КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 14-50-00131

НазваниеБелки и пептиды в постгеномную эру. Структурно-функциональные исследования для решения фундаментальных задач и направленного конструирования инновационных лекарственных средств.

РуководительГабибов Александр Габибович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ2014 - 2018

КонкурсКонкурс 2014 г. на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Реализация комплексных научных программ организаций»


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Введение Интенсивные структурные исследования геномов эукариотических и прокариотических организмов, населяющих нашу планету, обусловили новый этап в развитии биологии и ее прикладных направлений - биотехнологии, биомедицины, фармацевтики и других. В настоящее время кажется, что функциональная геномика (транскриптомика) способна дать ответы на новые вызовы современности: указать, какие механизмы обуславливают развитие заболеваний человека и животных, каталогизировать генетические вариации, наличие которых ассоциировано с рисками развития недугов человека и, наконец, разработать технологии коррекции на генетическом уровне «ошибок» природы, наличие которых обуславливает болезни. Однако при ближайшем рассмотрении становится понятно, что в гораздо большей степени современное человечество возлагает надежды на использование других составляющих живой системы - белков и пептидов. Бурный всплеск технологий манипулирования нуклеиновыми кислотами обусловил интенсивное развитие производства диагностических и терапевтических антител для ранней диагностики и эффективного таргетного лечения. Фундаментальные исследования взаимосвязи структуры и функции белков и пептидов играют ведущую роль в настоящее время и будут играть всё большую роль в будущих периодах, так как именно белково-пептидные вещества выполняют основные биологические функции в каждой живой клетке и в организме в целом. Значительный прогресс в белково-пептидной химии был определен внедрением в исследовательскую практику современного масс-спектрометрического анализа и других физико-химических методов, таких как ЯМР-спектроскопия и рентгеноструктурный анализ. Современная наука, занимающаяся изучением белков и пептидов, представляет собой комплексную дисциплину, использующую все современные методы и технологии: приёмы генной инженерии, методы структурной и квантовой химии, походы высокопроизводительного масс-спектрометрического анализа, позволяющие идентифицировать и количественно определять многие тысячи белков и пептидов, создавая их молекулярный каталог со свойственными энзиматическими модификациями, происходящим с белками и пептидами после их синтеза в клетках. Разработка новых технологий исследования белков и пептидов, изучения их посттрансляционных модификаций, количественного определения этих компонентов в биологических объектах, использования их рационального компьютерного дизайна – вот далеко не полный перечень актуальных направлений развития этой приоритетной области знания, определяющей успех современной фармацевтики и персонифицированной медицины в недалеком будущем. Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) является головным учреждением по изучению белков и пептидов в нашей стране. За время существования ИБХ РАН фундаментальные исследования в области белково-пептидной химии снискали международный авторитет и позволили разработать и внедрить в практику белковые и пептидные препараты как в нашей стране, так и за её пределами. На новом этапе своей деятельности мы предлагаем комплексный проект, который состоит из пяти неразрывно связанных с друг другом блоков и охватывает все основные направления современной науки, занимающейся изучением взаимосвязи структуры и функции белков и пептидов. Одним из важных критериев такого исследования будет являться наличие как современных конкурентоспособных технологий анализа полипептидов (масс-спектрометрия, ЯМР-спектроскопия, высокоэффективная хроматография, гетерологичная экспрессия с использованием новых векторных систем, создание трансгенных нокаутных экспериментальных животных и др.), так фундаментальных исследований в области пептидомики и физиологии рецепторов, способных выявить новые функции этого класса природных соединений и положить начало конструированию инновационных лекарственных средств. Наряду с этим, особое внимание будет уделено вопросам обратной генетики, в частности, идентификации пептидов, кодируемых короткими рамками считывания у растений, а также разработке новых алгоритмов для поиска и идентификации пептидов, кодирующихся участками длинных некодирующих РНК. Эти примеры еще раз показывают, что тесное взаимодействие некогда отдельных дисциплин является не только источником и критерием достоверности результатов фундаментальных научных исследований, но и существенно ускоряет их внедрение в практику. Белки биокаталитических систем. Современные методы комбинаторной биологии с использованием систем представления белковых молекул на поверхности фаговых частиц или эукариотических клеток позволили совершить революцию в области получения белков с заранее заданными свойствами. Появление методов функционального высокопроизводительного скрининга биокатализаторов делает систему клеточного дисплея универсальной платформой для получения новых функционально активных белков. Представление биокатализатора на поверхности эукариотической клетки сочетает в себе преимущества «фагового дисплея» с возможностью практически нативной экспрессии, правильного фолдинга и посттрансляционных модификаций сложных, зачастую много субъединичных, ферментов. Данный подход, в сочетании с методами отбора с использованием флуоресцентных репортеров, проточной цитофлуориметрии и микрофлюидики, практически неограниченно расширяет возможности поиска биокатализаторов с определенными параметрами. Таким образом, одной из задач проекта является совершенствование платформы по получению биокатализаторов de novo для обеспечения их работы в качестве лекарственных средств или биотехнологических/диагностических инструментов. Серьезной проблемой клинической практики является возникновение лекарственной устойчивости у ряда опасных вирусов и микроорганизмов. В связи с этим важной задачей является детальное изучение механизмов действия ферментов, в частности протеаз, социально значимых и опасных инфекций с целью создания точечно-направленных препаратов нового поколения. Разработанная платформа на базе клеточного дисплея позволит в дальнейшем быстро и эффективно проскринировать кандидатные препараты и оценить перспективность будущего средства с точки зрения возможности возникновения лекарственной устойчивости. В эру появления и развития персонифицированной медицины на первый план выходят методы высокоточной диагностики, в связи с чем, особенно актуальным становится поиск новых неисследованных систем «фермент-высокоспецифичный субстрат», позволяющих тонкую детекцию в различных условиях. Перспективным объектом данного направления являются биолюминисцентные системы, которые потенциально могут быть использованы и в разрабатываемой платформе клеточного дисплея. Особо актуальным представляется получение новых данных о структурах не известных ранее природных модифицированных пептидов – люциферина F. heliota и его аналогов - недавно открытой уникальной люциферин-люциферазной системы. Настоящий проект базируется на нескольких молекулах ферментов и каталитических антител, для которых в ходе его выполнения предполагается направленно изменить ряд функциональных характеристик: (1) биокатализаторы на основе матриц молекул иммуноглобулинов, обладающие функцией деградации фосфорорганических токсических молекул, (2) биокатализаторы на основе бутирилхолинэстераз с эстеролитической функцией деградации фосфорорганических токсических молекул и наркотических веществ, (3) биокатализаторы с протеолитической функцией, обладающие высокой специфичностью к определенным аминокислотным последовательностям и способные специфически процессировать генно-инженерные белки, протеазы, связанные с развитием инфекционных и социально-значимых заболеваний. (4) Биокатализаторы на основе ферментов нуклеинового обмена, обеспечивающие каскад превращений сахаров в биологически важные неприродные нуклеозиды и нуклеотиды. Рецепторные и сигнальные белки. Анализ структуры и функции. Рецепторные белки являются ключевыми компонентами сенсорных систем организма, а также механизмов межклеточных сигнальных взаимодействий. В рамках данного направления мы планируем изучить структуру и функцию рецепторных тирозинкиназ (РТК), а также сигнальных белков вовлеченных в эмбриональное развитие и регенерацию. Предлагаемые исследования базируются на наших предыдущих работах, являющихся полностью оригинальными и приоритетными в области изучения рецепторных и сигнальных белков. Полученные результаты будут иметь важное значение как для фундаментальной науки, так и для возможного последующего использования в различных биомедицинских приложениях. РТК вовлечены в ряд важных биологических процессов, обеспечивающих рост, пролиферацию и дифференцировку клеток. Во время онкогенеза эти процессы часто нарушаются из-за мутаций в мембранном, примембранном и киназном доменах. Из-за методологических трудностей детальные механизмы функционирования РТК остаются невыясненными. В рамках Проекта мы впервые ставим задачу получения структурно-динамической информации для связки трансмембранного и цитоплазматического доменов одного из представителей РТК, — киназы FGFR3 человека. Совместное использование ЯМР-спектроскопии и методов молекулярного моделирования позволит оценить взаимное влияние примембранных участков и трансмембранных фрагментов на конформационную динамику димеров FGFR3 в липидных бислоях, а также оценить потенциальный эффект мутаций на взаимодействия внутриклеточных киназных доменов исследуемого рецептора. Также будет изучена пространственная структура примембранных регионов в связке с трансмембранными доменами РТК FGFR3, VEGFR2 и EphA2 человека для выявления роли цитоплазматических примембранных регионов в механизмах активации РТК разных семейств. В результате будут выдвинуты гипотезы о роли отдельных аминокислотных остатков в структурных изменениях, контролирующих активность РТК, и предложены возможные мутации для проверки этих гипотез на полноразмерных рецепторах в клетках. Особенности функционирования мутантных форм РТК будут изучены в клетках эукариот с применением методов конфокальной микроскопии и проточной цитометрии. Нами ранее было открыто свойство считавшегося "сиротским" тирозинкиназного рецептора ИРР (близкого структурного гомолога рецептора инсулина) активироваться при повышении рН внеклеточной среды до рН 7.9, что существенно выше физиологического диапазона гомеостаза крови. В экспериментах с ИРР-нокаутными мышами, мы показали, что у них нарушена экскреция избыточных оснований при экспериментально-индуцированном алкалозе и данный эффект связан с нарушением функции почек. Помимо почек, ИРР также экспрессируется в отдельных клеточных популяциях желудка, поджелудочной железы и нервной системы. рН-зависимая активация ИРР и его высокоспецифичная экспрессия в организме позволила сформулировать гипотезу о роли анионов гидроксила в качестве сигнальной молекулы, одной из мишенью которой является ИРР. Для изучение роли локального изменения рН внеклеточной среды в межклеточной и системной передаче сигналов планируется получить трансгенных мышей, которые будут экспрессировать флуоресцентный белок - рН сенсор, располагающийся на поверхности клеток. Создание таких животных впервые позволит точно и с высоким разрешением измерять кислотность среды in vivo в условиях реального времени мультифотонной флуоресцентной микроскопией. Будут также получены и проанализированы гибридные линии мышей с флуоресцентным рН сенсором и мышей, нокаутных по рецептору ИРР, у которых нарушена регуляция кислотно-щелочного равновесия. Предлагаемые исследования позволят получить принципиально новую информацию о роли слабощелочной среды в передаче сигналов, а также создадут в Институте инфраструктуру для получения и анализа генетически измененных животных. В рамках данного направления планируется также исследование сигнальных механизмов вовлеченных в индивидуальное развитие и регенерацию, в частности поиск и изучение мишеней сигнальных белков семейств Agr и Noggin4. Как было недавно показано в исследованиях, проводимых в нашем Институте на моделях низших позвоночных (рыбы и амфибии), данные белки являются секретируемыми сигнальными факторами, регулирующими, как раннее развитие головного мозга, так и регенерацию больших придатков тела у модельных низших позвоночных (рыб и амфибий. Имеются предварительные данные о том, что факторы Agr способны регулировать сигнальный пути, связанные с функционированием тирозинкиназных рецепторов, а белок Noggin4 является модулятором сигнальных путей, активируемых секретируемыми белками семейства Wnt. В то же время, несмотря на потенциально важное физиологическое значение белков Agr и Noggin4, их непосредственные молекулярные мишени остаются по большей части не известными. В ходе настоящего проекта предлагается провести поиск потенциальных мишеней белков Agr и Noggin4, изучить механизмы их взаимодействия с этими мишенями, а также выяснить физиологические функции таких взаимодействий на моделях низших позвоночных - эмбрионах рыб и амфибий. Пептидомика. Пептидные факторы системы врожденного иммунитета. Одной из важных задач, которую предстоит решить в рамках настоящего проекта, является разработка технологий каталогизации пептидомов и определения функции отдельных пептидов как самостоятельных мощных регуляторов физиологически важных процессов в организме человека, животных и растений. Пептиды обнаружены в клетках всех живых организмов и участвуют во всех жизненно важных процессах в организме. Они участвуют в работе нервной, эндокринной и иммунной систем, регулируют процессы клеточной активности, роста и развития организма и участвуют в защитных реакциях и различных сигнальных системах у растений, животных и человека. Следует отметить, что пептиды вследствие особенностей своего строения разнообразны по химической структуре, физико-химическим характеристикам, биологический свойствам и функциональной роли. Такое разнообразие и определяет широкий спектр методов и технологий, используемых в современной протеомике и пептидомике. Одной из фундаментальных научных проблем, решаемых в рамках изучения структуры и функций пептидов, является расшифровка ключевых молекулярных механизмов врожденного иммунитета. Эндогенные антимикробные пептиды принадлежат к наиболее эволюционно ранним факторам системы врожденного иммунитета, выполняющими как прямую эффекторную (антибиотическую), так и регуляторную (иммуномодуляторную) функции. В рамках настоящего проекта будет проведено исследование взаимосвязи структуры и биологических функций ряда эндогенных защитных белков и пептидов как растительного, так и животного происхождения, а также их аналогов, будут разработаны биотехнологические способы их получения и изучены молекулярные механизмы их действия. Среди молекулярных факторов системы врожденного иммунитета растений особый интерес у исследователей вызывают белки, связанные с патогенезом (PRP), в частности, липид-транспортирующие белки, имеющие аллергенную природу. Обнаружение и изучение свойств новых растительных аллергенов является еще одной важной научной задачей проекта. Детальное изучение механизмов действия защитных белков и пептидов позволит углубить понимание молекулярных основ функционирования системы врожденного иммунитета и создаст предпосылки для разработки лекарственных средств нового поколения на их основе. Еще одной фундаментальной задачей проекта является изучение пептидного состава сыворотки и плазмы крови с использованием методов современной пептидомики. Одной из основных задач проекта является выяснение того, как устроен пептидом, каковы пределы изменения концентраций отдельных пептидов и их белков-предшественников и насколько значимы индивидуальные отличия пептидомов сыворотки от разных доноров крови. Помимо этого, интересным является вопрос об индивидуальной качественной и количественной вариабельности состава пептидома как между индивидуумами, так и для одного индивидуума в разное время. Понимание вариативности пептидного пула в норме может стать основой для дальнейшего анализа пептидомов при различных патологиях. Большой интерес привлекает возможность разработки системы пептидных биомаркеров онкологических заболеваний. Различия в протеомах клеток связаны не только с экспрессией, но также с процессами альтернативного сплайсинга, пост-трансляционных модификаций и процессов редактирования мРНК. Особый интерес вызывают пептиды – продукты трансляции коротких рамок считывания (sORF), которые обладают значительным регуляторным потенциалом. Однако, идентификация пептидов, кодируемых sORF, практически невозможна с помощью стандартных протеомных технологий. Подход, основанный на идентификации пула эндогенных пептидов в клетке, транскрипционном профилировании и биоинформатической обработке результатов позволит определить и идентифицировать SEPs (sORF-encoded polypeptides), а также определить их функции и роль в защите и регуляции различных процессов, происходящих в растительной клетке. Кроме того, использование мха Physcomitrella patens в качестве объекта исследования позволит эффективно провести функциональный анализ идентифицированных SEPs с помощью нокаута областей генома, содержащих соответствующие рамки считывания. Мастер-регуляторные белки и гены развития и канцерогенеза на примере поджелудочной железы. Данный проект посвящен молекулярно-генетическим исследованиям инфильтрирующей протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC), одной из самых опасных опухолей человека. Существует острая необходимость в новых подходах к терапии PDAC. Для этого необходимы более детальные молекулярные данные по биологическим особенностям этой опухоли, которая имеет чрезвычайно сложный характер. Известно множество генетических дефектов, выявленных в процессе полногеномного секвенирования генома PDAC. Однако нет уверенности в том, что эти гены и соответствующие белки являются необходимыми и достаточными для инициации и развития опухоли. Наиболее перспективным направлением терапии PDAC могло бы быть воздействие на так называемые мастер регуляторные гены и кодируемые ими белки – мастер регуляторы, которые в процессе развития организма включают программу развития той ткани, в которой образовалась данная опухоль. Эта программа включается в клетках предшественниках этой ткани. В случае PDAC это предшественники протоковых клеток поджелудочной железы. Однако, в случае поджелудочной железы точно неизвестны ни клетки предшественники протоковых клеток, ни мастер регулирующие гены и белки, которые могли бы быть мишенью воздействия. Задачей данного направления является выявление мастер регуляторных генов и кодируемых ими белков, ответственных за включение морфогенеза поджелудочной железы в процессе эмбрионального развития человека, исследование их экспрессии в норме и дисрегуляции в процессе канцерогенеза, а также исследование возможностей использования мастер генов в качестве мишеней для диагностики и терапии рака поджелудочной железы, в том числе PDAC. Мы выдвигаем гипотезу, что ключевые для эмбрионального развития гены – мастер гены и белки являются также ключевыми для инициации и эволюции раковой опухоли, включая метастазирование. Рак часто описывают как проблему биологии развития. Неоднократно отмечалось что гены и белки, которые работают в эмбриональных клетках и затем выключаются в клетках зрелых тканей, включаются в раковых клетках опухолей этих тканей. Эффект наблюдаемой «реверсии» опухоли может заключаться в том, что среди прочих событий (hallmarks), приводящих к превращению клетки в раковую, может выключаться мастер ген стволовых клеток. Это будет приводить к запрету дифференцировки стволовой клетки, «заморозке» ее эмбрионального фенотипа. Чрезвычайно важным свойством эмбрионального состояния является способность к эпителиально-мезенхимальному переходу, который, как полагают, является основой метастазирования. Выявление мастер генов и белков могло бы открыть возможность включения диффeренцировки раковых клеток путем генно-терапевтического введения в них активно экспрессирующегося варианта этого гена. Это могло бы также привести к снижению метастатического потенциала опухоли. Мы собираемся получить информацию о потенциальных мастер генах и белках поджелудочной железы как биоинформационным поиском генов и белков с подобными свойствами, так и экспериментальным путем прямого сравнения экспрессии генов в образцах развивающейся поджелудочной железы человека на разных стадиях и в образцах PDAC и ее метастазов, полученных хирургическим путем. Гены, которые не экспрессируются на ранних стадиях развития, включаются на поздних и не экспрессируются в PDAC и метастазах, могут служить кандидатами для поиска среди них мастер регуляторных генов. Выявление таких генов будет сопровождаться идентификацией соответствующих белков. В отличие от большинства исследований, в которых проводилось сопоставление эмбрионального материала из модельных животных и хирургическим человеческим материалом, наше исследование будет проводиться целиком на человеческом материале. Планируемый анализ человеческого материала и имеющийся у нас опыт сравнения образцов эмбриональной и опухолевой ткани позволят избежать ошибок, которых опасаются многие исследователи, работающие в этой области, поскольку степень, в которой развитие панкреатической железы у мыши является хорошей моделью для человека, не ясна в полной мере. Экспериментально планируемая работа будет основываться на многолетнем опыте подобных экспериментальных исследований и сложившемся стабильном коллективе исследователей из разных Институтов, который дает возможность выполнить все намеченные экспериментальные исследования по клеточным, генетическим работам и по работам с эмбриональным и хирургическим материалом. Белок и гликан-опосредованные клеточные взаимодействия в динамических условиях. Многие физиологически значимые взаимодействия происходят в динамике, а именно в потоке крови или других жидкостей, когда один из партнеров (клетка, микровезикула, частица липопротеина, бактерия и др.) движется относительно второго (в первую очередь, клеток эндотелия и эпителия). Чтобы, несмотря на высокую скорость движения, произошло взаимодействие рецептора одной клетки с контр-рецептором на другой, требуется соблюдение специфических условий, таких как высокие константы скорости прямой реакции образования комплекса, облегченный докинг, а также мультиточечность связывания клеток в районе контакта. Классическим примером влияния скорости движения на характер взаимодействия является селектин-опосредованный роллинг лейкоцитов на эндотелии, - процесс, который в статических условиях не происходит вовсе. Известны примеры ярко выраженного положительного влияния движения бактерий на их связывание с гликанами-лигандами на клетках-мишенях респираторного эпителия. Кроме того, научным сообществом постепенно (но крайне медленно) осознается принципиальная значимость подвижности клеток в процессах метастазирования. Можно предположить, что многие другие взаимодействия происходят в динамике иначе, чем в отсутствие движения. В то же время, их экспериментальное изучение практически всегда проводится в статических условиях, где скоростная компонента не учитывается вовсе. Поэтому, фундаментальное изучение молекулярно-клеточных взаимодействий в динамике безусловно приведет к открытию новых явлений и процессов, или по-новому оценивать уже известные. Несмотря на очевидную актуальность, исследований в этой области до сих пор проводятся мало. Данный проект направлен на систематическое изучение клеточных процессов, для которых динамическая (скоростная) компонента взаимодействия является существенной и даже определяющей; для этого в первую очередь необходимо будет создать методическую базу, то есть разработать методы и приборы, дающие возможность изучать молекулярно-клеточные взаимодействия в динамических условиях, приближенных к физиологическим, а также непосредственно in vivo. Далее, с помощью этих методов в условиях потока будет изучаться ряд объектов, для функционирования которых можно предположить существенный вклад динамической компоненты, в частности: • циркулирующие опухолевые клетки (их траектории и особенности динамической адгезии in vivo и ингибирование адгезии в модельных системах in vitro), • симбиотические бактерии (как они находят «свои» эпителиальные клетки), • вирус гриппа (его проникновение через толщу гликокаликса, а также механизм заякоривания на сиалорецепторах в условиях противодействия мукоцилиарного эскалатора), • липопротеины низкой плотности (особенности переноса холестерола и формирования атекросклеротических поражений сосудов – и то и другое в условиях потока, • липосомы (изучение их истинных траекторий in vivo, поиски способов уменьшения неспецифической адгезии и увеличения специфической благодаря накопленным знаниям о динамике в кровотоке). Будет проводиться идентификация белков, опосредующих динамические адгезионные свойства, эти белки будут исследоваться с использованием всего доступного комплекса физико-химических методов. На основании полученных экспериментальных данных и с помощью компьютерного симулирования будет создана физико-математическая теория данного типа процессов, которая не только объясняла бы биологические явления, но имела предсказательную силу. Кроме того, будет проводиться поиск и переосмысление литературных данных, где динамическая составляющая была экспериментально изучена, но ей по тем или иным причинам не придали значения. Фундаментальные исследование в рамках данного проекта естественным образом транслируются в биомедицину, это: • возможность моделировать процессы, происходящие на поверхности имплантов; • возможность целенаправленно влиять на траффикинг липосом; • новые стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями, атеросклерозом, метастазированием, остаточной резидуальной болезнью; • особо отметим, что знание механизмов динамических взаимодействий сделает возможным перестроить статические системы изучения активности лекарств на динамические, и тем самым более адекватно и эффективно проводить скрининг лекарственных кандидатов, а в перспективе также и разработку принципиально новых терапевтических стратегий, сочетающих действие лекарства с оптимизацией физических условий его применения. Поставленная задача является принципиально новой, в таком обобщенном виде ее до сих пор нигде не формулировали.

