Аннотация результатов, полученных в 2014 году
-

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
http://www.ibch.ru/press/news/science/1481 Белки биокаталитических систем. Созданы генетические конструкции, обеспечивающие эффективное представление функционально-активных биокатализаторов с принципиально разной активностью и специфичностью на поверхности дрожжевых клеток. Получены генетические конструкции содержащие под контролем промотора гена AOX1 последовательности легкой цепи энтеропептидазы (EK), бутирилхолинэстеразы (BChE) и ДНКазы I (DNаse) человека объединенные с последовательностью SAG1 субъединицы 1 α-агглютинина (Aga1), позволяющей заякоривать рекомбинантные ферменты на поверхности клеточной стенки. Определено оптимальное сочетание генетических элементов, позволяющее эффективно экспонировать молекулы функционально-активных биокатализаторов, таких как ферменты и абзимы на поверхность дрожжевых клеток. Для высокоэффективного скрининга биокатализаторов были разработаны две принципиально различные платформы для получения искусственных биокатализаторов de novo. Подобраны условия, позволяющие доcтигать 70% выживаемости клеток после отбора. Создана библиотека Fab-фрагментов, презентированных на поверхности клеток дрожжей. Собрана биомасса червя F. heliota. Из биомассы F. heliota в получены в индивидуальном (чистом) состоянии ряд структурных аналогов люциферина – его метаболических предшественников. Методами ЯМР, масс-спектроскопии и встречного синтеза установлены структуры аналогов люциферина (его метаболических предшественников). Определены функциональные группы люциферина, ответственные за восстановление молекулы кислорода, а также за излучение квантов света (light emitter). Установлено, что окислению кислородом подвергается карбоксильная группа остатка лизина, а также альфа-СН лизина, в то время как за излучение кванта света отвечает ароматический остаток CompX. Проведен синтез люциферина в количестве 1 грамм. Проведено секвенирование транскриптома F. heliota методом высокопроизводительного секвенирования нового поколения (NGS). Из биомассы F. heliota получен очищенный препарат люциферазы для секвенирования поЭдману (N-концевое секвенирование) и масс-спектрометрического секвенирования. С помощью масс-спектрометрического секвенирования установлены аминокислотные последовательности белков - -кандидатов новой люциферазы F. heliota. Также, с использованием полученных данных секвенирования транскриптома установлены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих данные белки. С использованием синтетического люциферина изучен механизм его окисления кислородом и наработан оксилюциферин, структура которого была установлена методами ЯМР и МС как (Z)-4-(5-(3-(5-(карбоксиформамидо)пентанамидо)-2-метокси-3-оксопроп-1-ен-1-ил)-2-гидроксибензамидо)бутаноая кислота. Получена форма Ес-Lon-протеазы, утратившая инсерционный HI(CC)-домен (Ес-Lon-дельта(124-304)). Установлен вклад НI(СС)-домена в функционирование АТР-азного и пептидазного центров Ес-Lon-протеазы, доказана необходимость НI(СС)-домена для реализации протеолитической активности фермента и поддержания его конформационной стабильности. Проведен сравнительный анализ первичных последовательностей бактериальных IgA протеаз из Neisseria meningitidis серогрупп А, В, С и Е, рассчитана информационная структура IgA1 протеазы, определены консервативные последовательности, содержащие В и Т эпитопы. На основе этих расчетов предложены три варианта структур иммуноактивных фрагментов белка. Для этих структур разработаны новые конструкции рекомбинантной плазмидной ДНК и на их основе созданы штаммы, продуцирующие фрагменты рекомбинантной IgA1 протеазы, содержащие потенциально активные участки IgA1 протьеазы На основании анализа информационной структуры PSP предложены три варианта укороченных белков PSP (Glu109 – Glu677, His279 – Glu677 и Met1 – Ser108 ---- His279 – Glu677). Получен укороченный вариант PSP (101-677) экспрессией соответствующего гена в E. coli (PSPΔ100) и ограниченным протеолизом полноразмерного рекомбинантного фермента His6-PSP с помощью химотрипсина. Последний образец, сохраняя активность в отношении низкомолекулярного субстрата PSP – BAPNA, был активен также в отношении белкового субстрата – азоказеина в отличие от исходного PSP. Получены две мутантные формы протеазы ВИЧ (ПВ): ПВ-L10I/L31I/M46I/I54V/L63I/V82A/I84V/L90M и ПВ- L10I/M36I/S37D/M46I/R57K/L63P/A71V/G73S/I84V/L90M/I93L, устойчивые к ингибиторам I-го поколения – индинавиру и саквинавиру, соответственно. Показана возможность осуществления нового каскадного биосинтеза биологически важных нуклеотидов, при использовании трехстадийного каскадного превращения D-пентоз в пуриновые нуклеотиды - превращения в одном реакционном объеме (1) D-пентоз в 5-фосфаты под действием рибокиназы, из которых затем синтезируются (2) 5-фосфо-α-D-пентофуранозо-1-пирофосфаты под действием фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (PRPP-cинтетазы), (3) конденсация последних с гетероциклическими пуриновыми основаниям в присутствии аденинфосфорибозилтрансферазы (APR-трансферазы) дает желаемые нуклеотиды. Осуществлено клонирование синтетического гена рибокиназы из термофильного микроорганизма Thermus species 2.9, двух разных генов PRPP-cинтетазы из Thermus thermophilus и APR-трансферазы Thermus thermophilus HB27 в экспрессионных векторах, получены высокопродуктивные штаммы-продуценты E. coli, продуцирующие указанные выше ферменты в растворимой форме. Разработаны методы выделения рибокиназы, PRPP-cинтетазы и APR-трансферазы. Наработаны партии препаратов ферментов высокой степени чистоты и концентрации более 10 мг/мл для кристаллизации и кинетических исследований. Подобраны начальные условия кристаллизации генно-инженерных ферментов: рибокиназы, PRPP-cинтетазы и APR-трансферазы, данные условия адаптированы и оптимизированы применительно к методу встречной диффузии в капиллярах для последующего проведения рентгеноструктурного анализа. Проведен комплекс работ по определения субстратной специфичности и оптимальных условий максимально эффективной работы всех ферментов. Рецепторные и сигнальные белки. Анализ структуры и функции. Для изучения молекулярных основ проведения биохимического сигнала через мембрану клетки осуществлен анализ имеющихся в литературе данных в области структурно-функциональных исследований и молекулярных механизмов биологической активности РТК, а также аналогичных мембранных рецепторов I-типа. Выявлены предварительные данные о взаимосвязи структуры и функции этих белков, а также их роли в возникновении и развитии социально-значимых заболеваний человека. Проведена сравнительная оценка возможных направлений исследования молекулярных механизмов функционирования РТК, с выявлением наиболее перспективных представителей рецепторов из различных семейств. В результате для структурных исследований методом гетероядерной спектроскопии ЯМР в мембраноподобных системах был сделан выбор 6-ти минимальных по размерам РТК, интересных с медицинской точки зрения. Разработаны высокоэффективные системы бактериальной и бесклеточной экспрессии и очистки изотопно-меченых связок трансмембранных доменов с функционально важными цитоплазматическими примембранными участками рецепторов. Были разработаны методики продукции белка MSP различного размера для сборки липид-белковых нанодисков (ЛБН) с высокими выходами целевого белка, а также протоколы сборки ЛБН, содержащих связки доменов РТК и аналогичных белков. Образцы ЛБН различного размера и липидного состава, содержащие связку трансмембранного и цитоплазматического домена модельных рецепторов, были охарактеризованы методами ЯМР- спектроскопии, фотон-корреляционной спектроскопии и электронной микроскопии. Исследовано сохранение нативной структуры цитоплазматического домена белка в различных мембраноподобных средах. Полученные результаты помогут в дальнейшем выявить функциональные конформационные изменения в РТК при активации сигнального лиганд- рецепторного мембранного комплекса в мембранах. Пептидомика. Пептидные факторы системы врожденного иммунитета. В ходе выполнения работ в рамках проекта была разработана эффективная технология экспрессии в прокариотической системе и очистки рекомбинантных антимикробных пептидов (аналогов тахиплезина и пептида Th, а также тритрптицина). С целью увеличения выхода гибридных белков, включающих целевые пептиды, и упрощения процедуры очистки были проведены эксперименты по оптимизации процесса, что позволило достичь относительно высокого уровня экспрессии (30% от суммарного белка клетки) и исключить стадию повторной очистки с помощью металлохелатной хроматографии. В результате были получены семь рекомбинантных пептидов, выход которых составил от 7 до 13 мг с литра культуры. Структура пептидного антибиотика грамицидина А была исследована в липосомах фосфатидилхолина, модифицированного неионным детергентом Тритоном Х-100. Соотношение детергента и липида, при котором происходит насыщение липидной мембраны детергентом, было определено методом динамического лазерного светорассеяния. Равновесное конформационное состояние грамицидина А в фосфолипидных липосомах было исследовано методом КД-спектроскопии. Показано, что структура этого канал-образующего антибиотика кардинально изменяется при переходе к более жидкой мембране, модифицированной Тритоном Х-100. В ходе выполнения работ в рамках проекта были обнаружены и выделены новые липид-транспортирующие белки (LTP) укропа и гороха. Были определены полные аминокислотные последовательности данных белков и структуры полноразмерных кДНК, кодирующих их белки-предшественники. С помощью флуоресцентной спектроскопии для LTP укропа и гороха была выявлена специфичность связывания жирных кислот, лизофосфолипидов и жасмоновой кислоты - растительного гормона роста и развития растений. Для экспрессии в Е. coli белков-аллергенов пыльцы полыни Art v 3 и фундука Cor a 8, принадлежащих к классу растительных LTP, были получены генно-инженерные конструкции и штаммы-продуценты, позволяющие экспрессировать целевые белки с выходом не менее 3 мг/л культуры. В рамках проекта были выполнены исследования по оптимизации протокола выделения пептидов из плазмы/сыворотки крови человека. Было предложено осуществлять выделение, используя крупнопористый слабый катионообменный сорбент типа CM Toyopearl 650 S и CM Bio-gel A. Разработан способ стабилизации пептидного пула в 0,1% БСА перед масс-спектрометрическим анализом. Исследована возможность повышения эффективности идентификации пептидов за счет оптимизации условий