инфицированного повреждения кожи у крыс показало, что при комбинации Ф105 с гентамицином проиходит эффективная деконтаминация: полная стерилизация раны наблюдалась уже на 2 сутки после начала терапии. При использовании только гентамицина гибель всех бактериальных клеток наступала на четвертые сутки, а в случае с фураноном - на шестые. Полученные результаты демонстрируют эффективность комбинированного применения двух соединений, при котором фуранон Ф105 показывает усиливающий эффект для гентамицина, широко используемого антибиотика при поверхностных инфекциях. Кроме того Ф105 проявлял активность против Streptococcus mutans, основной микрофлоры зубных имплантатов. Распыление спиртового раствора Ф105 на имплантаты позволило получить кристаллы фуранона на их поверхности. В случае покрытия имплантата фураноном происходило подавление развития микрофлоры в питательной среде in vitro, вероятно, за счет постепенной диффузии вещества. На поверхности имплантов микробной биопленки также не обнаруживалось. Однако Ф105 имеет высокую цитотоксичность для клеток, и данное соединение напрямую не может быть использовано для профилактики биообрастания имплантатов в процессе их остеоинтеграции. Показано, что применение фицина и папаина повышает эффективность антибиотиков в отношении клеток стафилококков, погруженных в матрикс биопленки. При этом на модели инфицированного повреждения кожи у крыс показано, что на ранах, обрабатываемых растворами фицина, антибиотика (ципрофлоксацин или гентамицин) и фицина с антибиотиком уже на 1 сутки наблюдается резкое (на 2 порядка) уменьшение количества бактерий в отличие от контроля. При этом наиболее быстрое заживление ран наблюдалось при обработке чистым фицином. Следовательно, фицин оказывает ранозаживляющее действие, что вместе с эффектом микробной деконтаминации представляет интерес для разработки ранозаживляющей терапии с применением этого фермента. Комбинирование антибиотикотерапии с обработкой фицином может позволить снизить требуемые концентрации антибиотиков, и повысить их эффективность. Внеклеточная леваназа SacС из B.subtilis в концентрации 1000 мкг/мл разрушала биопленки P. aeruginosa до 50%. В случае внесения целлюлазы Aspergillus niger в концентрации 5000 мкг/мл, также наблюдалось разрушение биопленки на 50%. Таким образом, эти ферменты могут служить перспективными агентами при разрушении биопленок P. aeruginosa. Разработана программа BiofilmAnalyser, позволяющая оценивать соотношение дифференциально окрашенных субпопуляций клеток на микрофотографиях. Программа выложена в открытый доступ (http://kpfu.ru/prioritetnye-napravleniya/laboratorii/sae-39translyacionnaya-7p-medicina39/nil-39molekulyarnaya-genetika-mikroorganizmov39/programmnoe-obespechenie/biofilmanalyzer). Получены стабильные смешанные биопленки S.aureus и P.aeruginosa, S.aureus и K.pneumoniae, S.aureus и E.coli, S.aureus и E.aerogenes, S.epidermidis и E.coli, S.epidermidis и E.aerogenes, S.epidermidis и K.pneumoniae. В составе модельных биопленок на вторые сутки ко-культивирования обнаруживались жизнеспособные клетки обоих видов и представляется интересным продолжить исследования их комменсализма в условиях антибиотикотерапии. Биопленки бацилл с кокковыми бактериями (B.subtilis и S.aureus, B.subtilis и M.luteus) оказались неустойчивы и не удалось получить стабильных консорциумов, вероятно из-за антагонистических отношений бактерий: все бациллярные клетки стабильно идентифицировались как нежизнеспособные. L.plantarum и K.pneumoniae образовывали стабильный консорциум, молочнокислые бактерии не проявляли антагонизма в отношении клебсиеллы. Напротив, обнаружен выраженный антагонизм лактобацилл с S.aureus и E.coli, так как в смешанной культуре не было идентифицировано