Ожидаемые результаты
Белки биокаталитических систем. Одним из результатов проекта будет разработка автоматизированного высокопроизводительного скрининга функционально активных биокатализаторов (ферментов и антител) с помощью системы дрожжевого дисплея. Будет разработана система векторов для дрожжевого дисплея ферментов и иммуноглобулинов, проведена оптимизация функциональных элементов (изотип цепи, промоторы, лидерные пептиды, якоря, флуоресцентные белки). Полученные вектора будут оригинальными и не имеют прямых аналогов в мире. Будет разработана система скрининга индивидуальных клеток методом проточной цитофлуориметрией-сортингом (FACS). Для адаптации метода для скрининга биокатализаторов будет использована эмульсионная система вода/масло/вода. Разработанный метод может быть использован как для скрининга библиотек биокатализаторов, так и для фундаментальных исследований биохимических процессов проходящих в примембранной области. Будет проведен скрининг библиотек биокатализаторов с последующим всесторонним структурно-функциональным анализом отобранных клонов. В результате отбора будут получены биокатализаторы с улучшенными кинетическими характеристиками и специфичностью. Очевидно, что создание бутирилхолинэстеразы и антитела, способных связывать или разрушать фосфорорганические отравляющие вещества, позволит решить проблему эффективного биологического антидота. Создание энтерокиназы с улучшенными каталитическими параметрами позволит получить биотехнологически важный продукт для процессинга различных слитных рекомбинантных белков. Получение антитела-протеазы, способного деградировать поверхностный гликопротеин gp120 ВИЧ-1, позволит вплотную подойти к проблеме "каталитической вакцины". Ряд наиболее эффективных селектированных биокатализаторов будут закристаллизованы и с помощью рентгеноструктурного анализа получены их трехмерные изображения. В результате выполнения проекта впервые будет охарактеризована структурно-функциональная организация АТФ-зависимой биолюминесцентной системы нового типа, обнаруженной нами у червей Fridericia heliota. Описание 2-го в мире (отличного от светляков) механизма АТФ-зависимой люминесценции дополнит теоретические знания о биохимии процесса светоизлучения с участием АТФ и расширит практическое применение АТФ-фиксирующих тест-систем. Будут исследованы необычные свойства LonА-протеиназ (уникальных представителей ААА(+)-белков, с необычной доменной организацией) обеспечивающие сопряжение функционирования единственного нуклеотид-связывающего и двух альфа-спирализованных доменов. Исследование их активности, возможно, позволит сделать более глубокие выводы о механизме катализа. Кинетические и структурные исследования ВИЧ-1 протеазы и ее лекарственно-устойчивых природных мутантов позволят выбрать вектор для направленной терапии. В дальнейшем, моделирование возникновения лекарственной устойчивости на базе разработанного клеточного дисплея позволит провести в 2D формате эффективный широкомасштабный скрининг кандидатных препаратов. Будут получены модифицированные катализаторы на основе ферментов нуклеинового обмена, обеспечивающие каскад превращений сахаров в биологически важные неприродные нуклеозиды и нуклеотиды. Использование биокаталитических методов в создании аналогов природных нуклеозидов и нуклеозидных антибиотиков являются одним из наиболее перспективных направлений современных фармтехнологий. Будет проведен структурно-функциональный анализ олигопептидазы В из грам-отрицательного психрофильного микроорганизма Serratia proteamaculans (PSP). Исследуемая протеиназа из непатогенного для человека микроорганизма имеет высокую степень гомологии с олигопептидазами В возбудителей опасных инфекционных заболеваний человека — чумы, брюшного тифа и сальмонеллеза, в связи с чем может рассматриваться как модель для создания тест систем и поиска протективных препаратов против вышеуказанных инфекций. Дальнейшее изучение структуры и механизма катализа протеазы, специфичной к иммуноглобулинам А (IgA) и препятствующей иммунитету человека эффективно бороться с рядом серьезных инфекций, позволит предложить эффективные высокоспецифичные ингибиторы. Таким образом, полученные в ходе выполнения проекта данные могут дать ответы на фундаментальные вопросы энзимологии об эволюции активного центра фермента и найти прикладное применение для защиты организма от патогенных высокомолекулярных соединений. Рецепторные и сигнальные белки. Анализ структуры и функции. Исследование клеточной рецепции и механизмов передачи межклеточных и внутриклеточных сигналов является одной из бурно развивающихся областей современной молекулярной биологии и молекулярной медицины. Большая часть создаваемых в настоящее время лекарств, в частности для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, рака, неврологических и психических заболеваний базируются на фундаментальных знаниях полученных при изучении структуры и функции рецепторов. Хорошо известно, что каждый новый открытый рецептор становится потенциальной мишенью для поиска лекарств. В рамках нашего направления мы планируем решить задачи, способные обеспечить прорыв в изучении отдельных рецепторных и сигнальных систем. При этом структурные, то есть химические по сути, подходы будут сочетаться с функциональным анализом in vivo, который даст возможность получить информацию о физиологии сигнальных систем. Будут разработаны новые подходы для одного из перспективных направлений структурной биологии – ЯМР спектроскопии мембранных белков. В результате удастся получить новые знания о пространственной структуре и механизмах функционирования белков семейства РТК. Эти белковые рецепторы играют важную роль в процессе жизненного цикла клеток и в их коммуникациях в норме и в различных патологиях (онкология, нейродегенеративные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания и др.). Полученные фундаментальные знания о структуре белков позволят перейти к задаче биоинженерии мембранных белков для различных медицинских, биотехнологических и других применений, связанных с созданием интерфейсов между живыми организмами и электронными устройствами. Будет получен новый инструмент для анализа регуляции кислотно-щелочного равновесия, который позволит ранее невозможое измерение рН среды внутри тканей и органов in vivo в физиологических условиях в реальном времени. Этим инструментом станет новая линии мышей, несущих в себе белки, кодирующие флуоресцентные рН сенсоры. В этой системе будет изучена сигнальная роль локальных изменений концентрации гидроксил-анионов, а также механизмы передачи сигналов клеточным сенсором щелочной среды - рецепторной киназой ИРР. Если будет подтверждена наша гипотеза о том, что гидроксил может служить сигнальной молекулой или нейромедиатором в организме, это откроет принципиально новую область в молекулярной физиологии. В результате реализации проекта будут также изучены сигнальные пути ранее открытых нами белков семейств Agr и Noggin4. Данные белки являются секретируемыми сигнальными факторами, регулирующими как раннее развитие головного мозга, так и регенерацию больших придатков тела у модельных низших позвоночных (рыб и амфибий). Мы получили данные о том, что факторы Agr способны регулировать сигнальные пути, связанные с функционированием тирозинкиназных рецепторов, а белок Noggin4 является модулятором сигнальных путей, активируемых секретируемыми белками семейства Wnt. Поскольку эти сигнальные пути контролируют множество аспектов жизнедеятельности клеток в эмбриональном развитии, при регенерации, а также при различных патологиях, например, при канцерогенезе, данные полученные в ходе реализации проекта внесут значительный вклад в понимание механизмов управления указанными процессами. Пептидомика. Пептидные факторы системы врожденного иммунитета. В рамках данного направления проекта планируется исследование взаимосвязи структуры и функции ряда эндогенных защитных пептидов и белков. Решение фундаментальной научной задачи, направленной на расшифровку молекулярных механизмов функционирования системы врожденного иммунитета, позволит создать предпосылки для разработки новых лекарственных средств на основе антимикробных пептидов (AMP). Проведение всего объема планируемых фундаментальных исследований позволит подробно охарактеризовать свойства ряда защитных белков и пептидов. Будут созданы плазмидные конструкции для гетерологической экспрессии ряда рекомбинантных бета-шпилечных AMP, а также их мутантных аналогов. Будут получены штаммы-продуценты рекомбинантных бета-шпилечных AMP. Будут оптимизированы условия экспрессии бета-шпилечных АМП в бактериальной системе, будет осуществлена препаративная экспрессия исследуемых пептидов, будет получена биоомасса для выделения целевых продуктов и проведены их выделение и очистка. Будут получены бета-шпилечные AMP в бесклеточной белок-синтезирующей системе. Будут созданы кодирующие генно-инженерные конструкции, подобраны условия реакции бесклеточного синтеза, проведена препаративная наработка и очистка целевых пептидов. Использование бесклеточных белок-синтезирующих систем позволит преодолеть методическую проблему быстрого скрининга бактериальных и дрожжевых клонов, экспрессирующих высокоактивные AMP. Будет проведено тестирование антимикробной активности полученных аналогов пептидов в отношении грамположительных и грамотрицательных штаммов бактерий. Для исследуемых AMP будет изучена динамика бактерицидного действия, а также определены значения минимальной бактерицидной концентрации. Будет проведено тестирование гемолитической активности полученных аналогов в отношении свежевыделенных человеческих эритроцитов. С использованием плоских бислойных липидных мембран, моделирующих мембраны бактерий и млекопитающих, будет изучено влияние модифицированных аналогов бета-шпилечных АМП с заданным профилем амфифильности на барьерные свойства БЛМ разного липидного состава. Будет проведено тестирование цитотоксического действия аналогов бета-шпилечных AMP в отношении нормальных клеток млекопитающих. Для каждого пептида будет определена величина IC50, что позволит дополнить сведения о терапевтической ценности полученных аналогов. Будет проведено определение преобладающих механизмов действия бета-шпилечных AMP. Будут исследованы структуры и механизмы порообразования бета-шпилечных AMP в мембранах различного липидного состава методами спектроскопии кругового дихроизма, Фурье-ИК и флуоресцентной спектроскопии.Будет изучена роль отдельных аминокислотных остатков в механизме цитотоксического действия, их вклад в процессы связывания пептида с модельными мембранами различного состава и мембранами природного происхождения с помощью флуориметрических и электрофизиологических методов анализа. Впервые будут получены приоритетные данные о механизме действия ряда AMP. Будет исследована антимикробная активность при совместном использовании бета-шпилечных АМП и ряда классических антибиотиков, относящихся к различным структурным классам. Будет определен коэффициент фракционной ингибирующей концентрации. Будет исследовано влияние совместного использования препаратов на уровень гемолитической активности. Ожидаемые в рамках выполнения проекта результаты позволят предложить и обосновать варианты их возможного применения в медицине и ветеринарии. Особое внимание будет уделено изучению растительных белков, связанных с патогенезом (PRP), в частности липид-транспортирующих белков (LTP), являющиеся причиной развития аллергических реакций на пыльцу, растительные продукты и латекс. Поиск и изучение структурно-функциональных свойств LTP и других защитных пептидов растений, исследование их взаимодействия с липидными лигандами имеют важное фундаментальное значение для понимания функционирования системы врожденного иммунитета растений. Будут осуществлены поиск и структурная характеристика новых изоформ липид-транспортирующих белков гороха Pisum sativum и укропа Anethum graveolens. Будет изучено связывание LTP растений (чечевицы, укропа и гороха) с липидными молекулами (жирными кислотами, лизофосфолипидами и др.) методом флуоресцентной спектроскопии. Будут получены штаммы-продуценты рекомбинантных аналогов LTP укропа Anethum graveolens (Ag-LTP), LTP амброзии полыннолистной Ambrosia artemisiifolia (Aa-LTP) и LTP гороха Pisum sativum (Ps-LTP), подобраны оптимальные условия экспрессии целевых белков, проведены их выделение и очистка. Будут получены рекомбинантные аналоги Ag-LTP и Ps-LTP, тотально меченные стабильными изотопами. С использованием рекомбинантного аналога белка, тотально меченного стабильными изотопами, методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии будет проведено исследование пространственной структуры Ag-LTP и Ps-LTP как в свободном состоянии, так и в комплексе с липидными молекулами. Будет проведен поиск, изучение структуры, биологической активности и механизмов действия новых защитных пептидов сорного злака ежовника Echinochloa crusgalli L. и других дикорастущих злаковых культур. Будет проведено сравнительное изучение роли LTP гороха, чечевицы, укропа, персика и амброзии в развитии аллергических реакций. Будет определено суммарное количество иммуноглобулинов класса E в сыворотках пациентов с аллергией. С помощью методов иммуноблоттинга и твердофазного иммуноферментного анализа будут выявлены специфические антитела класса IgE в сыворотках пациентов. Будет проведено исследование перекрестной реактивности антител класса IgE. Высвобождение медиаторов из тучных клеток или базофилов крови пациентов с аллергией в присутствии рекомбинантных LTP будет исследовано путем измерения концентрации гистамина или β-гексозаминидазы. Будет изучена способность LTP растений переносить липидные молекулы с использованием метода флуоресцентной спектроскопии. Обнаружение и изучение свойств новых растительных аллергенов является приоритетным направлением современной экспериментальной медицины, имеющим важное прикладное значение. Широко используемые для проведения аллергодиагностики экстракты растительных тканей представляют собой многокомпонентные смеси, сложность стандартизации которых зачастую является причиной ложно положительных или ложно отрицательных результатов. Природные и рекомбинантные белковые растительные аллергены могут стать основой для создания новых диагностических тест-систем, а также использоваться для специфической аллерговакцинации, направленной на снижение реактивности организма. Ожидаемые в рамках выполнения проекта результаты позволят предложить и обосновать варианты их возможного применения в медицине и ветеринарии. Будут оптимизированы комбинации методов выделения пептидов из сыворотки и плазмы крови и хромато-масс-спектрометрического анализа. Будет изучено влияние пористости сорбента и его селективности, будет осуществлен подбор буферных систем для IEX, соотношений сыворотка/сорбент и условий RP SPE. Будут исследованы возможности повышения эффективности разделения пептидов из сыворотки и плазмы крови посредством увеличения числа теоретических тарелок при хроматографии, а также варьирования режимов масс-спектрометрического анализа. Будет проведено исследование многокомпонентности пептидного пула после пробоподготовки на основе отбора родительских пептидных ионов для фрагментационного анализа псевдослучайным процессом. Будет проведен количественный анализа пептидомов крови методом безметочной квантификации по принципу независимого от данных анализа (DIA) в формате анализа фрагментных ионов от набора прекурсоров в узком диапазоне m/z. Будут изучены индивидуальная и групповая вариабельность пептидома сыворотки и плазмы крови, его постоянство во времени, влияние на систему внешних и внутренних факторов. Будет изучена связь пептидома сыворотки и плазмы крови с патологиями на основе имеющейся коллекции образцов крови больных колоректальным раком и раком яичников. Будет проведена идентификация пула эндогенных пептидов, выделенных из трех типов клеток мха Physcomitrella patens – гаметофоров, протонемы и протопластов. В клетках мха Physcomitrella patens будут идентифицированы короткие рамки считывания, обладающих кодирующим потенциалом. Будет проведе анализ межгенных участков, нетранслируемых регионов генов, а также областей основных рамок считывания. Будет выполнено транскрипционное профилирование трех типов клеток – гаметофоров, протонемы и протопластов – для подтверждения транскрипции идентифицированных в геноме коротких рамок считывания. Будет проведен анализ биологической активности идентифицированных пептидов, выделенных из трех типов клеток мха Physcomitrella patens – гаметофоров, протонемы и протопластов. Выполнение работ в рамках данного направления проекта позволит продвинуться в понимании молекулярных механизмов реализации функций пептидов и проследить взаимосвязь между их биологической активностью и структурой. Результаты данного фундаментального исследования откроют путь для создания принципиально новых пептидных лекарственных средств. Мастер-регуляторные белки и гены развития и канцерогенеза на примере поджелудочной железы. Будут созданы коллекции эмбриональных тканей человека на разных стадиях развития поджелудочной железы и во взрослом состоянии; Будут созданы коллекции хирургических образцов рака поджелудочной железы и метастазов; Будут каталогизированы данные по генам и белкам, вовлеченным в канцерогенез и эмбриогенез поджелудочной железы и проведена идентификация потенциальных мастер генов и белков; Во всех образцах будут проведены анализы экспрессии потенциальных мастер генов и белков, вызывающих эмбриоподобное состояние опухоли; Будет проведен экспериментальный анализ генов кандидатов с пониженной экспрессией в опухолях по сравнению с поздними стадиями развития поджелудочной железы на способность вызывать трансдифференцировку в культурах клеток рака поджелудочной железы. Для этой цели будут созданы генетические конструкции, изменяющие экспрессию потенциальных мастер генов, которые затем будут вводиться в раковые клетки в экспериментах in vitro и in vivo; Будет проведен анализ эпигенетичекого состояния промоторов соответствующих генов и сделаны выводы о роли эпигенетических процессов в их экспрессии; Будет проведено экспериментальное исследование экспрессии генов и белков, характерных для эпителиально-мезенхимального перехода в эмбриональных тканях, опухолях и метастазах (выявленных на основании биоинформационного анализа) и будут сделаны выводы относительно потенциального участия этого процесса в процессе метастазирования; На экспериментальных животных с привитыми опухолями , будет проведено исследование влияния выявленных потенциальных генов эпителиально-мезенхимального перехода на метастазирующую способность опухоли. Результаты планируемых исследований будут иметь фундаментальную важность и представлять очевидный практический интерес для разработок новых подходов к терапии онкологических заболеваний. Белок и гликан-опосредованные клеточные взаимодействия в динамических условиях. Значимость результатов для фундаментальной биологии. • По существу, создается новое направление в клеточной биологии. Все процессы межклеточного взаимодействия, которые происходят в крови, следует рассматривать с учетом влияния движения клеток на их специфическую адгезию в широком понимании этого термина. То же самое относится к биохимии бактерий, вирусов и частиц (липопротеинов, эндосом, апоптотических телец и т.п.), которая тесно переплетена с биофизикой их движения в потоке жидкости. Результатом реализации данного проекта станет новый взгляд на хорошо известные процессы, а также открытие новых. • Будет создана методология изучения биохимических взаимодействий в потоке жидкости, показаны сферы применимости для этого различных приборов. Значимость результатов для медицины и здравоохранения. • Хорошо известно несоответствие данных об активности лекарственных кандидатов при переходе от тест-систем in vitro к in vivo, где большая часть клеточных взаимодействий происходит в движении. Изучение молекулярно-клеточных взаимодействий в динамике открывает возможность проводить скриннинг потенциальных лекарств в условиях, приближенных к условиям in vivo. Этот подход может быть приложен к разработке лекарств, действующих на стадиях межклеточного взаимодействия. В целом, этот подход способен сократить сроки создания новых лекарств на год или даже больше. • Знание механизмов действия лекарств в потоке крови в перспективе открывает возможность разработки принципиально новых терапевтических стратегий, сочетающих действие химического препарата с оптимизацией физических условий его применения. • Борьба с инфекционными заболеваниями: здесь также речь идет о анти-адгезионных препаратах нового поколения и о терапевтических стратегиях, в которых будет применяться сочетание приема лекарства с физиотерапией. • Замещение патогенной флоры в ЖКТ при терапии с помощью бактерийных терапевтиков несомненно относится к динамическим процессам. Учитывая динамический фактор, мы сможем значительно повысить эффективность этой терапии. • Атеросклероз: нет сомнений, что движение частиц липопротеинов влияет на их биохимическое взаимодействие с макрофагами, эндотелием и т.д., в том числе при патологии. Знание динамической компоненты взаимодействия может открыть новые перспективы в лечении атеросклероза и методов нетравматической для пациентов борьбы с образовавшимися тромбами. • Целенаправленное улучшение свойств имплантирумых материалов (в первую очередь, кардиостентов), находящихся долгое время во взаимодействии с кровью; изучение соответствующих процессов ex vivo в динамике не проводилось, а in vivo дает лишь конечный результат, но не знание меанизма. • Изучение динамического поведения циркулирующих опухолевых клеток, а также опухолевых клеток при минимальной резидуальной болезни даст онкологам возможность избирательно и надежно элиминировать эти клетки, тем самым останавливая развитие рецидивов рака на самых первых стадиях. • Фертилизация: ее эффективность (как в медицине, так и в животноводстве) можно будет увеличить, проводя искусственное оплодотворение в условиях, оптимальных для скорость-зависимого процесса узнавания яйцеклетки сперматозоидами. • Возможно, ограниченное использование липосомальной терапии связано с тем, что не учитывается динамический характер побочных взаимодействий липосом в кровеносных сосудах. Переход на новый уровень конструирования липосом, принимающий в расчет их движение в потоке, откроет новые перспективы использования липосом в терапии.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2014 году
-