хроматографического разделения пептидных смесей. Показано, что для повышения эффективности хромато-масс-спектрометрического анализа пептидных фракций, выделенных из плазмы/сыворотки крови, следует использовать 120-минутный градиент буфера В от 5 до 40%. С использованием разработанной методологии удалось идентифицировать около 3000 уникальных пептидов, выделенных из 100 мкл сыворотки крови. В рамках изучения пептидома растений проанализированы пептидные пулы клеток мха Physcomitrella patens и выявлено свыше 28000 эндогенных пептидов – продуктов деградации функциональных белков. Предсказана потенциальная антимикробная активность некоторых фрагментов, образующихся в стрессовых условиях. Для того, чтобы идентифицировать гены, кодирующие пептиды, использовали биоинформатический анализ и выявили около 220 тысяч коротких рамок считывания. С помощью ПЦР в реальном времени оценили изменение уровня транскрипции некоторых генов, предположительно кодирующих пептиды, при разных стрессовых воздействиях. Обнаружено, что у отдельных генов уровень транскрипции повышается на порядок в условиях абиотического и биотического стресса. Мастер-регуляторные белки и гены развития и канцерогенеза на примере поджелудочной железы. Задачей данного направления является выявление мастер регуляторных генов и кодируемых ими белков, ответственных за включение морфогенеза поджелудочной железы в процессе эмбрионального развития человека, исследование их экспрессии в норме и дисрегуляции в процессе канцерогенеза, а также исследование возможностей использования мастер генов в качестве мишеней для диагностики и терапии рака поджелудочной железы, в том числе PDAC. Мы выдвигаем гипотезу, что ключевые для эмбрионального развития гены – мастер гены и белки являются также ключевыми для инициации и эволюции раковой опухоли, включая метастазирование. В предлагаемом Научном проекте мы основываемся на литературных данных и собственных результатах, полученных нами в предыдущих исследованиях, которые свидетельствуют о том, что гены и сигнальные пути, ответственные за включение морфогенетических процессов в ходе эмбрионального развития, при канцерогенезе выключаются (и наоборот). Итогом проекта будет расширение фундаментальных знаний о механизмах развития и раковой трансформации поджелудочной железы и выявление потенциальных мишеней терапевтического воздействия. В отчетный период для решения этой задачи были систематизированы данные по белкам и генам, вовлеченным в развитие и морфогенез поджелудочной железы человека и животных. Составлен соответствующий каталог белков и генов. Систематизированы данные по белкам и генам, активно вовлеченным в возникновение и развитие рака поджелудочной железы, а также в инициацию метастатического процесса и диссеминированного роста. Составлены соответствующие каталоги белков и генов. Проведено сопоставление этих двух массивов данных и выявлены потенциальные гены-кандидаты, вызывающие эмбриоподобное состояние раковых клеток. Проанализированы и обобщены данные по генам-регуляторам и белкам-маркерам различных патологических процессов клеточной трансдифференцировки, в первую очередь, включающих транскрипционные факторы и регуляторы ацинарно-протоковой трансдифференцировки и эпителиально-мезенхимального перехода в клетках поджелудочной железы. Было проведено биоинформатическое определение критических транскрипционные систем, вовлеченные в процессы опухолевой прогрессии, происходящие как в первичных опухолях, так и в метастазах на примере рака поджелудочной железы. Были проанализированы транскриптомы ассоциированных мезенхимальных (стромальных) клеток поджелудочной железы в опухолевых и нормальных тканях. Был проведен анализ собранных и каталогизированных данных о белках и генах поджелудочной железы, вовлеченных в возникновение, развитие и метастазирование рака, эмбриогенез, процессы трансдифференцировки и эпителиально-мезенхимального перехода, проведена идентификация потенциальных мастер генов. Созданы коллекции эмбриональных тканей человека на различных стадиях формирования поджелудочной железы. Собраны образцы аутопсийного материала ткани нормальной поджелудочной железы и коллекция хирургических образцов поджелудочной железы при хроническом панкреатите. Созданы коллекции хирургических образцов рака поджелудочной железы. Из собранных образцов тканей приготовлены панели РНК, кДНК, а также выделена геномная ДНК для проведения эпигенетического анализа. Начат экспериментальный анализ содержания продуктов экспрессии потенциальных мастер генов в опухолевых и эмбриональных тканях поджелудочной железы с использованием созданных панелей кДНК. Опубликовано 9 обзоров, обобщающих современные представления о механизмах молекулярного эмбриогенеза и канцерогенеза, их взаимосвязи, и роли мастер генов и регуляторов транскрипции в этих процессах. Таким образом, проект развивается по намеченному плану, и все задачи, намеченные на отчетный период, выполнены. Белок и гликан-опосредованные клеточные взаимодействия в динамических условиях. 1. Осуществлен синтез гликанов и гликоконъюгатов, необходимых для выполнения намеченных биологических исследований: пробы для вирусологических исследований (в том числе для иммобилизации вируса на кантилевере АСМ), гликолипиды для проведения SPR-экспериментов и для исследования формирования глико- паттернов в биологической мембране. Разработана общая методология синтеза гликолипидов с заранее заданными свойствами, в том числе способностью встраиваться в мембрану живой клетки. Синтезированы аффинные сорбенты для выделения нескольких видов естественных антител человека; новые лиганды для гликоэррея. 2. Методом молекулярной динамики (МД) исследовалась структурная организация мембранного фрагмента, в состав которого входит около 100 липидов, в том числе 10 гликолипидов Gb3. Показано, что конформация гликана в составе Gb3 относительно плоскости мембраны такова, что один из его субсайтов доступен для внешнего узнавания, а второй – для сближения с фосфолипидами, а это дает ключ к пониманию его необычного взаимодействия с углевод-связывающими белками. 3. Синтезирована группа молекул, содержащих Neu5Ac, в том числе рецепторы птичьих и человеческих вирусов гриппа; а также конкурентный ингибитор нейраминидазы вируса гриппа и ее суицидный субстрат. Получены соответствующие гликоконъюгаты. 4. Найдены неразрушающие для вируса гриппа условия его изучения с помощью АСМ, получены сканы АСМ хорошего разрешения. 5. Идентифицированы естественные антиуглеводные антитела, ассоциированные с липопротеинами низкой плотности. Уровень некоторых из них при атеросклерозе был выше, чем у здоровых доноров. Эпитопная специфичность выявленных антител позволила предположить их участие в преэклампсии, оказалось, что уровень антител к гиалуроновой кислоте коррелирует с общими антителами к белкам эндотелиальных клеток. По-видимому, эти антитела маскируют компоненты гликокаликса в динамических условиях.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
http://www.ibch.ru/press/news/science/1869 Направление «Белки биокаталитических систем» Осуществлен дизайн мутантных форм EcLon-протеазы и на его основе получена и охарактеризована форма фермента с делецией фрагментов V385–I399 и D431–P436, формирующих подвижные петли (Ес-Lon-d2). Установлено, что N-концевой фрагмент (1-172) абсолютно необходим для реализации процессивного механизма гидролиза белковых субстратов EcLon-протеазой. На основе созданных штаммов E. coli, продуцирующих рекомбинантную IgA1 протеазу и ее фрагменты из различных участков первичной структуры фермента, получены в высокоочищенном состоянии четыре рекомбинантных белка, содержащие гистидиновую метку в С-концевой части молекулы: (M-A28–P1004-LEH6), M-W140–K833-LEH6, M-W329–P1004-LEH6 и M-W140–Q299-Y866–P1004-LEH6. В экспериментах на животных исследованы иммуногенные и протективные свойства полученных соединений. Показано, что аминокислотные последовательности N- и C-концевых участков IgA1 протеазы (W140–Q299 и Y866–P1004) и локализованные в них эпитопы, играют важную роль в формировании у иммунизированных животных долгосрочного иммунного ответа к IgA1 протеазе и эффективной защиты от менингококков основных эпидемических серогрупп А, В и С. Исследован ограниченный протеолиз олигопептидазы PSP и показано, что в результате трипсинолиза происходит отщепление С-концевого фрагмента 656-677 с образованием PSP (1-655), который не обладает протеолитической активностью. Укороченный вариант PSP (1-655), полученный экспрессией соответствующего гена в E. coli также оказался неактивным. Химотрипсинолиз приводил к образованию PSP (101-677), обладающему способностью гидролизовать низко- и высокомолекулярные субстраты, включая азоказеи и проинсулин. Получена панель мутантных антител, обладающих улучшенными параметрами активности по отношению к субстратам метилпараоксон, а также флуоресцентным аналогам параоксона. Установлено, что уровень активности мутантных по отношению к фосфорорганическим сусбтратам меняется в ряду параоксон>метилпараоксон>Par-R>Par-MCA в сторону уменьшения скорости образования ковалентного комплекса антитело-органофосфат. В результате скрининга библиотек были идентифицированы пять вариантов БХЭ (БХЭ-PSHSG, БХЭ-KRLSG – при отборе на Par-MCA и БХЭ-DHISG, БХЭ-DHRSG, БХЭ-HTIHG – при отборе на S-MCA). Все полученные препараты обладали способность к реактивации после ковалентного связывания со «своим» субстратом. Был отобран пул мутантных форм ЕК, обладающих активностью примерно в 300 раз выше в сравнении с исходным ферментом ЕК. Было установлено, что использование негативного типа селекции обогащения на варианты ЕК, обладающих повышенной специфичностью не целесообразно. В результате очевидно необходимо разрабатывать режимы позитивной селекции для отбора вариантов, обладающих заданными параметрами специфичности. Предложена новая стратегия биосинтеза биологически важных нуклеотидов, которая состоит в мультиферментном каскадном превращении D-пентоз в пуриновые нуклеотиды. Каскадный синтез включает последовательное превращение в «одной колбе» D-пентоз в 5-фосфаты под действием рибокиназы, из которых затем синтезируются 5-фосфо-α-D-пентофуранозо-1-пирофосфаты под действием фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (PRPP-cинтетазы), конденсация последних с гетероциклическими пуриновыми основаниям в присутствии аденинфосфорибозилтрансферазы (APR-трансферазы) дает желаемые нуклеотиды. С использованием ранее созданных штаммов-продуцентов рибокиназы из Thermus species 2.9 (TspRK), PRPP-cинтетазы 2 из Thermus