жизнеспособных клеток S.aureus и E.coli ни в планктонной форме, ни в составе биопленки. На модели полимикробной биопленки S. aureus и P. aeruginosa показана способность клеток стафилококка встраиваться в биопленку псевдомонады, образовывая небольшие скопления, погруженные в матрикс, и выживать в условиях терапии. Так, при воздействии антибиотиков активных только в отношении S. aureus (Ванкомицин, Тетрациклин, Ампициллин и Цефтриаксон), в полимикробном сообществе стафилококк переходил в нижние слои биопленки, и не терял жизнеспособность даже при высоких дозах антибиотиков. При этом количество жизнеспособных клеток P. aeruginosa в полимикробной биопленке снижалось на 2 порядка при максимальной концентрации антибиотика по сравнению с монокультурой, вероятно, благодаря антагонизму между данными бактериями. Интересно, что ципрофлоксацин, амикацин и гентамицин, которые активны против обоих S. aureus и P. aeruginosa при воздействии на полимикробную биопленку вызывали полную гибель клеток P. aeruginosa в концентрациях в 4 раза ниже, чем в монокультуре. Эти антибиотики в относительно высоких концентрациях вызывали полную гибель также золотистого стафилококка в составе полимикробной биопленки, тогда как в мономикробной биопленке бактерии были не чувствительны к действию данных антибактериальных веществ. В совокупности полученные данные свидетельствуют, что благодаря антагонистическим взаимодействиям между S. aureus и P. aeruginosa в смешанной биопленке повышается антимикробная эффективность антибиотиков, активных против обоих видов. С другой стороны, в условиях терапии веществами, неээфективными против P. aeruginosa, S. aureus интегрируется в биопленку P. aeruginosa и образовывает в ней клеточные конгломераты, повышая тем самым устойчивость к антимикробным веществам. Данные особенности взаимоотношения бактерий должны быть учтены при разработке новых антимикробных препаратов и подходов к антибактериальной терапии. Исследовано влияние железа на рост и способность образовывать биопленки у 10 штаммов лактобацилл, выделенных нами из кисломолочных продуктов. Присутствие в среде ионов Fe3+ в концентрациях 10, 100 и 1000 мкМ не оказывало существенного влияния на рост исследованных штаммов. Бактерии L. plantarum 8PA3, L. plantarum Ga, L. rhamnosus BB, L. fermentum 7-1 и L. fermentum 3-3 эффективно связывали ионы Fe3+ в растворе. После инкубации данных микроорганизмов в 1 мМ растворе FeCl3 в течение 30 мин убыль концентрации железа составила от 38 до 54%. Все исследованные лактобациллы образовывали биопленки независимо от присутствия ионов железа в среде, в отличие от патогенных бактерий, например, P.aeruginosa, V.cholerae и E.coli. Среди исследованных лактобацилл свойство формировать биопленки наиболее хорошо было выражено у L. rhamnosus BB. По данным литературы, среди других лактобацилл представители этого вида характеризуются высокой способностью образовывать биопленки, при этом внесение в среду ионов Fe3+ значительно увеличивало образование биопленок у L. rhamnosus BB, но не влияло на рост бактерий. Было исследовано влияние кадмия и свинца на образование биопленок у лактобацилл в концентрациях 5, 10 и 50 мг/л. В нетоксичных для лактобацилл концентрациях 5 и 10 мг/л Cd был способен снижать образование биопленок у некоторых лактобацилл (L. brevis 20054 и L. rhamnosus I2L), но поскольку связывание Cd у лактобацилл происходит по механизму внутриклеточной аккумуляции, а не сорбции на поверхности клеток и матриксом биопленки, данное снижение биопленкообразования не будет снижать детоксикационное действие лактобацилл в отношении Cd. Также показано, что при росте в виде биопленок лактобациллы не приобретают повышенную устойчивость к токсическому действию тяжелых металлов.