 

Публикации


Аннотация результатов, полученных в 2015 году
http://www.ibch.ru/press/news/science/1481 Белки биокаталитических систем. Созданы генетические конструкции, обеспечивающие эффективное представление функционально-активных биокатализаторов с принципиально разной активностью и специфичностью на поверхности дрожжевых клеток. Получены генетические конструкции содержащие под контролем промотора гена AOX1 последовательности легкой цепи энтеропептидазы (EK), бутирилхолинэстеразы (BChE) и ДНКазы I (DNаse) человека объединенные с последовательностью SAG1 субъединицы 1 α-агглютинина (Aga1), позволяющей заякоривать рекомбинантные ферменты на поверхности клеточной стенки. Определено оптимальное сочетание генетических элементов, позволяющее эффективно экспонировать молекулы функционально-активных биокатализаторов, таких как ферменты и абзимы на поверхность дрожжевых клеток. Для высокоэффективного скрининга биокатализаторов были разработаны две принципиально различные платформы для получения искусственных биокатализаторов de novo. Подобраны условия, позволяющие доcтигать 70% выживаемости клеток после отбора. Создана библиотека Fab-фрагментов, презентированных на поверхности клеток дрожжей. Собрана биомасса червя F. heliota. Из биомассы F. heliota в получены в индивидуальном (чистом) состоянии ряд структурных аналогов люциферина – его метаболических предшественников. Методами ЯМР, масс-спектроскопии и встречного синтеза установлены структуры аналогов люциферина (его метаболических предшественников). Определены функциональные группы люциферина, ответственные за восстановление молекулы кислорода, а также за излучение квантов света (light emitter). Установлено, что окислению кислородом подвергается карбоксильная группа остатка лизина, а также альфа-СН лизина, в то время как за излучение кванта света отвечает ароматический остаток CompX. Проведен синтез люциферина в количестве 1 грамм. Проведено секвенирование транскриптома F. heliota методом высокопроизводительного секвенирования нового поколения (NGS). Из биомассы F. heliota получен очищенный препарат люциферазы для секвенирования поЭдману (N-концевое секвенирование) и масс-спектрометрического секвенирования. С помощью масс-спектрометрического секвенирования установлены аминокислотные последовательности белков - -кандидатов новой люциферазы F. heliota. Также, с использованием полученных данных секвенирования транскриптома установлены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих данные белки. С использованием синтетического люциферина изучен механизм его окисления кислородом и наработан оксилюциферин, структура которого была установлена методами ЯМР и МС как (Z)-4-(5-(3-(5-(карбоксиформамидо)пентанамидо)-2-метокси-3-оксопроп-1-ен-1-ил)-2-гидроксибензамидо)бутаноая кислота. Получена форма Ес-Lon-протеазы, утратившая инсерционный HI(CC)-домен (Ес-Lon-дельта(124-304)). Установлен вклад НI(СС)-домена в функционирование АТР-азного и пептидазного центров Ес-Lon-протеазы, доказана необходимость НI(СС)-домена для реализации протеолитической активности фермента и поддержания его конформационной стабильности. Проведен сравнительный анализ первичных последовательностей бактериальных IgA протеаз из Neisseria meningitidis серогрупп А, В, С и Е, рассчитана информационная структура IgA1 протеазы, определены консервативные последовательности, содержащие В и Т эпитопы. На основе этих расчетов предложены три варианта структур иммуноактивных фрагментов белка. Для этих структур разработаны новые конструкции рекомбинантной плазмидной ДНК и на их основе созданы штаммы, продуцирующие фрагменты рекомбинантной IgA1 протеазы, содержащие потенциально активные участки IgA1 протьеазы На основании анализа информационной структуры PSP предложены три варианта укороченных белков PSP (Glu109 – Glu677, His279 – Glu677 и Met1 – Ser108 ---- His279 – Glu677). Получен укороченный вариант PSP (101-677) экспрессией соответствующего гена в E. coli (PSPΔ100) и ограниченным протеолизом полноразмерного рекомбинантного фермента His6-PSP с помощью химотрипсина. Последний образец, сохраняя активность в отношении низкомолекулярного субстрата PSP – BAPNA, был активен также в отношении белкового субстрата – азоказеина в отличие от исходного PSP. Получены две мутантные формы протеазы ВИЧ (ПВ): ПВ-L10I/L31I/M46I/I54V/L63I/V82A/I84V/L90M и ПВ- L10I/M36I/S37D/M46I/R57K/L63P/A71V/G73S/I84V/L90M/I93L, устойчивые к ингибиторам I-го поколения – индинавиру и саквинавиру, соответственно. Показана возможность осуществления нового каскадного биосинтеза биологически важных нуклеотидов, при использовании трехстадийного каскадного превращения D-пентоз в пуриновые нуклеотиды - превращения в одном реакционном объеме (1) D-пентоз в 5-фосфаты под действием рибокиназы, из которых затем синтезируются (2) 5-фосфо-α-D-пентофуранозо-1-пирофосфаты под действием фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (PRPP-cинтетазы), (3) конденсация последних с гетероциклическими пуриновыми основаниям в присутствии аденинфосфорибозилтрансферазы (APR-трансферазы) дает желаемые нуклеотиды. Осуществлено клонирование синтетического гена рибокиназы из термофильного микроорганизма Thermus species 2.9, двух разных генов PRPP-cинтетазы из Thermus thermophilus и APR-трансферазы Thermus thermophilus HB27 в экспрессионных векторах, получены высокопродуктивные штаммы-продуценты E. coli, продуцирующие указанные выше ферменты в растворимой форме. Разработаны методы выделения рибокиназы, PRPP-cинтетазы и APR-трансферазы. Наработаны партии препаратов ферментов высокой степени чистоты и концентрации более 10 мг/мл для кристаллизации и кинетических исследований. Подобраны начальные условия кристаллизации генно-инженерных ферментов: рибокиназы, PRPP-cинтетазы и APR-трансферазы, данные условия адаптированы и оптимизированы применительно к методу встречной диффузии в капиллярах для последующего проведения рентгеноструктурного анализа. Проведен комплекс работ по определения субстратной специфичности и оптимальных условий максимально эффективной работы всех ферментов. Рецепторные и сигнальные белки. Анализ структуры и функции. Для изучения молекулярных основ проведения биохимического сигнала через мембрану клетки осуществлен анализ имеющихся в литературе данных в области структурно-функциональных исследований и молекулярных механизмов биологической активности РТК, а также аналогичных мембранных рецепторов I-типа. Выявлены предварительные данные о взаимосвязи структуры и функции этих белков, а также их роли в возникновении и развитии социально-значимых заболеваний человека. Проведена сравнительная оценка возможных направлений исследования молекулярных механизмов функционирования РТК, с выявлением наиболее перспективных представителей рецепторов из различных семейств. В результате для структурных исследований методом гетероядерной спектроскопии ЯМР в мембраноподобных системах был сделан выбор 6-ти минимальных по размерам РТК, интересных с медицинской точки зрения. Разработаны высокоэффективные системы бактериальной и бесклеточной экспрессии и очистки изотопно-меченых связок трансмембранных доменов с функционально важными цитоплазматическими примембранными участками рецепторов. Были разработаны методики продукции белка MSP различного размера для сборки липид-белковых нанодисков (ЛБН) с высокими выходами целевого белка, а также протоколы сборки ЛБН, содержащих связки доменов РТК и аналогичных белков. Образцы ЛБН различного размера и липидного состава, содержащие связку трансмембранного и цитоплазматического домена модельных рецепторов, были охарактеризованы методами ЯМР- спектроскопии, фотон-корреляционной спектроскопии и электронной микроскопии. Исследовано сохранение нативной структуры цитоплазматического домена белка в различных мембраноподобных средах. Полученные результаты помогут в дальнейшем выявить функциональные конформационные изменения в РТК при активации сигнального лиганд- рецепторного мембранного комплекса в мембранах. Пептидомика. Пептидные факторы системы врожденного иммунитета. В ходе выполнения работ в рамках проекта была разработана эффективная технология экспрессии в прокариотической системе и очистки рекомбинантных антимикробных пептидов (аналогов тахиплезина и пептида Th, а также тритрптицина). С целью увеличения выхода гибридных белков, включающих целевые пептиды, и упрощения процедуры очистки были проведены эксперименты по оптимизации процесса, что позволило достичь относительно высокого уровня экспрессии (30% от суммарного белка клетки) и исключить стадию повторной очистки с помощью металлохелатной хроматографии. В результате были получены семь рекомбинантных пептидов, выход которых составил от 7 до 13 мг с литра культуры. Структура пептидного антибиотика грамицидина А была исследована в липосомах фосфатидилхолина, модифицированного неионным детергентом Тритоном Х-100. Соотношение детергента и липида, при котором происходит насыщение липидной мембраны детергентом, было определено методом динамического лазерного светорассеяния. Равновесное конформационное состояние грамицидина А в фосфолипидных липосомах было исследовано методом КД-спектроскопии. Показано, что структура этого канал-образующего антибиотика кардинально изменяется при переходе к более жидкой мембране, модифицированной Тритоном Х-100. В ходе выполнения работ в рамках проекта были обнаружены и выделены новые липид-транспортирующие белки (LTP) укропа и гороха. Были определены полные аминокислотные последовательности данных белков и структуры полноразмерных кДНК, кодирующих их белки-предшественники. С помощью флуоресцентной спектроскопии для LTP укропа и гороха была выявлена специфичность связывания жирных кислот, лизофосфолипидов и жасмоновой кислоты - растительного гормона роста и развития растений. Для экспрессии в Е. coli белков-аллергенов пыльцы полыни Art v 3 и фундука Cor a 8, принадлежащих к классу растительных LTP, были получены генно-инженерные конструкции и штаммы-продуценты, позволяющие экспрессировать целевые белки с выходом не менее 3 мг/л культуры. В рамках проекта были выполнены исследования по оптимизации протокола выделения пептидов из плазмы/сыворотки крови человека. Было предложено осуществлять выделение, используя крупнопористый слабый катионообменный сорбент типа CM Toyopearl 650 S и CM Bio-gel A. Разработан способ стабилизации пептидного пула в 0,1% БСА перед масс-спектрометрическим анализом. Исследована возможность повышения эффективности идентификации пептидов за счет оптимизации условий хроматографического разделения пептидных смесей. Показано, что для повышения эффективности хромато-масс-спектрометрического анализа пептидных фракций, выделенных из плазмы/сыворотки крови, следует использовать 120-минутный градиент буфера В от 5 до 40%. С использованием разработанной методологии удалось идентифицировать около 3000 уникальных пептидов, выделенных из 100 мкл сыворотки крови. В рамках изучения пептидома растений проанализированы пептидные пулы клеток мха Physcomitrella patens и выявлено свыше 28000 эндогенных пептидов – продуктов деградации функциональных белков. Предсказана потенциальная антимикробная активность некоторых фрагментов, образующихся в стрессовых условиях. Для того, чтобы идентифицировать гены, кодирующие пептиды, использовали биоинформатический анализ и выявили около 220 тысяч коротких рамок считывания. С помощью ПЦР в реальном времени оценили изменение уровня транскрипции некоторых генов, предположительно кодирующих пептиды, при разных стрессовых воздействиях. Обнаружено, что у отдельных генов уровень транскрипции повышается на порядок в условиях абиотического и биотического стресса. Мастер-регуляторные белки и гены развития и канцерогенеза на примере поджелудочной железы. Задачей данного направления является выявление мастер регуляторных генов и кодируемых ими белков, ответственных за включение морфогенеза поджелудочной железы в процессе эмбрионального развития человека, исследование их экспрессии в норме и дисрегуляции в процессе канцерогенеза, а также исследование возможностей использования мастер генов в качестве мишеней для диагностики и терапии рака поджелудочной железы, в том числе PDAC. Мы выдвигаем гипотезу, что ключевые для эмбрионального развития гены – мастер гены и белки являются также ключевыми для инициации и эволюции раковой опухоли, включая метастазирование. В предлагаемом Научном проекте мы основываемся на литературных данных и собственных результатах, полученных нами в предыдущих исследованиях, которые свидетельствуют о том, что гены и сигнальные пути, ответственные за включение морфогенетических процессов в ходе эмбрионального развития, при канцерогенезе выключаются (и наоборот). Итогом проекта будет расширение фундаментальных знаний о механизмах развития и раковой трансформации поджелудочной железы и выявление потенциальных мишеней терапевтического воздействия. В отчетный период для решения этой задачи были систематизированы данные по белкам и генам, вовлеченным в развитие и морфогенез поджелудочной железы человека и животных. Составлен соответствующий каталог белков и генов. Систематизированы данные по белкам и генам, активно вовлеченным в возникновение и развитие рака поджелудочной железы, а также в инициацию метастатического процесса и диссеминированного роста. Составлены соответствующие каталоги белков и генов. Проведено сопоставление этих двух массивов данных и выявлены потенциальные гены-кандидаты, вызывающие эмбриоподобное состояние раковых клеток. Проанализированы и обобщены данные по генам-регуляторам и белкам-маркерам различных патологических процессов клеточной трансдифференцировки, в первую очередь, включающих транскрипционные факторы и регуляторы ацинарно-протоковой трансдифференцировки и эпителиально-мезенхимального перехода в клетках поджелудочной железы. Было проведено биоинформатическое определение критических транскрипционные систем, вовлеченные в процессы опухолевой прогрессии, происходящие как в первичных опухолях, так и в метастазах на примере рака поджелудочной железы. Были проанализированы транскриптомы ассоциированных мезенхимальных (стромальных) клеток поджелудочной железы в опухолевых и нормальных тканях. Был проведен анализ собранных и каталогизированных данных о белках и генах поджелудочной железы, вовлеченных в возникновение, развитие и метастазирование рака, эмбриогенез, процессы трансдифференцировки и эпителиально-мезенхимального перехода, проведена идентификация потенциальных мастер генов. Созданы коллекции эмбриональных тканей человека на различных стадиях формирования поджелудочной железы. Собраны образцы аутопсийного материала ткани нормальной поджелудочной железы и коллекция хирургических образцов поджелудочной железы при хроническом панкреатите. Созданы коллекции хирургических образцов рака поджелудочной железы. Из собранных образцов тканей приготовлены панели РНК, кДНК, а также выделена геномная ДНК для проведения эпигенетического анализа. Начат экспериментальный анализ содержания продуктов экспрессии потенциальных мастер генов в опухолевых и эмбриональных тканях поджелудочной железы с использованием созданных панелей кДНК. Опубликовано 9 обзоров, обобщающих современные представления о механизмах молекулярного эмбриогенеза и канцерогенеза, их взаимосвязи, и роли мастер генов и регуляторов транскрипции в этих процессах. Таким образом, проект развивается по намеченному плану, и все задачи, намеченные на отчетный период, выполнены. Белок и гликан-опосредованные клеточные взаимодействия в динамических условиях. 1. Осуществлен синтез гликанов и гликоконъюгатов, необходимых для выполнения намеченных биологических исследований: пробы для вирусологических исследований (в том числе для иммобилизации вируса на кантилевере АСМ), гликолипиды для проведения SPR-экспериментов и для исследования формирования глико- паттернов в биологической мембране. Разработана общая методология синтеза гликолипидов с заранее заданными свойствами, в том числе способностью встраиваться в мембрану живой клетки. Синтезированы аффинные сорбенты для выделения нескольких видов естественных антител человека; новые лиганды для гликоэррея. 2. Методом молекулярной динамики (МД) исследовалась структурная организация мембранного фрагмента, в состав которого входит около 100 липидов, в том числе 10 гликолипидов Gb3. Показано, что конформация гликана в составе Gb3 относительно плоскости мембраны такова, что один из его субсайтов доступен для внешнего узнавания, а второй – для сближения с фосфолипидами, а это дает ключ к пониманию его необычного взаимодействия с углевод-связывающими белками. 3. Синтезирована группа молекул, содержащих Neu5Ac, в том числе рецепторы птичьих и человеческих вирусов гриппа; а также конкурентный ингибитор нейраминидазы вируса гриппа и ее суицидный субстрат. Получены соответствующие гликоконъюгаты. 4. Найдены неразрушающие для вируса гриппа условия его изучения с помощью АСМ, получены сканы АСМ хорошего разрешения. 5. Идентифицированы естественные антиуглеводные антитела, ассоциированные с липопротеинами низкой плотности. Уровень некоторых из них при атеросклерозе был выше, чем у здоровых доноров. Эпитопная специфичность выявленных антител позволила предположить их участие в преэклампсии, оказалось, что уровень антител к гиалуроновой кислоте коррелирует с общими антителами к белкам эндотелиальных клеток. По-видимому, эти антитела маскируют компоненты гликокаликса в динамических условиях.