thermophilus HB27 (TthPRPPS) и APR-трансферазы 2 из Thermus thermophilus HB27 (TthAPRT) и разработанных методик выделения осуществлена наработка ферментов в количествах, достаточных для дальнейшего проведения рентгеноструктурных исследований. Проведен комплекс работ по оптимизации условий кристаллизации белков: подобраны условия кристаллизации методом диффузии паров растворителя и адаптированы применительно к методу встречной диффузии в капиллярах. Получены дифракционные наборы всех ферментов, пригодные для определения пространственной структуры, и проведена съемка рентгенодифракционных имиджей кристаллов наилучшего качества. С использованием метода молекулярного замещения получены структуры TthPRPPS и TthAPRT. Проанализирована структура TthPRPPS и определен аллостерический активный центр фермента. Проведен компьютерный докинг комплекса TthPRPPS с лигандом и предложены варианты для направленного мутагенеза фермента с целью изменения его субстратной специфичности. Получен очищенный препарат нового фермента - люциферазы Fridericia heliota в активном состоянии. Для локализации люминесценции в геле использовали систему детекции люминесценции Fusion Solo. Для детекции биолюминесцентной активности в геле сначала проводили электрофорез в неденатурирующих условиях, затем гель обрабатывали раствором содержащим люциферин и АТФ как указано к подписи к рисунку. Результаты эксперимента представлены на рисунке 1.7.1. В связи с установлением структуры люциферина F.heliota актуальной стала задача получения его аналогов, которые бы обладали новыми спектральными характеристиками. Для решения этой задачи необходимо было ответить на вопрос о функциональной роли различных структурных фрагментов молекулы люциферина. В ходе предварительных исследований было установлено, что активность в реакции биолюминесценции, вероятнее всего, проявляет одна из карбоксильных групп в остатке ω-оксалиллизина (LysOx), поэтому модификация исходной структуры без потери активности возможна по фрагменту ГАМК. Для проверки этой гипотезы был осуществлен синтез двух аналогов люциферина, вариабельных по этому остатку. Для синтеза производного люциферина с линкерной аминогруппой 2.28 и его конъюгата с флуоресцентным красителем 2.30 были использованы вещества CompX 2.4 и 2.26 (Схема 1.7.1). Путем активации кислоты из 2.4 был получен пептид 2.27, в котором удаляли метильную защитную группу, а затем проводили пептидный синтез - сочетание с остатком лизина 2.10. Для получения целевого продукта 2.28 удаляли защитные трет бутильную и этильную группы. Соединение 2.30 было получено конъюгацией амина 2.28 и соответствующего активированного эфира 2.29 в гидрокарбонатном буфере. Было показано, что соединения 2.28 и 2.30 обладают биолюминесцентными свойствами, аналогичными природному люциферину, проявляя активность при добавлении экстракта люциферазы. Эти данные подтвердили гипотезу о том, что фрагмент ГАМК не принимает участие в реакции биолюминесценции F. heliota. Спектры поглощения и биолюминесценции аналога люциферина 2.30 в сравнении с люциферином 2.1 представлены на Рисунке 1.7.2. Можно наблюдать значительное смещение максимума поглощения для соединения 2.30 в красную область, которое объясняется наличием новой хромофорной группы. Максимум биолюминесценции также смещается: если для люциферина 2.1 он составляет 478 нм, то для аналога 2.30, в котором возможен Фёрстеровский перенос энергии излучения (BRET) с люциферина на хромофорную группу, пик биолюминесценции соответствует 528 нм. Направление «Рецепторные и сигнальные белки. Анализ структуры и функции» С помощью гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения исследованы минимальные функциональные фрагменты рецепторных тирозинкиназ (рецепторов нейротрофинов и эпидермальных факторов роста) в мембраноподобных средах. Выявлены структурные детерминанты и построены конформационно динамические модели функционирования рецепторов в мембране клетки. Для функционирования рецептора нейротрофинов показана важность образования межмолекулярной SS-связи между трансмембранными доменами внутри мембраны. На основе структурных ЯМР данных и молекулярного моделирования выявлено влияние соматических онкогенных трансмембранных мутаций на активацию рецепторов эпидермальных факторов роста. Нами было ранее показано, что рецепторная тирозинкиназа ИРР, близкий структурный гомолог рецептора инсулина, является клеточным сенсором слабощелочной среды. Была проведена экспрессия эктодомена ИРР в эукариотических клетках, выделен чистый белок и изучена его пространственная структура при помощи криоэлектронной микроскопии и малоуглового рентгеновсого рассеяния. Построена модель трехмерной структуры эктодомена и найдены ее изменения при защелачивании среды. В ходе работы по проекту у модельного объекта - шпорцевой лягушки - впервые был найден мембранный трех-петельный белок, Tfp4, и показано, что он является потенциальным рецептором секретируемого фактора Agr2. Так как Agr2 вовлечен во множество процессов в нормальном развитии и при патологии, выявление и изучение его рецептора является важной задачей. Направление «Пептидомика. Пептидные факторы системы врожденного иммунитета» Для экспрессии антимикробных пептидов в бесклеточной белоксинтезирующей системе были получены генно-инженерные конструкции в виде кольцевых и линейных молекул ДНК, кодирующих АМП (цистеин-содержащие, в т.ч. бета-шпилечные, пролин-богатые, производные гистонов) под контролем промотора Т7. Была исследована зависимость уровня экспрессии от концентрации ДНК матрицы, температуры, концентрации ионов магния. Проведена работа по оптимизации условий реакции бесклеточного синтеза и осуществлена препаративная наработка трех пептидов в количествах, достаточных для проведения тестов антимикробной и гемолитической активности. Изучена антимикробная активность семи пептидов (ThM21L, 3W, TachZ, TachY8S, TachY8R, TachI11S, TachI11R) в отношении штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также их гемолитическая активность в отношении свежевыделенных человеческих эритроцитов. Были получены значения минимальной ингибирующей, минимальной бактерицидной и минимальной гемолитической концентраций исследуемых пептидов. Для трех наиболее активных пептидов (TachZ, TachY8S, TachI11S) были построены кинетические кривые действия на цитоплазматическую мембрану бактерий E. coli. Изучены адсорбционные зависимости разности граничных потенциалов (РГП) от концентраций ареницина-2 и Lc-LTP2 для БЛМ, моделирующих свойства мембран грамположительных, грамотрицательных бактерий и клеток млекопитающих. Установлен эффект увеличения РГП с увеличением доли отрицательно заряженных фосфолипидов в БЛМ. В экспериментах по измерению мембранного тока показано, что проводимость пептид- индуцируемых проводящих пор увеличивается соответственно доле отрицательно заряженных фосфолипидов в БЛМ. Изучено влияние модифицированных аналогов ареницина-2 на барьерные свойства БЛМ. В работе использовали аналоги со следующими заменами Tyr5Ser (аналог А1) и Val4Ser (аналог А2). Оба аналога вызывают флуктуации проницаемости БЛМ всех типов. Действие аналога А2 не приводит к разрушению мембраны. Замена Tyr5Ser способствует ускорению разрушения мембраны под действием данного пептида в той же концентрации, что и для исходного пептида. Структура этого катионного пептида в частично заряженной мембране, состоящей из ФГ/ФХ, исследована методами Фурье ИК и КД-спектроскопии. Фурье ИК спектры ареницина в области амида I анализировали методом разложения сложного контура и методом второй производной. Данные Фурье ИК для пептида в липосомах из ФГ/ФХ сопоставлялись с данными, полученными в мицеллах анионного детергента додецилсульфата натрия, где согласно данным ЯМР- спектроскопии ареницин формирует димер, образованный при ассоциации двух параллельных β-шпилек. Результаты указывают на то, что ареницин формирует димерную структуру в частично заряженной липидной мембране из ФГ/ФХ. Получен лабораторный образец липид-транспортирующего белка укропа Anethum graveolens (Ag-LTP), меченный стабильными изотопами 13C,15N. Полученный образец был охарактеризован методами электрофореза в ПААГ, масс-спектрометрии МАЛДИ, КД-спектроскопии и автоматического N-концевого микросеквенирования. Методом ЯМР-спектроскопии была определена пространственная структура липид-транспортирующего белка укропа Ag-LTP в водном растворе. Определены оптимальные условия для измерения ЯМР-спектров Ag-LTP. Было показано, что структура Ag-LTP представлена четырьмя α-спиралями и содержит длинную неупорядоченную петлю в С-концевом участке молекулы. Ag-LTP содержит внутреннюю гидрофобную полость объемом ~800 Å3, в которой располагается сайт связывания липидных молекул. По данным о релаксации ядер 15N охарактеризована внутримолекулярная динамика Ag-LTP в свободном состоянии и в комплексе с липидом LPPG. В рамках количественного анализа пептидомов крови было проведено выделение пептидного пула из 9 образцов сыворотки крови здоровых доноров и 9 образцов пациенток с подтвержденным диагнозом рак яичников, используя крупнопористый слабый катионообменный сорбент Toyopearl CM-650M, Tosoh Bioscience LLC, USA. Был проведен количественный анализ пептидомов сыворотки крови методом безметочной квантификации SWATH LC-MS/MS. В процессе проведения экспериментов была отработана технология безметочной квантификации таких сложных биологических жидкостей, как плазма или сыворотка крови. Количественным безметочным масс-спектрометрическим методом SWATH в пулах образцов сыворотки крови пациенток с подтвержденным диагнозом рак яичников обнаружено 36 пептидов, содержание которых в 2 или более раз выше, чем в пулах сыворотки крови здоровых доноров, и 28 пептидов, содержание которых в 2 или более раз ниже, чем в пулах образцов от здоровых доноров. Для секвенирования транскриптома была выделена и очищена мРНК из трёх типов клеток мха Physcomitrella patens. Секвенирование библиотеки мРНК было проведено с использованием генетического анализатора SOLiD 4 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Была обнаружена транскрипция 23446 генов, к которым относится 47976 изоформ. При этом 12043 генов имеют более одной изоформы, т.