 

Публикации

1. Zhigis L.S., Kotel’nikova O.V., Vikhrov A.A., Zinchenko A.A., Serova O.V., Zueva V.S., Razgulyaeva O.A., Gordeeva E.A., Melikhova T.D., Nokel E.A., Alliluev A.P., Drozhzhina E.Yu. and Rumsh L.D. A new methodological approach to estimation of the IgA1 и IgA2 content in serum using recombinant IgA1 protease from meningococcus Biotechnоlogy Letters, v.37, pp 2289-2293 (год публикации - 2015).

2. А.Г. Михайлова, А.Н. Некрасов, А.А. Зинченко, Т.В. Ракитина, Д.А. Корженевский, А.В. Липкин, О.А. Разгуляева, М.В. Овчинникова, В.А. Горленко, Л.Д. Румш Укороченные варианты олигопептидазы B из Serratia proteamaculans с измененной активностью Биохимия, т. 80, вып. 10, с. 1606 – 1620 (год публикации - 2015).

3. Алексеева А.С., Третьякова Д.С., Мельникова Д.Н., Молотковский Ю.Г., Болдырев И.А. Новый флуоресцентный мембранный зонд (2,3-5,6-бисциклогексил)BODIPY-меченный фосфатидилхолин Биоорганическая химия, 42(3):339-344 (год публикации - 2016).

4. Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Антимикробные пептиды беспозвоночных. Часть 1. Строение, биосинтез и эволюция. Биоорганическая химия, 42(3):255-275 (год публикации - 2016).

5. Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Антимикробные пептиды беспозвоночных. Часть 2. Биологические функции и механизмы действия. Биоорганическая химия, 42(4):381-400 (год публикации - 2016).

6. БочароваО.В., Кузьмичев П.К., Урбан А.C., Гончарук С.А., Бочаров Э.В., Арсеньев А.С. Получение трансмембранного фрагмента GHR-(254-298) рецептора гормона роста в бесклеточной системе экспрессии для структурных исследований Биоорганическая химия, № 6,т. 41, с. 631-637 (год публикации - 2015).

7. Веспи М, Гбем ТТ, Эленшнайдер Л, Джекк А-П, Дей КДж, Хартли-Тассел Л, Бовин Н, Тиралонго Дж, Хазельхорст Т, Кельм С. СARBOHYDRATE RECOGNITION SPECIFICITY OF TRANS-SIALIDASE LECTIN DOMAIN FROM TRYPANOSOMA CONGOLENS PLOS Neglected Tropical Diseases, 9(10): e0004120. doi:10.1371/journal.pntd.0004120 (год публикации - 2015).

8. Виноградова Т.В., Чернов И.П., Монастырская Г.С., Кондратьева, Свердлов Е.Д. Раковые стволовые клетки: пластичность против терапии ACTA NATURAE, 7, 3 (26): 156-166 (год публикации - 2015).

9. Гурьянова С.В. Сравнительная оценка мурамил пептидов – лигандов рецепторов врожденного иммунитета в регуляции экспрессии оксида азота Российский иммунологический журнал, том 9(18), № 4, с. 453–456 (год публикации - 2015).

10. Дидыч Д.А., Тюлькина Д.В., Плешкан В.В., Алексеенко И.В., Свердлов Е.Д Суперэнхансеры – регуляторы регуляторных генов развития и рака? Molecular Biology, 49, 6: 818-824 (год публикации - 2015).

11. Дубинныи М.А., Каськова З.М., Родионова Н.С., Баранов М.С., Гороховатский А.Ю., Котлобай А., Царькова А.С., Петушков В.Н., Ямполский И.В. Novel mechanism of bioluminescence: oxidative decarboxylation of Fridericia luciferin Angewandte Chemie International Edition, 54, 7065–7067 (год публикации - 2015).

12. Дубинныи М.А., Царькова А.С., Петушков В.Н., Каськова З.М., Родионова Н.С., Ковальчук С.И., Зиганшин Р.Х., Баранов М.С., Минеев К.С., Ямполский И.В. Novel Peptide Chemistry in Terrestrial Animals: Natural Luciferin Analogues from the Bioluminescent Earthworm Fridericia heliota Chemistry – A European Journal, 21, 3942–3947 (год публикации - 2015).

13. Е.В. Усова, М.Р. Копанцева, В.И. Егоров, Е.П. Копанцев, Е.Д. Свердлов Белки SNAI1 И SNAI2 – транскрипционные мастер-регуляторы эпителиально-мезенхимального перехода Патологическая физиология и экспериментальная терапия, 59, (2): 76-87 (год публикации - 2015).

14. Ерошкин, Ф.М., Федина, Н. В., Мартынова, Н. Ю., Байрамов, А. В., Зарайский, А. Г. Точечная мутация белка Noggin2, усиливающая го способность связываться с активином. Биоорганическая химия, № 6,т.41, с. 657-677 (год публикации - 2015).

15. Есипов Р.С., Абрамчик Ю.А., Фатеев И.В., Константинов И.Д., Муравьев Т.И., Артемов К.Г., Мирошников А.И. и Михайлопуло И.А. Каскад термофильных ферментов как инструмент создания модифицированных нуклеотидов Acta Naturae, - (год публикации - 2016).

16. Есипов Р.С., АбрамчикЮ.А., Фатеев И.В., Муравьева Т.И., Скоблов Ю.С., Костромина М.А., Мирошников А.И. Получение и исследование субстратной специфичности термофильной рибокиназы из Thermus sp. Биофармацевтический журнал, Том 8, № 2 (2016), 3-12 (год публикации - 2016).

17. Ефимов А. Е., Бобровский А. Ю., Агапов И. И., Агапова О. И., Олейников В. А., Набиев И. Р., Мочалов К.Е. Сканирующая ближнепольная оптическая нанотомография: метод многопараметрического 3D-исследования наноструктурированных материалов Письма в Журнал Технической Физики, 42(4), 9-15 (год публикации - 2016).

18. Зиновьева М.В., Костина М. Б., Монастырская Г.С., Сасс А.В., Филюкова О.Б., Виноградова Т.В., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. Генетические маркёры клеток общего предшественника лёгких и пищевода в развитии человека Doklady Biochemistry and Biophysics, 463, 1: 203-208 (год публикации - 2015).