е. подвергаются альтернативному сплайсингу (AS). Для идентификации дифференциально-экспрессирующихся (DE) и дифференциально-альтернативно сплайсирующихся (DAS) генов мы составили каталог транскриптов, которые включал 61048 транскриптов для 32275 генов, куда отнесли и аннотированные изоформы, содержащиеся в версии генома мха 1.6. Известно, что помимо белок-кодирующих транскриптов, короткие открытые рамки считывания (sORFs) с высоким кодирующим потенциалом могут быть обнаружены на длиных некодирующих РНК (lncRNAs). Поэтому, для более полного описания транскриптома клеток мха мы отобрали lncRNAs, потенциально способные нести sORFs. Оценка кодирующего потенциала транскриптов проводилась по следующей схеме: транскрипты, длиной свыше 200 нуклеотидов, не являющиеся аннотированными транскриптами (версия генома 1.6) были отобраны, и проведен анализ их кодирующего потенциала с помощью программного пакета CNCI и базы данных Rfam. Кроме того, было проведено секвенирование неполиаденилированной РНК, выделенной из протонемы и протопластов P. patens для того, чтобы идентифицировать транскрипты участков генома, способные кодировать пептиды, но не связанные с работой РНК-полимеразы II. Для этого выделенная тотальная РНК была секвенирована на платформе Illumina HiSeq (DNA Sequencing Center/Brigham Young University). В результате было получено 106,178,640 и 102,092,879 высококачественных парных ридов для РНК, выделенной из протонемы и протопластов, соответственно. С помощью программы Trimmomatic были отрезаны адаптеры, и риды были отфильтрованы по длине (минимум 105 п.н.). Затем риды были картированы на последовательности хлоропластной и митохондриальной ДНК мха, и картированные риды (около 60%) были отфильтрованы. В итоге для сборки lncRNA были использованы 45,648,279 парных ридов для протонемы и протопластов. Длина ридов варьировала от 105 до 113 п.н. Используя результаты транскрипционного профилирования, была создана база данных коротких последовательностей для поиска пептидов в образцах с помощью масс-спектрометрического анализа. Данная база включает в себя аминокислотные последовательности, соответствующие sORFs, лежащих на транскриптах и, следовательно, имеющих высокий кодирующий потенциал. Направление «Мастер-регуляторные белки и гены развития и канцерогенеза на примере поджелудочной железы» Задачей данного направления является выявление мастер регуляторных генов и кодируемых ими белков, ответственных за включение морфогенеза поджелудочной железы в процессе эмбрионального развития человека, исследование их экспрессии в норме и дисрегуляции в процессе канцерогенеза, а также исследование возможностей использования мастер генов в качестве мишеней для диагностики и терапии рака поджелудочной железы, в том числе PDAC. Мы выдвигаем гипотезу, что ключевые для эмбрионального развития гены – мастер гены и белки являются также ключевыми для инициации и эволюции раковой опухоли, включая метастазирование. В предлагаемом Научном проекте мы основываемся на литературных данных и собственных результатах, полученных нами в предыдущих исследованиях, которые свидетельствуют о том, что гены и сигнальные пути, ответственные за включение морфогенетических процессов в ходе эмбрионального развития, при канцерогенезе выключаются (и наоборот). Итогом проекта будет расширение фундаментальных знаний о механизмах развития и раковой трансформации поджелудочной железы и выявление потенциальных мишеней терапевтического воздействия. Для решения этой задачи были систематизированы данные по белкам и генам, вовлеченным в развитие и морфогенез поджелудочной железы человека и животных. Систематизированы данные по белкам и генам, активно вовлеченным в возникновение и развитие рака поджелудочной железы, а также в инициацию метастатического процесса и диссеминированного роста. Проведено сопоставление этих двух массивов данных и выявлены потенциальные гены-кандидаты, вызывающие эмбриоподобное состояние раковых клеток. Созданы коллекции эмбриональных тканей человека на различных стадиях формирования поджелудочной железы. Собраны образцы аутопсийного материала ткани нормальной поджелудочной железы и коллекция хирургических образцов поджелудочной железы при хроническом панкреатите. Созданы коллекции хирургических образцов рака поджелудочной железы. Все образцы гистологически охарактеризованы, собраны сведения о пациентах. Созданы аннотированные каталоги собранных образцов тканей. Из собранных образцов тканей приготовлены панели РНК, кДНК, а также выделена геномная ДНК для проведения в дальнейшем эпигенетического анализа промоторов наиболее интересных мастер генов. Для дальнейшей работы были взяты шесть потенциальных мастер генов (PDX1, PTF1a, SOX9, HNF1-beta, GATA4, KLF5 и ZEB1) и белков, вызывающих эмбриоподобное состояние опухоли. Проведен экспериментальный анализ содержания продуктов экспрессии потенциальных мастер генов в опухолевых и эмбриональных тканях поджелудочной железы, показана дифференциальная экспрессия этих генов в опухолевых и фетальных тканях поджелудочной железы. Кроме того в работу взят ген FAP, белок которого содержится в клетках CAF (cancer associated fibroblasts), составляющих основную массу (до 90%) стромального окружения опухолей эпителиального происхождения. CAF клетки характерны практически для всех карцином и FAP может быть перспективной мишенью для терапевтического воздействия. Проанализирован уровень экспрессии гена FAP на панели клеточных линий. Полученные данные обобщены в опубликованной статье. За отчетный период опубликовано 7 обзоров, обобщающих современные представления о механизмах молекулярного эмбриогенеза и канцерогенеза, их взаимосвязи, и роли мастер генов и регуляторов транскрипции в этих процессах. Опубликовано две статьи с экспериментальными данными. Материалы работы были представлены на четырех конференциях. Таким образом, проект развивается по намеченному плану, и все задачи, намеченные на отчетный период, выполнены. Направление «Белок и гликан-опосредованные клеточные взаимодействия в динамических условиях» 1) Молекулярная динамика для объяснения толерантности естественных антител. Проведено исследование почему не происходит аутоиммунной реакции между антителами к трисахариду Pk (он является гликаном гликолипида Gb3) и нормальным компонентом клеток, гликолипидом Gb3. Синтетический аналог гликолипида, отличающийся наличием спейсера-вставки между трисахаридом и липидом, связывался с антителами человека как в липидных мембранах, так и в искусственных тест-системах. Для объяснения иммунохимических данных была привлечена Молекулярная Динамика: симуляция проводилась с кластером молекул Gb3 (или его синтетическим аналогом sGb3), окруженных разными фосфолипидами Найдено, что: 1) холестерин (также, как и в иммунохимических экспериментах) не влияет на ориентацию трисахарида; 2) склонности к образованию кластеров гликолипидов не наблюдается; 3) водородные связи с молекулами среды значительно лучше формирует sGb3, чем природный гликолипид, а доступность внутреннего остатка Glc в Galα1-4Galβ1-4Glc в заякоренной молекуле sGb3 принципиально выше, чем в Gb3. Иммунохимические эксперименты по взаимодействию антител с широким рядом синтезированных аналогов (здесь без липидной части) показали, что приближенный к мембране остаток Glc важен для взаимодействия. Всё вместе это дает право заключить, что пространственная недоступность эпитопа естественных анти-Pk антител является причиной отсутствия в крови взаимодействия антител с казалось бы комплементарным антитеном. Далее, МД симуляция Gb3 в составе мицеллы выявила доступность остатка Glc, что предполагает возможность узнавания естественными антителами Gb3-содержащих свободных или формирующихся на внешней стороне мембраны везикул высокой кривизны; это будет предметом экспериментального изучения в дальнейшем. 2) Адаптация техники Surface Plasmon Resonance (SPR) для целей проекта. Исследовалась кинетика взаимодействия антител MA58-1 (IgG), направленных к дисахариду LeC, с помощью двух слайдов, с разной химией иммобилизации дисахарида. Поверхность золотого SPR слайда модифицировали цистеин-содержащим конъюгатом LeC-PAA-Cys в области первой проточной ячейки, а также AG-PAA-Cys (производное аминоглюцитола) как контроль - в области второй проточной ячейки слайда. Сенсограммы выглядят как классические SPR данные. Поверхность карбоксиметилдекстранового SPR слайда модифицировали мономерным LeC-spNH2 (область первой проточной ячейки) и AG-NH2 (контроль, область второй проточной ячейки), сенсограммы при таком методе иммобилизации значительно отличаются от классических SPR гистограмм, причины этого выясняются. В результате, 1) иммобилизация углеводного антигена на золотом слайде гликозилированным полимером через цистеин дает заметно лучшие результаты, чем иммобилизация того же мономерного лиганда на карбоксиметилдекстрановом слайде; 2) адекватной моделью взаимодействия антиген:антитело (IgG) при выбранном методе иммобилизации (через полимер) следует считать 1:1, так как при модели 1:2 величина KD порядка 10-11 для данных антител (выбранный антиген не является для них оптимальным) представляется нереальной; 3) найденные условия иммобилизации и условия проведения SPR-анализа можно далее применить для исследования естественных антител человека к гликану методом SPR. 3) Перенос гликолипидов на бактерии. В 2016 году мы продемонстрировали возможность быстрого переноса модельных липидов из клеток на бактерии. Затем тот же самый эффект был показан на гликолипиде, окрашивание проводили с помощью флуоресцентно-меченых антител к гликану этого гликолипида, тетрасахариду A(type 2). Наконец, показана возможность быстрого (меньше 1 мин) переноса липидов между гликолипид-модифицированными и нативными бактериями. Таким образом, гликолипиды могут переноситься из клеточной мембраны на бактерии, и передаваться между бактериями, причем процесс переноса происходит очень быстро – это неожиданно, мы ожидали, что быстрый («авидный») захват предполагает медленный трудный их релиз. 4) Динамическое светорассеяние, малоугловое рассеяние и AFM гликолипидов. AFM показывает наличие мицелл, которые в результате высушивания приобретают форму сплюснутого эллипсоида. Отметим, что частицы как мелкие (мицеллы), так и крупные (липосомы) практически одной формы, отличаются только размером, что указывает на высокую устойчивость частиц, которые не разрушаются даже при высушивании. Кроме того, отсутствуют «слипшиеся» частицы, что свидетельствует о высокой их коллоидной стабильности. 5) Зондовая микроскопия (AFM) в изучении вируса гриппа. Был приенен метод, основан на использовании биотинилированного лиганда гемагглютинина вируса. Данную технику иммобилизации вирусных частиц мы применили для закрепления их на кончике зонда атомно-силового микроскопа, контролируя процесс с помощью растрового электронного микроскопа. Однако, вирусы осаждались преимущественно на основании кантилевера, но не на зонде. Причина будет выясняться, параллельно будет использована другая методология иммобилизации. Несомненным положительным итогом исследований 2016 г. является уверенность в возможности изучения вируса гриппа данным методом. 