19. Иванова О.М., Зиганшин Р.Х., Арапиди Г.П., Ковальчук С.И., Азаркин И.В., Сорокина А.В., Говорун В.М., Радзинский В.Е., Иванов В.Т. ВОЗМОЖНОСТИ И ОГРАНИЧЕНИЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО ПРОФИЛИРОВАНИЯ СЫВОРОТКИ КРОВИ В ОНКОДИАГНОСТИКЕ Биоорганическая химия, 42(5):552-560 (год публикации - 2016).

20. Кашкин К. Н., Свердлов Е.Д. Регулируемая пауза РНК полимеразы II и мастер регуляция у многоклеточных Molecular Biology, 49, 6: 810-817 (год публикации - 2015).

21. Ковальчук С.И., Аниканова Н.А., Иванова О.М., Зиганшин Р.Х., Говорун В.М. Bovine serum albumin as a universal suppressor of non-specific peptide binding in vials prior to nano-chromatography coupled massspectrometry analysis Analytica Chimica Acta, V. 893, P. 57–64 (год публикации - 2015).

22. Кондратьева Л.Г., Виноградова Т.В., Чернов И.П., Свердлов Е.Д. Мастер регуляторы транскрипции, определяющие судьбу клеточных линий в развитии, как возможные терапевтические мишени в онкологии Journal of Genetics, 51, 11: 1049–1059 (год публикации - 2015).

23. Корчагина ЕЮ, Бовин НВ SYNTHETIC GLYCOLIPID­LIKE CONSTRUCTS AS TOOLS FOR GLYCOBIOLOGY RESEARCH, DIAGNOSTICS, AND AS POTENTIAL THERAPEUTICS. Biochemistry (Moscow), 80 (7) — P. 857 —871 (год публикации - 2015).

24. Котельникова О.В., Зинченко А.А., Гордеева Е.А., Мелихова Т.Д., Нокель Е.А., Жигис Л.С., Зуева В.С., Дрожжина Е.Ю., Серова О.В., Румш Л.Д. Перспективное использование секретируемых микробных протеаз для профилактики менингококковых менингитов Клиническая медицина-2015, 28-29 сентября 2015, стр. 17-26 (год публикации - 2015).

25. Куджаев А.М., Андрианова А.Г., Серова О.В., Архипова В.А., Дубовцева Е.С., Ротанова Т.В. Влияние мутаций в инсерционном домене АТР-зависимой Lon-протеазы из E. coli на ее функционирование Биоорганическая химия, Т. 41, № 5, с. 579-586 (год публикации - 2015).

26. Кузьмич А. И., Тюлькина, Виноградова Т. В., Свердлов Е. Д. Пионер-факторы транскрипции в нормальном развитии и в канцерогенезе Russian journal of bioorganic chemistry, 41, 6: 570-577 (год публикации - 2015).

27. Мартынов В.И., Пахомов А.А., Попова Н.В., Деев И.Е., Петренко А.Г. Синтетические флуорофоры для исследования объектов живых систем. Acta Naturae, - (год публикации - 2016).

28. Мартынова, Н. Ю., Орлов, Е.Е., Нестеренко, А.М., Ерошкин, Ф. М., Бородулин, А.В., Байрамов, А. В., Зарайский, А. Г. Изучение взаимодействия секретируемых белков Noggin4 и Wnt8 из эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Биоорганическая химия, Т. 42 В. 3 С. 340-342 (год публикации - 2016).

29. Мельникова Д.Н., Минеев К.С., Финкина Е.И., Арсеньев А.С., Овчинникова Т.В. A novel lipid transfer protein from the dill Anethum graveolens L.: isolation, structure, heterologous expression, and functional characteristics Journal of Peptide Science, 22(1):59-66 (год публикации - 2016).

30. Мещерякова Е.А., Минеев К.С., Волынский П.Е., Андронова Т.М., Иванов В.Т. GMDP: unusual physico-chemical and biological properties of the anomeriс forms Journal of Peptide Science, 21(9):717-22 (год публикации - 2015).

31. Минеев К.С., Гончарук С.А., Кузьмичев П.К., Вилар М., Арсеньев А.С. NMR Dynamics of Transmembrane and Intracellular Domains of p75NTR in Lipid-Protein Nanodiscs Biophysical Journal, № 4, т. 109 с. 772-782 (год публикации - 2015).

32. Овчинникова Т.В. Пептидные факторы системы врожденного иммунитета Актуальная биотехнология, 3(14):29-30 (год публикации - 2015).

33. Пантелеев П.В., Овчинникова Т.В. Improved strategy for recombinant production and purification of antimicrobial peptide tachyplesin I and its analogs with high cell selectivity Biotechnology and Applied Biochemistry, - (год публикации - 2016).

34. Пахомов А.А., Черткова Р.В., Мартынов В.И. pH-сенсорные свойства флуоресцентного белка из Dendronephthya sp. Биоорганическая химия, №6, т. 41, с. 602-606 (год публикации - 2015).

35. Полякова С.М., Низовцев А.В., Кунецкий Р.А., Бовин Н.В НОВЫЕ ЗАЩИТНЫЕ ГРУППЫ В ОЛИГОСАХАРИДНОМ СИНТЕЗЕ Известия Академии наук. Серия химическая, № 5, стр. 973—989 (год публикации - 2015).

36. Пуртов К.В., Петушков В.Н., Баранов М.С., Минеев К.С., Родионова Н.С., Каськова З.М., Царькова А.С., Петунин А.И., Бондарь В.С., Родичева Е.К., Медведева С.Е., Оба Юичи, Оба Ёмико, Арсеньев А.С., Лукьянов С.А., Гительсон Ж.И., Ямпольский И.В. The chemical basis of fungal bioluminescence Angewandte Chemie International Edition, 54, 8124–8128 (год публикации - 2015).

37. Рапопорт ЕМ, Бовин НВ SPECIFICITY OF HUMAN GALECTINS ON CELL SURFACES Biochemistry (Moscow), 80 (7) — P. 846 —856 (год публикации - 2015).

38. Саблина М. А., Тузиков А. Б., Овчинникова Т. В., Михура И. В., Бовин Н. В. СИНТЕЗ МОНО­ И ДИ­ О­СУЛЬФАТОВ СПЕЙСЕРИРОВАННОЙ ЛАКТОЗЫ Известия Академии наук. Серия химическая, № 5, стр. 1125—1133 (год публикации - 2015).

39. Свердлов Е.Д., Плешкан В.В., Алексеенко И.В., Виноградова Т.В., Копанцев Е.П., Дидыч Д.А. Взрослые стволовые клетки и другие резиденты рака. Часть I Molecular Genetics, Microbiology and Virology, 3: 1–40 (год публикации - 2015).

40. Свердлов Е.Д., Плешкан В.В., Алексеенко И.В., Виноградова Т.В., Копанцев Е.П., Дидыч Д.А. Взрослые стволовые клетки и другие резиденты рака. Часть II Molecular Genetics, Microbiology and Virology, 30, 4: 157-164 (год публикации - 2015).

41. Светлана В. Голодухина, Надежда С. Балеева, Константин С. Минеев, Михаил С. Баранов Обратимая конденсация 4-арилиден-1,2-диметил-1H-имидазол-5(4H)-онов с хлорангидридами ароматических кислот Химия гетероциклических соединений, 51(10), 944–947 (год публикации - 2015).

42. Сычев С.В., Суханов С.В., Тележинская И.Н., Овчинникова Т.В. Effective lipid-detergent system for study of membrane active peptides in fluid liposomes Journal of Peptide Science, 22(2):98-105 (год публикации - 2016).

43. Терехов С., Смирнов И., Бобик Т., Шамборант О., Зенкова М., Черноловская Е., Гладких Д., Мурашев А., Дьяченко И., Паликов В., Паликова Ю., Кнорре В., Белогуров А., Пономаренко Н., Блэкберн Дж.М., Массон П., Габибов А. A novel expression cassette delivers efficient production of exclusively tetrameric human butyrylcholinesterase with improved pharmacokinetics for protection against organophosphate poisoning Biochimie, 2015 Nov;118:51-9 (год публикации - 2015).

44. Терехов С.С., Бобик Т.В., Мокрушина Ю.А., Степанова А.В., Александрова Н.М., Смирнов И.В., Белогуров А.А., Пономаренко Н.А., Габибов А.Г. ЭКСПРЕССИЯ ДНК-КОДИРУЕМОГО АНТИДОТА К ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМ ТОКСИНАМ В МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖАХ PICHIA PASTORIS ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, том 52, № 2, с. 1–9 (год публикации - 2016).

45. Фесенко И.А. и др. Specific pools of endogenous peptides are present in gametophore, protonema, and protoplast cells of the moss Physcomitrella patens BMC Plant Biology, 15:87 (год публикации - 2015).

46. Финкина Е.И., Мельникова Д.Н., Богданов И.В., Овчинникова Т.В. БЕЛКИ СИСТЕМЫ ВРОЖДЁННОГО ИММУНИТЕТА РАСТЕНИЙ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЕ ТРАНСПОРТ ЛИПИДОВ: СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ Acta Naturae, 8(2):53-69 (год публикации - 2016).

47. Хазигалеева Р.А., Виноградова С. В., Петрова В.Л., Фесенко И.А., Арапиди Г.П., Камионская А.М., Говорун В.М., Иванов В.Т. Антимикробная активность эндогенных пептидов мха Physcomitrella patens Биоорганическая химия, - (год публикации - 2016).

48. Шандарин, И. Н., Иванова, А. С., Минин, А. А., Терешина, М. Б., Зарайский, А. Г. Ген ag1 необходим для регенерации плавников у рыбы Danio rerio Биоорганическая химия, № 4,т.41, с. 379-382 (год публикации - 2015).