6) Естественные антитела (еАТ) как регуляторы адгезии ЦОК, ЛНП и др. Для изученияроли еАТ в роллинг-подобных механизмах адгезии, и возможной блокирующей роли, что служит причиной резистентности раковых клеток к иммунитету на сегодня представляется единственно возможным применение метода иммуно-ПЦР (иПЦР), обладающего рекордно высокой чувствительностью. В качестве первого этапа мы использовали иПЦР на основе ИФА, который дал нам возможность оценить чувствительность разрабатываемого чипного варианта на примере антител к дисахариду LeC, которые предположительно связываются с ЦОК, и несомненно являются опухоле-специфичными. Минимальная определяемая концентрация антител LeC методом иПЦР была 4 нг/мл, в то время как в ИФА - 300 нг/мл. Во всех экспериментах колебания значений ΔCq не выходили за пределы 0.2 цикла, что говорит о хорошей воспроизводимости получаемых результатов. Так как определяемые анти-LeC иммуноглобулины по аффинности и изотипному составу (в основном, IgM) являются типичными представителями еАТ, то есть основания полагать, что этот метод столь же успешно будет работать при детекции других анти-гликановых антител. Особо подчеркнем достоверность определения малого количества антител, что важно для выявления клеточных мишеней еАТ. Величина 4 нг соответствует ~108 молекул IgM; если количество клеточных мишеней на одной клетке не превышает величины 104, то для определения специфичности маскирующих антител методом иПЦР потребуется 104 – 105 клеток, что представляется вполне реальным количеством. 7) Синтетическая часть. За 2016 г. библиотека гликанов пополнилась 20 новыми гликанами и 50 новыми гликоконъюгатами 8) Приборно-методологическая работа. Была использована комбинация методов сканирующей зондовой микроскопии (СТМ) и оптической микроспектроскопии (ОМ), которые инструментально реализованы в одном приборном комплексе, что позволило получать изображения высокого и сверхвысокого разрешения (СТМ) и данные о структуре-функции локальных объектов (ОМ). Отработка методов осуществлялась на примерах гибридных наноструктур, содержащих флуоресцентные квантовые точки, были исследованы модельные пурпурные мембраны с бактериородопсином, благодаря чему была отработана техника оптической микроспектроскопии, в частности методы гигантского комбинационного рассеяния, применительно к клеточным мембранам. Особенности техники ОМ определялись на модели белок/наночастица, где в роли наночастиц применяли серебряные плазмонные или полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы. Процесс трансформации сигнала бактериородопсином оказался чувствительным к окружению, что позволяет использовать этот объект для оценки параметров микроспектральной техники Для изучения динамических процессов взаимодействия биологических объектов, были созданы ратиометрические наносенсоры, позволяющие регистрировать изменения температуры в локальных объемах сред (в том числе и в потоке) в физиологическом диапазоне температур (25-40°С).

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Результаты работы по проекту опубликованы на сайте ИБХ РАН: http://www.ibch.ru/press/news/science/2273 РЕЦЕПТОРНЫЕ И СИГНАЛЬНЫЕ БЕЛКИ. АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ На основе данных гетероядерной ЯМР-спектроскопии и молекулярного моделирования конформационных перестроек и межмолекулярных взаимодействий описаны молекулярные механизмы активации рецепторов эпидермальных факторов роста (EGFR) и рецепторов факторов роста фибробластов (FGFR3) из организма человека с учетом роли липидного окружения, как одного из главных компонентов самосогласованной сигнальной системы. В рамках разработанного липид-опосредованного механизма передачи сигнала через мембрану клетки предложены альтернативные последовательности структурных перестановок, наблюдаемых при активации рецептора FGFR3 при связывании кислого fgf1 и основного fgf2 лигандов с существенно различными электрическими зарядами. Продолжены работы по изучению структуры и механизма активации рецепторной тирозинкиназы ИРР, являющейся клеточным рН-сенсором при помощи криоэлектронной микроскопии и малоуглового рентгеновского рассеяния. Определены изменения конформации эктодомена ИРР при повышении рН среды. Параллельно разрабатывалась методика экспрессии и выделения полноразмерного таггированного рецептора ИРР для следующего этапа анализа механизма рН-зависимой активации данной тирозинкиназы в нанодисках. В ходе работы по проекту различными методами подтверждено взаимодействие белка Noggin4 с секретируемым белком - Wnt11. Показано, что данное взаимодействие необходимо для регенерации у модельного объекта - шпорцевой лягушки. Методом ЯМР проведено исследование структуры рецептора Tfp4. С использованием данных транскриптомного секвенирования изучены сигнальные каскады, регулируемые белком Ag1 и его роль в раннем развитии мозга и при регенерации. Аналогично, сравнительный анализ масштабного секвенирования транскриптомов почек мышей дикого типа и нокаутных по гену ИРР было использовано для выявления учaстников сигнальных путей данной рецепторной тирозинкиназы. Также изучены сигнальные каскады эндогенного рецептора ИРР в клетках инсулиномы, способных секретировать инсулин. Подобран оптимальный флуоресцентный рН- чувствительный белок для экспериментов in vivo. Получена конструкция и начаты эксперименты по получению трансгенных животных, экспрессирующих данный рН рН-сенсор на поверхности клеток. МАСТЕР-РЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ И ГЕНЫ РАЗВИТИЯ И КАНЦЕРОГЕНЕЗА НА ПРИМЕРЕ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Рак часто рассматривают как проблему биологии развития. Эмбриональное развитие человека - это строго регулируемый процесс образования упорядоченных структур – тканей и органов. А рак, напротив, - это процесс дерегуляции, ведущий к разрушению этих структур. Нашей лабораторией и другими авторами неоднократно отмечалось, что при развитии раковой опухоли наблюдается реактивация некоторых эмбриональных генов, и наоборот, ряд генов, характерных для взрослого организма, теряют свою активность. Мы выдвинули гипотезу, что ключевые для эмбрионального развития того или иного органа гены, так называемые мастер гены, являются также ключевыми для возникновения и развития раковой опухоли этого органа и последующего возникновения метастазов в других органах». Исследование таких мастер генов, их подавление или активация, могло бы открыть возможность возвращения раковых клеток к нормальному исходному состоянию, или найти связанные с ними другие гены, которые можно использовать как мишени терапевтического воздействия. Наши исследования посвящены молекулярно-генетическим особенностям аденокарциномы поджелудочной железы (АПЖ), одной из самых трудно поддающихся лечению опухолей человека. В структуре смертности от онкологических заболеваний АПЖ занимает четвертое место и существует острая потребность в новых подходах к ее терапии. Однако поджелудочная железа очень сложна по своему строению и, хотя ее изучению и изучению ее патологий посвящены горы научной литературы, пока точно не известны мастер-регулирующие гены и белки, которые являются ключевыми для ее развития и для развития АПЖ и могли бы быть мишенью при терапии. Нашей задачей является выявление таких мастер-регуляторных генов, исследование этих генов в норме и их изменений в процессе канцерогенеза, а также исследование возможностей их использования в качестве мишеней для терапии АПЖ. В прошлом году мы получили, на мой взгляд, значимый фундаментальный результат – мы идентифицировали группу мастер регуляторов развития поджелудочной железы, которые координированно выключаются в клетках АПЖ. В этом году эти исследования продолжались. Мы двигались по двум принципиальным направлениям. Во-первых, исследовали вопрос, что произойдет с клетками АПЖ, если в них ввести и заставить работать идентифицированные мастер гены, которые выключились при образовании опухоли, и наоборот, что будет, если подавить работу генов которые включились при ее образовании. Для этих целей мы создали специальные генетические конструкции, которые, при введении в раковую клетку выполняют вышеуказанные задачи, ввели их в раковые клетки и в настоящее время анализируем, как изменяются их различные свойства. При этом мы сделали важный принципиальный шаг. До недавних пор все усилия исследователей, стремящихся найти способы лечения рака, были направлены на собственно раковые клетки. Однако, в последние годы стало отчетливо ясно, что раковые клетки успешно развиваются только благодаря своему окружению, так называемой строме. При этом раковые клетки очень пластичны и могут превращаться в компоненты стромы, подвергаясь так называемому эпителиально-мезенхимальномы переходу. Думают, что этот переход важен для способности метастазировать - рассеивать опухоль по организму. В этом переходе также участвуют мастер гены. Мы в нашей работе исследуем способы воздействия на мастер гены, работающие как в раковых так и в стромальных клетках. Сегодня мы еще далеки от окончательных заключений, но уже ясно, что подавление или, наоборот, активация определенных мастер генов и в раковых клетках и в строме существенно меняет работу целого ряда других генов, каким то образом влияя на их регуляцию. Мы даже попробовали посмотреть, какие элементы генома ответственны за это изменение и выявили ряд таких регуляторов – энхансеров и промоторов. Полученные результаты создают базу для обоснованного перехода на другой более высокий уровень исследований. Если до этого вся работа выполнялась на клетках, то далее она будет развиваться на модельных организмах - мышах. При этом будут анализироваться те гены, которые мы идентифицировали на уровне клеток. ПЕПТИДОМИКА. ПЕПТИДНЫЕ ФАКТОРЫ СИСТЕМЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА Исследованы цитотоксические свойства аналогов пептида мечехвоста Tachypleus tridentatus, обладающих высокой селективностью антибактериального действия в отношении нормальных клеток человека – астроцитов и фибробластов. Показано, что аналоги TachY8S и TachI11S обладают сравнительно невысокой цитотоксичностью при концентрациях вплоть до 50 мкМ, что позволяет рассматривать их как перспективные соединения для разработки антибиотиков с широким спектром действия. Исследована способность ряда антимикробных пептидов, относящихся к различным структурным классам (ареницина-2, апидецина 1b, TachI, PRP7(1-22), PRP7(1-16), ChBac3.4, тритрптицина), к ингибированию процесса бактериальной трансляции. Показано отсутствие данного типа активности у ареницина-2, TachI и тритрптицина. Пептид PRP7(1-22), продемонстрировавший высокую эффективность ингибирования рибосомального биосинтеза белка, был подвергнут сканированию аланином, что позволило выявить ключевые аминокислотные остатки, необходимые для осуществления биологической функции пептида. Получены лабораторные образцы липид-транспортирующих белков гороха посевного Pisum sativum Ps-LTP1, меченного стабильными изотопами 13C, 15N, и амброзии полынолистной Ambrosia artemisiifolia Amb a 6. Для этого были выбраны родительские штаммы E. coli и получены штаммы-продуценты. Проведена оптимизация условий для экспрессии гибридных белков в клетках E. coli. Целевые рекомбинантные 13C,15N-Ps-LTP1 и Amb a 6 были получены с использованием аффинной хроматографии, реакции расщепления гибридных белков бромцианом и ОФ-ВЭЖХ. Полученные 13C,15N-Ps-LTP1 и Amb a 6 были охарактеризованы методами SDS-электрофореза в ПААГ, времяпролётной масс-спектрометрии МАЛДИ, КД-спектроскопии и автоматического N-концевого микросеквенирования по методу Эдмана. Степень включения изотопных меток 13C и 15N в структуру молекулы Ps-LTP1 гороха была установлена методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии. Проведен пептидомный анализ сорного злака – ежовника обыкновенного Echinochloa crusgalli L. Идентифицированы новые молекулы, гомологичные антимикробным пептидам альфа-харпининам с уникальным 4-цистеиновым мотивом, установлены их молекулярные массы и частичные аминокислотные последовательности. Оптимизирована и упрощена методика выделения и очистки комплекса защитных полипептидов из семян ежовника, включающая в себя две основных стадии фракционирования методами жидкостной хроматографии высокого и среднего давления. Получены количественные данные об усилении антимикробной активности при действии комплекса альфа-харпининов семян ежовника из группы EcAMP, что выражалось в подавлении роста мицелия грибов. Кровь является соединительной тканью, состав которой изменяется в зависимости от процессов, происходящих в организме. Благодаря своему сравнительно небольшому размеру пептиды легче белков преодолевают клеточные мембраны и эпителиальные барьеры. Среди пептидов, обнаруживаемых в крови, есть как фрагменты секретируемых различными тканями белков, выполняющие свои функции в плазме, так и лиганды рецепторов: гормоны, цитокины и медиаторы клеточного ответа. В небольших количествах в крови могут присутствовать пептидные маркеры различных заболеваний (к примеру, онкомаркеры) и даже чужеродные пептиды, относящиеся к патогенным организмам и инфекционным агентам. Чтобы получить представление о составе пептидома крови в норме, мы провели LC-MS/MS анализ 20 образцов сыворотки и плазмы крови здоровых доноров на масс-спектрометре TripleTOF 5600+. Образцы были подготовлены по ранее разработанным нами протоколам десорбции пептидов с поверхности представленных белков плазмы крови с последующими стадиями хроматографической очистки. Геномы содержат миллионы коротких (<100 кодонов) открытых рамок чтения (sORF), которые обычно отбрасываются при аннотации генов. Тем не менее, пептиды, кодируемые sORFS, могут играть важную биологическую роль, и их влияние на клеточные процессы недооценено. Функциональный анализ одного из таких пептидов, кодируемого длинной некодирующей РНК, показал, что он участвует в регуляции роста и дифференциации мха. Высокая эволюционная скорость и распространённость sORFs позволяют предположить, что они могут служить резервом потенциально активных пептидов и играть важную роль в эволюции генов. Помимо пептидов, кодируемых sORFs, растительная клетка содержит большое количество фрагментов белков, образующихся при протеолитической деградации, но до сих пор не известно, являются ли эти пептиды побочными продуктами деградации белка или важными биологически активными компонентами клетки. В нашем исследовании мы получили доказательства активной регуляции как внутриклеточными, так и внеклеточными пептидными пулами, влиянии на эти процессы фитогормонов и продемонстрировали биологическую активность ряда пептидов. БЕЛОК И ГЛИКАН-ОПОСРЕДОВАННЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ДИНАМИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ Изучено взаимодействие антител (IgM) к антигену группы крови А, иммобилизованных на SPR-чипе, с А-эритроцитами (которые имеют в своем составе как гликолипиды, так и гликопротеины с А-антигенностью), а также «упрощенными» эритроцитами, содержащими только один из этих компонентов. Первые получали путем встраивания гликолипида GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAc-spacer-DOPE в эритроциты группы крови О, а вторые – путем ковалентного присоединения тетрасахарида к периферическим белкам гликокаликса. Такой подход позволил изучить не только кинетику взаимодействия эритроцитов с поверхностью в динамических условиях, но и перенос гликолипидов с клетки на поверхность. Проведено молекулярно-динамическое симулирование природного гликолипида Gb3 и его синтетического аналога Pk-DOPE в составе плоского мембранного бислоя и в мицелле, априори имеющей высокую кривизну. Предполагалось, что благодаря кривизне, в мицелле будет более доступным для узнавания естественными анти-Pk антителами внутренняя часть трисахарида, которая принципиальна для узнавания антигена этими антителами (они узнают синтетический аналог, но не взаимодействуют с природным гликолипиом). Эксперимент показал, что внутренний остаток Glcβ в мицеллярных кластерах действительно становится более доступным для растворителя, и, соответственно, для взаимодействия с антителами. Синтезированы удобные для иммобилизации на SPR-чипе сиалоолигосахариды: Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc (рецептор для человеческих вирусов) и Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc (рецептор для птичьих вирусов), последний в качестве отрицательного контроля для экспериментов с человеческими вирусами гриппа. Их взаимодействие с сиалорецептором на чипе происходит независимо от скорости потока, более того, оно оказывается необратимым – вирус не удается элюировать с чипа даже в жестких условиях; причина необратимости будет выясняться. Моделирование углевод-белкового взаимодействия в гликокаликсе клетки проводилось таким образом: в мембрану эритроцитов встраивались синтетические гликолипиды, имеющие в качестве полярной «головы» тетрасахарид GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAc, всего пять вариантов, отличающиеся расстоянием между липидом и гликаном, а также архитектурой гликолипида. Взаимодействие с антителами против данного гликана выявили следующую закономерность: только те варианты, которые не заглублены в гликокаликс, способны связывать антитела (IgG) к гликану, независимо от скорости потока жидкости, в которой находятся антитела, и от времени инкубации. Проводилось измерение кинетики переноса гликолипида в следующих трёх системах: клетка HUVEC → бактерия; бактерия → клетка HUVEC; бактерия→бактерия. Первый процесс является очень медленным и малоэффективным. Перенос с бактерии на бактерию является самым быстрым. Перенос с клетки млекопитающих на бактерию идет медленнее - заметно проходит уже за минуты, а на максимум выходит за десятки минут. Мы объясняем однонаправленность переноса в системе клетка-бактерия наличием у клетки HUVEC мощного гликокаликса, который «выпускает» наружу гликолипиды в виде отдельных молекул или небольших везикул, но не «впускает» внешние липиды внутрь. В дальнейшем предполагается повторить эксперименты на эритроцитах, у которых толщина гликокаликса на порядок ниже, чем у HUVEC, изучить зависимость процесса переноса от скорости потока одного объекта относительно другого. Синтетический липид biot-CMG2-DOPE был изучен методами AFM, TEM, динамического светорассеяния и малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) в сочетании с молекулярно-динамической симуляцией. Оказалось, что на ровной поверхности он формирует монослой, где почти все молекулы имеют одну и ту же стабильную конформацию, в которой полярный фрагмент CMG2 сложен пополам в своей шарнирной средней части, а остаток биотина утоплен в неполярном монослое DOPE. Несмотря на маскированность биотина, монослой без каких-либо затруднений взаимодействовал со стрептавидином. Молекулярно-динамическая симуляция показала, что события «выхода» остатков биотина на поверхность монослоя имеют низкую, но конечную вероятность. Таким образом, процесс взаимодействия монослоя со стрептавидином является белок-индуцированным. По-видимому, аналогичные явления происходят и в природе, на клеточной мембране; изученный нами монослой является удобной экспериментальной системой для их моделирования. Разрабатывался микрочипный вариант иммуно-ПЦР на основе 3D-технологии ИМБ РАН, с тем расчетом, чтобы можно было отделять от стеклянной основы гелевые микроэлементы и каждый из них подвергать обычной процедуре иммуно-ПЦР в пробирке. При такой постановке чувствительность метода не превышала чувствительности флуоресцентного метода детекции тех же антител без стадии ПЦР (а методически была значительно сложнее). В 2018 г. будет апробирован вариант, основанный на 2D-чипе в сочетании с иной ПЦР-технологией. БЕЛКИ БИОКАТАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ Биолюминесценция, или способность тысячи видов морских и наземных живых организмов излучать видимый свет, - одно из самых удивительных явлений природы. В рамках выполнения проекта были установлены структуры люциферинов еще двух совершенно новых биолюминесцентных систем – почвенного червя Fridericia heliota и высших грибов. Плюс, развивая данный проект, был установлен точный химический механизм биолюминесценции Fridericia heliota, который, как это ни удивительно, очень схож с механизмом функционирования обычного светлячка. Работы по программе гранта позволили определить структуры ряда природных аналогов люциферина, выделенных из червей, – это приоткрыло завесу на пути к изучению биосинтеза молекулы. Люциферин Fridericia уникален – он нетоксичен, прост в получении, и при этом в отличие от всех остальных люциферинов исключительно стабилен – месяцами может храниться в сухом виде и в растворе. Одной из главных задач проекта мы считаем создание новых катализаторов на основе существующих ферментов. Таким ферментом, например, является