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
http://www.ibch.ru/press/news/science/1869 Направление «Белки биокаталитических систем» Осуществлен дизайн мутантных форм EcLon-протеазы и на его основе получена и охарактеризована форма фермента с делецией фрагментов V385–I399 и D431–P436, формирующих подвижные петли (Ес-Lon-d2). Установлено, что N-концевой фрагмент (1-172) абсолютно необходим для реализации процессивного механизма гидролиза белковых субстратов EcLon-протеазой. На основе созданных штаммов E. coli, продуцирующих рекомбинантную IgA1 протеазу и ее фрагменты из различных участков первичной структуры фермента, получены в высокоочищенном состоянии четыре рекомбинантных белка, содержащие гистидиновую метку в С-концевой части молекулы: (M-A28–P1004-LEH6), M-W140–K833-LEH6, M-W329–P1004-LEH6 и M-W140–Q299-Y866–P1004-LEH6. В экспериментах на животных исследованы иммуногенные и протективные свойства полученных соединений. Показано, что аминокислотные последовательности N- и C-концевых участков IgA1 протеазы (W140–Q299 и Y866–P1004) и локализованные в них эпитопы, играют важную роль в формировании у иммунизированных животных долгосрочного иммунного ответа к IgA1 протеазе и эффективной защиты от менингококков основных эпидемических серогрупп А, В и С. Исследован ограниченный протеолиз олигопептидазы PSP и показано, что в результате трипсинолиза происходит отщепление С-концевого фрагмента 656-677 с образованием PSP (1-655), который не обладает протеолитической активностью. Укороченный вариант PSP (1-655), полученный экспрессией соответствующего гена в E. coli также оказался неактивным. Химотрипсинолиз приводил к образованию PSP (101-677), обладающему способностью гидролизовать низко- и высокомолекулярные субстраты, включая азоказеи и проинсулин. Получена панель мутантных антител, обладающих улучшенными параметрами активности по отношению к субстратам метилпараоксон, а также флуоресцентным аналогам параоксона. Установлено, что уровень активности мутантных по отношению к фосфорорганическим сусбтратам меняется в ряду параоксон>метилпараоксон>Par-R>Par-MCA в сторону уменьшения скорости образования ковалентного комплекса антитело-органофосфат. В результате скрининга библиотек были идентифицированы пять вариантов БХЭ (БХЭ-PSHSG, БХЭ-KRLSG – при отборе на Par-MCA и БХЭ-DHISG, БХЭ-DHRSG, БХЭ-HTIHG – при отборе на S-MCA). Все полученные препараты обладали способность к реактивации после ковалентного связывания со «своим» субстратом. Был отобран пул мутантных форм ЕК, обладающих активностью примерно в 300 раз выше в сравнении с исходным ферментом ЕК. Было установлено, что использование негативного типа селекции обогащения на варианты ЕК, обладающих повышенной специфичностью не целесообразно. В результате очевидно необходимо разрабатывать режимы позитивной селекции для отбора вариантов, обладающих заданными параметрами специфичности. Предложена новая стратегия биосинтеза биологически важных нуклеотидов, которая состоит в мультиферментном каскадном превращении D-пентоз в пуриновые нуклеотиды. Каскадный синтез включает последовательное превращение в «одной колбе» D-пентоз в 5-фосфаты под действием рибокиназы, из которых затем синтезируются 5-фосфо-α-D-пентофуранозо-1-пирофосфаты под действием фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (PRPP-cинтетазы), конденсация последних с гетероциклическими пуриновыми основаниям в присутствии аденинфосфорибозилтрансферазы (APR-трансферазы) дает желаемые нуклеотиды. С использованием ранее созданных штаммов-продуцентов рибокиназы из Thermus species 2.9 (TspRK), PRPP-cинтетазы 2 из Thermus thermophilus HB27 (TthPRPPS) и APR-трансферазы 2 из Thermus thermophilus HB27 (TthAPRT) и разработанных методик выделения осуществлена наработка ферментов в количествах, достаточных для дальнейшего проведения рентгеноструктурных исследований. Проведен комплекс работ по оптимизации условий кристаллизации белков: подобраны условия кристаллизации методом диффузии паров растворителя и адаптированы применительно к методу встречной диффузии в капиллярах. Получены дифракционные наборы всех ферментов, пригодные для определения пространственной структуры, и проведена съемка рентгенодифракционных имиджей кристаллов наилучшего качества. С использованием метода молекулярного замещения получены структуры TthPRPPS и TthAPRT. Проанализирована структура TthPRPPS и определен аллостерический активный центр фермента. Проведен компьютерный докинг комплекса TthPRPPS с лигандом и предложены варианты для направленного мутагенеза фермента с целью изменения его субстратной специфичности. Получен очищенный препарат нового фермента - люциферазы Fridericia heliota в активном состоянии. Для локализации люминесценции в геле использовали систему детекции люминесценции Fusion Solo. Для детекции биолюминесцентной активности в геле сначала проводили электрофорез в неденатурирующих условиях, затем гель обрабатывали раствором содержащим люциферин и АТФ как указано к подписи к рисунку. Результаты эксперимента представлены на рисунке 1.7.1. В связи с установлением структуры люциферина F.heliota актуальной стала задача получения его аналогов, которые бы обладали новыми спектральными характеристиками. Для решения этой задачи необходимо было ответить на вопрос о функциональной роли различных структурных фрагментов молекулы люциферина. В ходе предварительных исследований было установлено, что активность в реакции биолюминесценции, вероятнее всего, проявляет одна из карбоксильных групп в остатке ω-оксалиллизина (LysOx), поэтому модификация исходной структуры без потери активности возможна по фрагменту ГАМК. Для проверки этой гипотезы был осуществлен синтез двух аналогов люциферина, вариабельных по этому остатку. Для синтеза производного люциферина с линкерной аминогруппой 2.28 и его конъюгата с флуоресцентным красителем 2.30 были использованы вещества CompX 2.4 и 2.26 (Схема 1.7.1). Путем активации кислоты из 2.4 был получен пептид 2.27, в котором удаляли метильную защитную группу, а затем проводили пептидный синтез - сочетание с остатком лизина 2.10. Для получения целевого продукта 2.28 удаляли защитные трет бутильную и этильную группы. Соединение 2.30 было получено конъюгацией амина 2.28 и соответствующего активированного эфира 2.29 в гидрокарбонатном буфере. Было показано, что соединения 2.28 и 2.30 обладают биолюминесцентными свойствами, аналогичными природному люциферину, проявляя активность при добавлении экстракта люциферазы. Эти данные подтвердили гипотезу о том, что фрагмент ГАМК не принимает участие в реакции биолюминесценции F. heliota. Спектры поглощения и биолюминесценции аналога люциферина 2.30 в сравнении с люциферином 2.1 представлены на Рисунке 1.7.2. Можно наблюдать значительное смещение максимума поглощения для соединения 2.30 в красную область, которое объясняется наличием новой хромофорной группы. Максимум биолюминесценции также смещается: если для люциферина 2.1 он составляет 478 нм, то для аналога 2.30, в котором возможен Фёрстеровский перенос энергии излучения (BRET) с люциферина на хромофорную группу, пик биолюминесценции соответствует 528 нм. Направление «Рецепторные и сигнальные белки. Анализ структуры и функции» С помощью гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения исследованы минимальные функциональные фрагменты рецепторных тирозинкиназ (рецепторов нейротрофинов и эпидермальных факторов роста) в мембраноподобных средах. Выявлены структурные детерминанты и построены конформационно динамические модели функционирования рецепторов в мембране клетки. Для функционирования рецептора нейротрофинов показана важность образования межмолекулярной SS-связи между трансмембранными доменами внутри мембраны. На основе структурных ЯМР данных и молекулярного моделирования выявлено влияние соматических онкогенных трансмембранных мутаций на активацию рецепторов эпидермальных факторов роста. Нами было ранее показано, что рецепторная тирозинкиназа ИРР, близкий структурный гомолог рецептора инсулина, является клеточным сенсором слабощелочной среды. Была проведена экспрессия эктодомена ИРР в эукариотических клетках, выделен чистый белок и изучена его пространственная структура при помощи криоэлектронной микроскопии и малоуглового рентгеновсого рассеяния. Построена модель трехмерной структуры эктодомена и найдены ее изменения при защелачивании среды. В ходе работы по проекту у модельного объекта - шпорцевой лягушки - впервые был найден мембранный трех-петельный белок, Tfp4, и показано, что он является потенциальным рецептором секретируемого фактора Agr2. Так как Agr2 вовлечен во множество процессов в нормальном развитии и при патологии, выявление и изучение его рецептора является важной задачей. Направление «Пептидомика. Пептидные факторы системы врожденного иммунитета» Для экспрессии антимикробных пептидов в бесклеточной белоксинтезирующей системе были получены генно-инженерные конструкции в виде кольцевых и линейных молекул ДНК, кодирующих АМП (цистеин-содержащие, в т.ч. бета-шпилечные, пролин-богатые, производные гистонов) под контролем промотора Т7. Была исследована зависимость уровня экспрессии от концентрации ДНК матрицы, температуры, концентрации ионов магния. Проведена работа по оптимизации условий реакции бесклеточного синтеза и осуществлена препаративная наработка трех пептидов в количествах, достаточных для проведения тестов антимикробной и гемолитической активности. Изучена антимикробная активность семи пептидов (ThM21L, 3W, TachZ, TachY8S, TachY8R, TachI11S, TachI11R) в отношении штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также их гемолитическая активность в отношении свежевыделенных человеческих эритроцитов. Были получены значения минимальной ингибирующей, минимальной бактерицидной и минимальной гемолитической концентраций исследуемых пептидов. Для трех наиболее активных пептидов (TachZ, TachY8S, TachI11S) были построены кинетические кривые действия на цитоплазматическую мембрану бактерий E. coli. Изучены адсорбционные зависимости разности граничных потенциалов (РГП) от концентраций ареницина-2 и Lc-LTP2 для БЛМ, моделирующих свойства мембран грамположительных, грамотрицательных бактерий и клеток млекопитающих. Установлен эффект увеличения РГП с увеличением доли отрицательно заряженных фосфолипидов в БЛМ. В экспериментах по измерению мембранного тока показано, что проводимость пептид- индуцируемых проводящих пор увеличивается соответственно доле отрицательно заряженных фосфолипидов в БЛМ. Изучено влияние модифицированных аналогов ареницина-2 на барьерные свойства БЛМ. В работе использовали аналоги со следующими заменами Tyr5Ser (аналог А1) и Val4Ser (аналог А2). Оба аналога вызывают флуктуации проницаемости БЛМ всех типов. Действие аналога А2 не приводит к разрушению мембраны. Замена Tyr5Ser способствует ускорению разрушения мембраны под действием данного пептида в той же концентрации, что и для исходного пептида. Структура этого катионного пептида в частично заряженной мембране, состоящей из ФГ/ФХ, исследована методами Фурье ИК и КД-спектроскопии. Фурье ИК спектры ареницина в области амида I анализировали методом разложения сложного контура и методом второй производной. Данные Фурье ИК для пептида в липосомах из ФГ/ФХ сопоставлялись с данными, полученными в мицеллах анионного детергента додецилсульфата натрия, где согласно данным ЯМР- спектроскопии ареницин формирует димер, образованный при ассоциации двух параллельных β-шпилек. Результаты указывают на то, что ареницин формирует димерную структуру в частично заряженной липидной мембране из ФГ/ФХ. Получен лабораторный образец липид-транспортирующего белка укропа Anethum graveolens (Ag-LTP), меченный стабильными изотопами 13C,15N. Полученный образец был охарактеризован методами электрофореза в ПААГ, масс-спектрометрии МАЛДИ, КД-спектроскопии и автоматического N-концевого микросеквенирования. Методом ЯМР-спектроскопии была определена пространственная структура липид-транспортирующего белка укропа Ag-LTP в водном растворе. Определены оптимальные условия для измерения ЯМР-спектров Ag-LTP. Было показано, что структура Ag-LTP представлена четырьмя α-спиралями и содержит длинную неупорядоченную петлю в С-концевом участке молекулы. Ag-LTP содержит внутреннюю гидрофобную полость объемом ~800 Å3, в которой располагается сайт связывания липидных молекул. По данным о релаксации ядер 15N охарактеризована внутримолекулярная динамика Ag-LTP в свободном состоянии и в комплексе с липидом LPPG. В рамках количественного анализа пептидомов крови было проведено выделение пептидного пула из 9 образцов сыворотки крови здоровых доноров и 9 образцов пациенток с подтвержденным диагнозом рак яичников, используя крупнопористый слабый катионообменный сорбент Toyopearl CM-650M, Tosoh Bioscience LLC, USA. Был проведен количественный анализ пептидомов сыворотки крови методом безметочной квантификации SWATH LC-MS/MS. В процессе проведения экспериментов была отработана технология безметочной квантификации таких сложных биологических жидкостей, как плазма или сыворотка крови. Количественным безметочным масс-спектрометрическим методом SWATH в пулах образцов сыворотки крови пациенток с подтвержденным диагнозом рак яичников обнаружено 36 пептидов, содержание которых в 2 или более раз выше, чем в пулах сыворотки крови здоровых доноров, и 28 пептидов, содержание которых в 2 или более раз ниже, чем в пулах образцов от здоровых доноров. Для секвенирования транскриптома была выделена и очищена мРНК из трёх типов клеток мха Physcomitrella patens. Секвенирование библиотеки мРНК было проведено с использованием генетического анализатора SOLiD 4 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Была обнаружена транскрипция 23446 генов, к которым относится 47976 изоформ. При этом 12043 генов имеют более одной изоформы, т.