бутирилхолинэстераза. Биологические антидоты на ее основе способны нейтрализовать широкий спектр фосфорорганических токсинов (ФОТ). В рамках проекта РНФ удалось создать новый каталитический антидот. В рамках выполнения этапа была создана оптимизированная библиотека генов, содержащая до 1 миллиона различных вариантов фермента. Далее, применяя оригинальную, не имеющую аналогов в мире, технологию поиска биокаталитической активности мы провели отбор только тех вариантов фермента, которые были устойчивы к ингибированию флуоресцентными аналогами пестицида параоксон и боевого отравляющего вещества зомана. Были выбраны варианты фермента, обладающие устойчивостью к ингибированию соответствующими ФОТ, два из них гидролизовали пестицид параоксон. Таким образом, был сделан шаг к созданию эффективных каталитических антидотов на основе БуХЭ против отравлений ФОТ. В направлении поиска новых ферментов-протеаз терапевтического и биотехнологического назначения был разработан новый метод позитивной селекции протеолитической активности ферментов на поверхности дрожжевых клеток. Метод успешно квалицирован на примере биотехнологического фермента – энтерокиназа. Изучены иммуногенность и протективность двух рекомбинантных белков, фрагментов IgA1 протеазы N. meningitidis, способных обеспечить защиту животных при заражении менингококками серогрупп А, В и С. В опытах по пассивной защите мышей с использованием сыворотки животных, иммунизированных этими белками, и с помощью адаптивного переноса лимфоцитов этих мышей интактным мышам-реципиентам показана важная роль клеточного и гуморального факторов в формировании иммунитета к менингококку серогруппы В. Продолжены работы по исследованию мультиферментного каскада превращения D-пентоз в пуриновые нуклеотиды в «одной колбе» с применением рибокиназы, фосфорибозилпирофосфатсинтетазы и аденинфосфорибозилтрансферазы. На основании сравнения со структурами гомологичных белков (APRT термофильного штамма Thermus thermophilus HB8 и Homo sapiens APRT) локализовано положение активного центра фермента и ряда функционально важных аминокислотных остатков.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Результаты работ по проекту в 2018 году опубликованы на сайте ИБХ по адресу: http://www.ibch.ru/press/news/science/2674 РЕЦЕПТОРНЫЕ И СИГНАЛЬНЫЕ БЕЛКИ. АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ Проведено изучение рецепторных белков как ключевых компонентов сенсорных систем организма и участников межклеточных сигнальных взаимодействий, их структурно-функциональных особенностей и способов регуляции. На основе разработанных в ходе выполнения проекта новых технологиях и полученных фундаментальных знаниях о взаимосвязи структуры, динамики и функции разработаны молекулярные модели функционирования рецепторных тирозинкиназ, в том числе членов семейств эпидермальных факторов роста, факторов роста фибробластов и гормона роста соматотропина при взаимодействии с лигандами и адапторными белками в сигнальных платформах. Получены и охарактеризованы моноклональные антитела к внеклеточной части рецепторной тирозинкиназы ИРР, сенсора слабощелочной среды и регулятора кислотно-щелочного равновесия. Данные антитела представляют собой хороший инструмент для дальнейших структурно-функциональных исследований рецептора, а также потенциально могут буть использованы для создания лекарств, регулирующих функции почек, желудка и поджелудочной железы. Проведен сравнительный анализ транскриптомов почек мышей дикого типа и нокаутных по ИРР в условиях до и после щелочной нагрузки. Одним из генов, функционально связанных с ИРР явлется kcnk5, кодирующий рН-зависимый калиевый канал TASK-2, который является одним из главных медиаторов респираторной хемочувствительности. Проанализированы сигнальные каскады, регулируемые белком Ag1 при регенерации и в раннем развитии мозга лягушки. В результате был определен спектр генов-мишеней регуляторного Ag1-зависимого сигнального каскада. Было установлено, что в ходе нейруляции в зачатке головного мозга ген Ag1 ингибирует экспрессию генов группы POU, участвующих в регуляции клеточного цикла. Изучено взаимодействие не известного ранее трансмембранного белка с-Answer, ген которого исчез в эволюции у теплокровных, в том числе у человека, с рецепторами FGFR4 и P2Y1. c-Answer усиливает действие FGFR4 на активацию сигнального пути, связанного с киназой Erk., а также усиливает активацию пуринэргического рецептора P2Y1. Проведен анализ белок-белковых взаимодействий CLN3, изменения в первичной структуре которого приводят к развитию болезни Баттена и предложены способы лечения этой болезни. Показано, что пептидные фрагменты RAGE (рецептора участвующего в патогенезе болезни Альцгеймера) обладают нейропротекторными свойствами. МАСТЕР-РЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ И ГЕНЫ РАЗВИТИЯ И КАНЦЕРОГЕНЕЗА НА ПРИМЕРЕ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Самым опасным свойством рака ПЖ является раннее метастазирование, которое часто происходит до выявления первичной опухоли. Рак ПЖ не поддается новейшим методам иммунотерапии, удостоенным Нобелевской премии 2018 г. и успешно работающим в других видах рака. В процессе развития рака включение и выключение ключевых генов часто происходит в порядке обратном тому, что наблюдается при эмбриогенезе. Это явление называется рекапитуляцией. Мы пытались применить этот принцип к раку ПЖ. Проведены исследования экспрессии генов в хирургических образцах рака ПЖ и фетального материала и открыли отсутствие рекапитуляции при раке ПЖ, за исключением нескольких генов. Это совпало с появившимися литературными данными, что ПАПЖ (протоковая аденома ПЖ) может представлять многочисленные болезни с одинаковым внешним видом. Мы обратили также внимание, что в большинстве хирургических образцов понижено содержание одного из ключевых факторов эмбрионального развития – мастер регулятора PDX1. Самые плохие прогнозы имеют пациенты с низким уровнем этого регулятора в опухоли. Предполагалось, что мастер ген PDX1 возможно на последних этапах развития ПАПЖ может быть ингибитором метастазирования. Для проверки такой возможности мы привлекли коллег из ИМГ РАН с моделью рыбой зебра. Небольшие размеры, короткий жизненный цикл и иммунная система эмбрионов Danio, толерантная к чужеродным антигенам, позволяет использовать для анализа клетки человека. Мы сконструировали клетки ПАПЖ, экспрессирующие PDX1, вводили их в эмбрионы Danio и с помощью флуоресцентной метки показали, что экспрессия PDX1 действительно ингибирует миграцию клеток по телу рыбки. Таким образом, открылось новое поле для борьбы с ПАПЖ, которое мы собираемся развивать уже после завершения проекта, но которое является его порождением. Другим результатом является разработка альтернативной концепции терапии рака, особенно такого, как ПАПЖ. В отличие от стандартных подходов, рассчитанных на уничтожение собственно раковых клеток, эта концепция указывает на предпочтительность использования в качестве терапевтических мишеней контакты раковых клеток и окружающей стромы. Исследовались функциональные внутриклеточные взаимосвязи двух важнейших мастер генов - PDX1 и важного, гена SOX9. Для этой цели в случае SOX9, которого много в клетках ПАПЖ, мы применяли специфическое подавление транскрипции гена и затем анализировали реакции других генов на это снижение концентрации. В результате нам удалось добавить к известным участникам сети взаимодействий SOX9 еще несколько дополнительных. В случае PDX1, которого в клетках ПАПЖ мало, наоборот, мы вводили в эти клетки экспрессирующийся ген. При этом реагировали только уже известные своими взаимосвязями с PDX1 гены. Был завершен анализ экспрессии для пяти потенциальных мастер генов (PDX1, PTF1a, SOX9, HNF1-beta, GATA4), ключевых для эмбриогенеза поджелудочной железы и гена ZEB1, важного для процесса метастазирования. Наконец, проводили анализ эпигенетического состояния промоторов отобранных мастер генов, главным образом упомянутого SOX9, поскольку известна большая роль эпигенетических процессов в регуляции их экспрессии в опухолевых и эмбриональных тканях ПЖ. Наибольшие изменения наблюдались для промоторов генов ZEB1, MDC1, SOX9 и GATA4, что указывает на вовлеченность этих промоторов в функционирование генов. ПЕПТИДОМИКА. ПЕПТИДНЫЕ ФАКТОРЫ СИСТЕМЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА Методом проточной цитофлуориметрии исследовано действие пептида мечехвоста Tach, а также его модифицированных аналогов TachY8S и TachI11S в отношении штаммов бактерий Escherichia coli ML-35p и Staphylococcus aureus 209P и линии клеток человека HEK293. Показано, что точечные замены гидрофобных остатков на остаток серина в структуре пептида позволяют свести к минимуму его цитотоксичность при сохранении мембранотропного механизма действия и высокой антибактериальной активности. Проведены исследования антимикробного действия двух пептидов – катионного защитного АМП мечехвоста (Tach) и пролин-богатого пептида PRP7(1-22) – совместно с шестью различными конвенциальными антибиотиками, относящимися к различным структурным классам и обладающими разными механизмами действия. Синергический эффект наблюдался для пептида Tach при совместном действии с эритромицином или рифампицином в отношении культуры E. coli и ванкомицином в отношении культуры S. aureus. Пептид PRP7(1-22) проявил синергический эффект совместно с рифампицином или эритромицином при действии в отношении культуры E. coli, и совместно с ампициллином, полимиксином B, ванкомицином, эритромицином или рифамицином при действии в отношении культуры S.aureus. Наиболее ярко синергизм проявлялся в паре PRP7(1-22) / рифапмицин. При этом в данном сочетании не наблюдалось усиление гемолитического эффекта. Проведен биоинформатический анализ транскрибируемых генов, кодирующих гомологи металл-ассоциированных протеаз из класса фунгализинов, синтезируемых и секретируемых наиболее экономически значимыми для сельского хозяйства грибами рода Fusarium. Отобрана структура, полученная путем трансляции нуклеотидной последовательности в аминокислотную, из вида F. graminearum, наиболее гомологичная охарактеризованному ранее ферменту фунгализину из вида F. verticillioides. Разработан способ получения рекомбинантного аналога фермента путем гетерологической экспрессии в эукариотической системе, подтверждено наличие целевой вставки и траскрипционная активность. Разработаны и оптимизированы схемы для экспрессии двух структурных типов хитиназ культурных злаков в прокариотической системе. Подтверждено наличие внутриклеточного биосинтеза целевого белка