е. подвергаются альтернативному сплайсингу (AS). Для идентификации дифференциально-экспрессирующихся (DE) и дифференциально-альтернативно сплайсирующихся (DAS) генов мы составили каталог транскриптов, которые включал 61048 транскриптов для 32275 генов, куда отнесли и аннотированные изоформы, содержащиеся в версии генома мха 1.6. Известно, что помимо белок-кодирующих транскриптов, короткие открытые рамки считывания (sORFs) с высоким кодирующим потенциалом могут быть обнаружены на длиных некодирующих РНК (lncRNAs). Поэтому, для более полного описания транскриптома клеток мха мы отобрали lncRNAs, потенциально способные нести sORFs. Оценка кодирующего потенциала транскриптов проводилась по следующей схеме: транскрипты, длиной свыше 200 нуклеотидов, не являющиеся аннотированными транскриптами (версия генома 1.6) были отобраны, и проведен анализ их кодирующего потенциала с помощью программного пакета CNCI и базы данных Rfam. Кроме того, было проведено секвенирование неполиаденилированной РНК, выделенной из протонемы и протопластов P. patens для того, чтобы идентифицировать транскрипты участков генома, способные кодировать пептиды, но не связанные с работой РНК-полимеразы II. Для этого выделенная тотальная РНК была секвенирована на платформе Illumina HiSeq (DNA Sequencing Center/Brigham Young University). В результате было получено 106,178,640 и 102,092,879 высококачественных парных ридов для РНК, выделенной из протонемы и протопластов, соответственно. С помощью программы Trimmomatic были отрезаны адаптеры, и риды были отфильтрованы по длине (минимум 105 п.н.). Затем риды были картированы на последовательности хлоропластной и митохондриальной ДНК мха, и картированные риды (около 60%) были отфильтрованы. В итоге для сборки lncRNA были использованы 45,648,279 парных ридов для протонемы и протопластов. Длина ридов варьировала от 105 до 113 п.н. Используя результаты транскрипционного профилирования, была создана база данных коротких последовательностей для поиска пептидов в образцах с помощью масс-спектрометрического анализа. Данная база включает в себя аминокислотные последовательности, соответствующие sORFs, лежащих на транскриптах и, следовательно, имеющих высокий кодирующий потенциал. Направление «Мастер-регуляторные белки и гены развития и канцерогенеза на примере поджелудочной железы» Задачей данного направления является выявление мастер регуляторных генов и кодируемых ими белков, ответственных за включение морфогенеза поджелудочной железы в процессе эмбрионального развития человека, исследование их экспрессии в норме и дисрегуляции в процессе канцерогенеза, а также исследование возможностей использования мастер генов в качестве мишеней для диагностики и терапии рака поджелудочной железы, в том числе PDAC. Мы выдвигаем гипотезу, что ключевые для эмбрионального развития гены – мастер гены и белки являются также ключевыми для инициации и эволюции раковой опухоли, включая метастазирование. В предлагаемом Научном проекте мы основываемся на литературных данных и собственных результатах, полученных нами в предыдущих исследованиях, которые свидетельствуют о том, что гены и сигнальные пути, ответственные за включение морфогенетических процессов в ходе эмбрионального развития, при канцерогенезе выключаются (и наоборот). Итогом проекта будет расширение фундаментальных знаний о механизмах развития и раковой трансформации поджелудочной железы и выявление потенциальных мишеней терапевтического воздействия. Для решения этой задачи были систематизированы данные по белкам и генам, вовлеченным в развитие и морфогенез поджелудочной железы человека и животных. Систематизированы данные по белкам и генам, активно вовлеченным в возникновение и развитие рака поджелудочной железы, а также в инициацию метастатического процесса и диссеминированного роста. Проведено сопоставление этих двух массивов данных и выявлены потенциальные гены-кандидаты, вызывающие эмбриоподобное состояние раковых клеток. Созданы коллекции эмбриональных тканей человека на различных стадиях формирования поджелудочной железы. Собраны образцы аутопсийного материала ткани нормальной поджелудочной железы и коллекция хирургических образцов поджелудочной железы при хроническом панкреатите. Созданы коллекции хирургических образцов рака поджелудочной железы. Все образцы гистологически охарактеризованы, собраны сведения о пациентах. Созданы аннотированные каталоги собранных образцов тканей. Из собранных образцов тканей приготовлены панели РНК, кДНК, а также выделена геномная ДНК для проведения в дальнейшем эпигенетического анализа промоторов наиболее интересных мастер генов. Для дальнейшей работы были взяты шесть потенциальных мастер генов (PDX1, PTF1a, SOX9, HNF1-beta, GATA4, KLF5 и ZEB1) и белков, вызывающих эмбриоподобное состояние опухоли. Проведен экспериментальный анализ содержания продуктов экспрессии потенциальных мастер генов в опухолевых и эмбриональных тканях поджелудочной железы, показана дифференциальная экспрессия этих генов в опухолевых и фетальных тканях поджелудочной железы. Кроме того в работу взят ген FAP, белок которого содержится в клетках CAF (cancer associated fibroblasts), составляющих основную массу (до 90%) стромального окружения опухолей эпителиального происхождения. CAF клетки характерны практически для всех карцином и FAP может быть перспективной мишенью для терапевтического воздействия. Проанализирован уровень экспрессии гена FAP на панели клеточных линий. Полученные данные обобщены в опубликованной статье. За отчетный период опубликовано 7 обзоров, обобщающих современные представления о механизмах молекулярного эмбриогенеза и канцерогенеза, их взаимосвязи, и роли мастер генов и регуляторов транскрипции в этих процессах. Опубликовано две статьи с экспериментальными данными. Материалы работы были представлены на четырех конференциях. Таким образом, проект развивается по намеченному плану, и все задачи, намеченные на отчетный период, выполнены. Направление «Белок и гликан-опосредованные клеточные взаимодействия в динамических условиях» 1) Молекулярная динамика для объяснения толерантности естественных антител. Проведено исследование почему не происходит аутоиммунной реакции между антителами к трисахариду Pk (он является гликаном гликолипида Gb3) и нормальным компонентом клеток, гликолипидом Gb3. Синтетический аналог гликолипида, отличающийся наличием спейсера-вставки между трисахаридом и липидом, связывался с антителами человека как в липидных мембранах, так и в искусственных тест-системах. Для объяснения иммунохимических данных была привлечена Молекулярная Динамика: симуляция проводилась с кластером молекул Gb3 (или его синтетическим аналогом sGb3), окруженных разными фосфолипидами Найдено, что: 1) холестерин (также, как и в иммунохимических экспериментах) не влияет на ориентацию трисахарида; 2) склонности к образованию кластеров гликолипидов не наблюдается; 3) водородные связи с молекулами среды значительно лучше формирует sGb3, чем природный гликолипид, а доступность внутреннего остатка Glc в Galα1-4Galβ1-4Glc в заякоренной молекуле sGb3 принципиально выше, чем в Gb3. Иммунохимические эксперименты по взаимодействию антител с широким рядом синтезированных аналогов (здесь без липидной части) показали, что приближенный к мембране остаток Glc важен для взаимодействия. Всё вместе это дает право заключить, что пространственная недоступность эпитопа естественных анти-Pk антител является причиной отсутствия в крови взаимодействия антител с казалось бы комплементарным антитеном. Далее, МД симуляция Gb3 в составе мицеллы выявила доступность остатка Glc, что предполагает возможность узнавания естественными антителами Gb3-содержащих свободных или формирующихся на внешней стороне мембраны везикул высокой кривизны; это будет предметом экспериментального изучения в дальнейшем. 2) Адаптация техники Surface Plasmon Resonance (SPR) для целей проекта. Исследовалась кинетика взаимодействия антител MA58-1 (IgG), направленных к дисахариду LeC, с помощью двух слайдов, с разной химией иммобилизации дисахарида. Поверхность золотого SPR слайда модифицировали цистеин-содержащим конъюгатом LeC-PAA-Cys в области первой проточной ячейки, а также AG-PAA-Cys (производное аминоглюцитола) как контроль - в области второй проточной ячейки слайда. Сенсограммы выглядят как классические SPR данные. Поверхность карбоксиметилдекстранового SPR слайда модифицировали мономерным LeC-spNH2 (область первой проточной ячейки) и AG-NH2 (контроль, область второй проточной ячейки), сенсограммы при таком методе иммобилизации значительно отличаются от классических SPR гистограмм, причины этого выясняются. В результате, 1) иммобилизация углеводного антигена на золотом слайде гликозилированным полимером через цистеин дает заметно лучшие результаты, чем иммобилизация того же мономерного лиганда на карбоксиметилдекстрановом слайде; 2) адекватной моделью взаимодействия антиген:антитело (IgG) при выбранном методе иммобилизации (через полимер) следует считать 1:1, так как при модели 1:2 величина KD порядка 10-11 для данных антител (выбранный антиген не является для них оптимальным) представляется нереальной; 3) найденные условия иммобилизации и условия проведения SPR-анализа можно далее применить для исследования естественных антител человека к гликану методом SPR. 3) Перенос гликолипидов на бактерии. В 2016 году мы продемонстрировали возможность быстрого переноса модельных липидов из клеток на бактерии. Затем тот же самый эффект был показан на гликолипиде, окрашивание проводили с помощью флуоресцентно-меченых антител к гликану этого гликолипида, тетрасахариду A(type 2). Наконец, показана возможность быстрого (меньше 1 мин) переноса липидов между гликолипид-модифицированными и нативными бактериями. Таким образом, гликолипиды могут переноситься из клеточной мембраны на бактерии, и передаваться между бактериями, причем процесс переноса происходит очень быстро – это неожиданно, мы ожидали, что быстрый («авидный») захват предполагает медленный трудный их релиз. 4) Динамическое светорассеяние, малоугловое рассеяние и AFM гликолипидов. AFM показывает наличие мицелл, которые в результате высушивания приобретают форму сплюснутого эллипсоида. Отметим, что частицы как мелкие (мицеллы), так и крупные (липосомы) практически одной формы, отличаются только размером, что указывает на высокую устойчивость частиц, которые не разрушаются даже при высушивании. Кроме того, отсутствуют «слипшиеся» частицы, что свидетельствует о высокой их коллоидной стабильности. 5) Зондовая микроскопия (AFM) в изучении вируса гриппа. Был приенен метод, основан на использовании биотинилированного лиганда гемагглютинина вируса. Данную технику иммобилизации вирусных частиц мы применили для закрепления их на кончике зонда атомно-силового микроскопа, контролируя процесс с помощью растрового электронного микроскопа. Однако, вирусы осаждались преимущественно на основании кантилевера, но не на зонде. Причина будет выясняться, параллельно будет использована другая методология иммобилизации. Несомненным положительным итогом исследований 2016 г. является уверенность в возможности изучения вируса гриппа данным методом. 6) Естественные антитела (еАТ) как регуляторы адгезии ЦОК, ЛНП и др. Для изученияроли еАТ в роллинг-подобных механизмах адгезии, и возможной блокирующей роли, что служит причиной резистентности раковых клеток к иммунитету на сегодня представляется единственно возможным применение метода иммуно-ПЦР (иПЦР), обладающего рекордно высокой чувствительностью. В качестве первого этапа мы использовали иПЦР на основе ИФА, который дал нам возможность оценить чувствительность разрабатываемого чипного варианта на примере антител к дисахариду LeC, которые предположительно связываются с ЦОК, и несомненно являются опухоле-специфичными. Минимальная определяемая концентрация антител LeC методом иПЦР была 4 нг/мл, в то время как в ИФА - 300 нг/мл. Во всех экспериментах колебания значений ΔCq не выходили за пределы 0.2 цикла, что говорит о хорошей воспроизводимости получаемых результатов. Так как определяемые анти-LeC иммуноглобулины по аффинности и изотипному составу (в основном, IgM) являются типичными представителями еАТ, то есть основания полагать, что этот метод столь же успешно будет работать при детекции других анти-гликановых антител. Особо подчеркнем достоверность определения малого количества антител, что важно для выявления клеточных мишеней еАТ. Величина 4 нг соответствует ~108 молекул IgM; если количество клеточных мишеней на одной клетке не превышает величины 104, то для определения специфичности маскирующих антител методом иПЦР потребуется 104 – 105 клеток, что представляется вполне реальным количеством. 7) Синтетическая часть. За 2016 г. библиотека гликанов пополнилась 20 новыми гликанами и 50 новыми гликоконъюгатами 8) Приборно-методологическая работа. Была использована комбинация методов сканирующей зондовой микроскопии (СТМ) и оптической микроспектроскопии (ОМ), которые инструментально реализованы в одном приборном комплексе, что позволило получать изображения высокого и сверхвысокого разрешения (СТМ) и данные о структуре-функции локальных объектов (ОМ). Отработка методов осуществлялась на примерах гибридных наноструктур, содержащих флуоресцентные квантовые точки, были исследованы модельные пурпурные мембраны с бактериородопсином, благодаря чему была отработана техника оптической микроспектроскопии, в частности методы гигантского комбинационного рассеяния, применительно к клеточным мембранам. Особенности техники ОМ определялись на модели белок/наночастица, где в роли наночастиц применяли серебряные плазмонные или полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы. Процесс трансформации сигнала бактериородопсином оказался чувствительным к окружению, что позволяет использовать этот объект для оценки параметров микроспектральной техники Для изучения динамических процессов взаимодействия биологических объектов, были созданы ратиометрические наносенсоры, позволяющие регистрировать изменения температуры в локальных объемах сред (в том числе и в потоке) в физиологическом диапазоне температур (25-40°С).