путем определения уровня хитиназной активности спетрофотометрическим методом. Проведен скрининг пула защитных пептидов растений из семейства альфа-харпининов с целью выявления ингибиторов протеолитической активности. Установлено наличие свойств ингибиторов трипсиноподобных протеаз у двух новых молекул, выделенных из зерна культурного и дикорастущего злака. Проведено сравнительное изучение роли различных растительных LTP в развитии аллергических реакций. Сыворотки пациентов с различными аллергическими реакциями на растительные пищевые продукты и пыльцу растений были исследованы методом твердофазного иммуноферментного анализа с целью обнаружения в них специфических антител класса IgE к Pru p 3 персика – главному сенсибилизатору иммунной системы человека к аллергенам класса LTP. На основании содержания специфических антител IgE к Pru p 3 были отобраны 9 сывороток пациентов, сенсибилизованных к LTP. Было определено суммарное количество иммуноглобулинов класса IgE в сыворотках. Перекрёстная реактивность антител класса IgE в сыворотках пациентов с аллергическими реакциями на Pru p 3 персика и Len с 3 чечевицы, а также на Pis s 3 гороха (липид-транспортирующий белок гороха Pisum sativum – Ps-LTP1) была оценена с помощью метода иммуноферментного анализа. Методом иммуноблоттинга подтверждено присутствие специфических IgE к указанным аллергенам в сыворотках пациентов. Полученные данные свидетельствуют о клинически значимой роли аллергенов класса LTP в сенсибилизации пациентов из московского региона. Показана способность липид-транспортирующих белков из чечевицы (Lc-LTP2), укропа (Ag-LTP) и гороха (Ps-LTP1) переносить липиды in vitro. С помощью флуоресцентной спектроскопии детектировали перенос липидов между донорными липосомами из1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (РОРС), в состав которых были включены флуоресцентный зонд тетраметил-BODIPY-меченный фосфотидилхолин (TMB-PC) и гаситель флуоресценции (бис-циклогексил)-BODIPY-меченный фосфотидилхолин (BCHB-PC), и акцепторными липосомами из 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (DMPG) или 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DMPC). Показано, что анализируемые белки Lc-LTP2 из чечевицы, Ag-LTP из укропа и Ps-LTP1 из гороха способны переносить липидные молекулы между липосомами in vitro. Все три белка эффективнее переносят отрицательно заряженные DMPG по сравнению с DMPC. При этом эффективность переноса DMPG для Ps-LTP1 выше, чем для Lc-LTP2 и Ag-LTP. Вместе с тем, липид-транспортирующий белок из укропа Ag-LTP эффективнее других белков переносил DMPC. Чтобы получить представление о составе пептидома крови при раке, проведен LC-MS/MS анализ образцов плазмы и сыворотки крови 10 пациентов с колоректальным раком и 10 пациенток с раком яичников на масс-спектрометре TripleTOF 5600+. Образцы были подготовлены по ранее разработанным нами протоколам десорбции пептидов с поверхности основных белков плазмы крови с последующими стадиями хроматографической очистки. В результате сравнения представленности и вариабельности пептидов крови при раке и в норме обнаружено, что в образцах плазмы и сыворотки крови пациентов с колоректальным раком идентифицировано 536 уникальных пептидов, а в образцах от пациенток с раком яичников – 790 уникальных пептидов. Проведено исследование изменения пулов эндогенных пептидов мха Physcomitrella patens в ответ на воздействие стрессовых факторов. Выявлен ряд потенциально биологически активных пептидов, и для отдельных из них активность доказана экспериментально. Показано, что эндогенные пептиды могут быть как эффекторами, так и модуляторами ответа мха P. patens на стресс. Обнаружено, что стрессовые фитогормоны (метилжасмонат и салициловая кислота) индуцирую образование новых эндогенных пептидов как в клетке, так и в секретоме. Показано, что в этих же условиях происходит активация убиквитин-протеасомной системы деградации белков в клетке, что может являться одним из путей биосинтеза обнаруженных пептидов. Выявленные изменения в доле посттрансляционно модифицированных пептидов, в частности, снижение количества пептидов, гидроксилированных по аминокислотному остатку пролина, могут также влиять на биологическую активность пептидома. БЕЛОК И ГЛИКАН-ОПОСРЕДОВАННЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ДИНАМИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ Предложен метод деликатного биотинилирования живых клеток с помощью встраивания в них молекул biot-CMG-DOPE, тот же реагент в течение секунд биотинилирует практически любую поверхность. Чтобы лучше контролировать процессы биотинилирования, мы детально изучили супрамолекулярную структуру biot-CMG-DOPE. В случае адсорбции на поверхности обнаружилось следующее: остаток биотина нормально спрятан в слое, однако выходит на его поверхность под действием Str. Монослой бып изучен с помощью АСМ, найденная толщина слоя 14 нм соответствует той МД модели, в которой биотин полностью утоплен. Результаты метода grazing incidence (разновидность рентгеновского малоуглового рассеяния ) не противоречили АСМ. МД симуляция показывает, что молекула biot-CMG-DOPE в слое принимает сложенную конформацию, и только ~1% этих молекул динамически принимает развернутую конформацию с дотупным остатком биотина. Разработана методология изучения гликокаликса клетки с помощью набора синтетических гликолипидов, которые отличаются природой липидной части, природой гликанов (кроме гликанов, это могут быть пептиды, фрагменты ДНК и др.), а также спейсерной группой. Спейсер сконструирован из карбоксиметилглицина, обладающего вытянутой конформацией и тем самым обеспечивает необходимое расстояние между мембраной и гликаном. Кроме того, этот спейсер благодаря отрицательному заряду не взаимодействует с белками и клетками крови, что важно для исследований ин виво. Мы также разработали метод химической модификации гликокаликса гликанами – исключительно по его поверхности, с возможностью вводить в него необходимое количество гликана. Сочетание физической (с помощью гликолипидов) и химической модификации эритроцитов дало возможность вводить гликан целенаправленно, в разные части гликокалиуса. С помощью этой методологии изучено взаимодействие антител к гликанам системы АВН с модифицированными эритроцитами, и было показано, что взаимодействие происходит преимущественно с периферийно локализованными гликанами, хотя антитела (даже IgM) способны проникать на самый нижний «этаж» гликокаликса. Показано, что гликолипид, встроенный в эндотелиальные клетки, способен в течение 1-ч контакта с монослоем переноситься на бактерии E.coli. Перенос осуществляется только на <10% популяцию бактерий; причина избирательного переноса будет изучена в дальнейшем. Проведение аналогичных экспериментов в динамике (в потоке) почти не влияло на результат. Исследовано взаимодействие целых вирионов вируса гриппа с гликановыми лигандами в составе гликочипа (400 гликанов, около 50 из которых сиалированы) с целью понять причины необратимости связывания вирионов с клеточной поверхностью, несмотря на ожидаемое их высвобождение из-за разрушения сиало-рецептора нейраминидазой вируса. Предлагаемый подход позволяет избавиться от неспецифических взаимодействий даже при длительном контакте вирионов с сиало-поверхностью. Данная методология выявила взаимодействие вирусов гриппа с гликанами, не имеющими в своем составе остатков сиаловой кислоты. Таким образом, у вируса гриппа есть потенциальные дополнительные клеточные лиганды, нерасщепляемые вирусной нейраминидазой, что объясняет необратимость связывания вириона с клеткой. БЕЛКИ БИОКАТАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ В 2018 году рентгеноструктурным анализом определена структура фрагмента АТР-зависимой Lon-протеазы из E. coli (Ес-Lon(235-584), PDB ID 6N2I). Это позволило Ес-Lon-протеазе стать первым представителем подсемейства LonА, для которого доступны структурные данные фрагментов, покрывающих полную последовательность фермента. Получено подтверждение справедливости гипотезы о том, что LonA-протеазы представляют особый подкласс AAA+-белков, содержащих наряду с классическим АТР-азным модулем часть гипотетического второго АТР-азного модуля. Получены четыре новых рекомбинантных белка, содержащих фрагменты из различных участков фермента IgA-протеазы. Исследованы их иммуногенные и протективные свойства в отношении менингококков основных эпидемических серогрупп. Показано формирование долгосрочного иммунного ответа и эффективной защиты от менингококков серогрупп А, В и С в модельных животных. Получены кристаллы каталитически неактивного мутанта олигопептидазы В из Serratia proteamaculans (PSP) PSP – S532A в комплексе с низкомолекулярным субстратом ВАРNA и с пептидным субстратом Z-Arg-Arg-рNA. Усовершенствован метод молекулярного моделирования в приложении к описанию кинетического механизма взаимодействия бутирилхолинэстеразы с экотиофатом. При помощи методов молекулярного моделирования мы обнаружили, что существует две возможных конкурирующих конформации экотиофата в активном центре бутирилхолинэстеразы. Существование первой, реакционноспособной, было предсказано ранее (run11_16). Вторая - близкая по режиму связывания к субстратам холиновой группы и обладающая лучшей оценкой энергии связывания, является ингибирующей (run6_2). Учет наличия обоих состояний позволил уточнить кинетическую схему для реакции экотиофата с бутирилхолинэстеразой, что было использовано при дизайне вариантов бутирилхолинэстеразы с фосфатазной активностью. В результате выполнения этапа проекта был выделен максимально очищенный функционально активный препарат ранее неописанного фермента - люциферазы F.heliota, а также предложены и обоснованы заключения о комплексном строении данного фермента. Люцифераза червей F. heliota является не одним полипептидом, а белковым комплексом. Данный комплекс имеет ряд посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование по нескольким сайтам, что подтверждается данными ИЭФ, указывающими на наличие нескольких изоформ с различным зарядом у комплекса люциферазы червей F. heliota. Разработан мультиферментативный каскад синтеза модифицированных нуклеотидов. Для расширения перечня доступных для синтеза нуклеотидов de novo был получен новый термофильный рекомбинантный фермент ‒ гипоксантинфосфорибозилтрансфераза HPRT из Thermus Thermophilus HB27 и исследована его субстратная специфичность. Проведен синтез новых модифицированных нуклеотидов (2-хлораденозинмонофосфата и аллопуринол-монофосфата) и исследована их структура физико-химическими методами.