 

Публикации

1. Абрамчик Ю. А., Тимофеев В.И., Муравьева Т.И., Синицина Е. В., Есипов Р. С., Куранова И. П. Кристаллизация и предварительное рентгеновское исследование рекомбинантной фосфорибозилпирофосфатсинтетазы из термофильного штамма Thermus thermophilus HB27 Кристаллография, Том 62, № 1, с. 75–78 (год публикации - 2017).

2. Абрамчик Ю.А., Тимофеев В.И., Муравьева Т.И., Куранова И.П. Cristallization and preliminary X-Ray diffraction study of recombinant ribokinase from Thermus species 2.9 Crystallography reports, Volume 61, Issue 6, pp 974–978 (год публикации - 2016).

3. Алексеенко И.В., Кузьмич А.И., Плешкан В.В., Тюлькина Д.В., Зиновьева М.В., Костина М.Б., Свердлов Е.Д. The Cause of Cancer Mutations: Improvable Bad Life or Inevitable Stochastic Replication Errors? Molecular Biology, 50, 6: 799–811 (год публикации - 2016).

4. Алексеенко И.В., Плешкан В.В., Монастырская Г.С., Кузьмич А.И., Снежков Е.В., Дидыч Д.А., Свердлов Fundamentally Low Reproducibility in Molecular Genetic Cancer Research Russian Journal of Genetics, 52, 7: 650–663 (год публикации - 2016).

5. Аллилуев А.П., Котельникова О.В., Зинченко А.А., Серова О.В., Гордеева Е.А., Жигис Л.С., Разгуляева О.А., Мелихова Т.Д., Нокель Е.А., Дрожжина Е.Ю., Румш Л.Д. Потенциальная поливакцина на основе микробной IgA1 протеазы для профилактики бактериальных менингитов Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 6 (90) 2016 (год публикации - 2016).

6. Андрианова А.Г., Куджаев А.М., Дубовцева Е.С., Ротанова Т.В. Участие N-концевой области и ее характеристического coiled-coil-фрагмента в функционировании и поддержании структуры LonА-протеазы из E. coli. Биоорганическая химия, - (год публикации - 2017).

7. Байрамов А.В., Ерошкин Ф.М., Мартынова Н.Ю., Орлов Е.Е., Бородулин А.В., Зарайский А.Г. Секретируемый белок Noggin4 - активатор Wnt/PCP-сигнального каскада Биоорганическая химия, - (год публикации - 2017).

8. Барр К, Каннан Б, Корчагина Е, Попова И, Рыжов И, Генри С, Бовин Н. Biofunctionalizing nanofibers with carbohydrate blood group antigens Biopolymers, 105, 787-794 (год публикации - 2016).

9. Бобик Т.В., Шурдова Е.М., Смирнов И.В., Пономаренко Н.А., Хурс Е.Н., Кнорре В.Д., Габибов А.Г. Генетическое конструирование нативных комбинаций цепей В-клеточных репертуаров на поверхности метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, - (год публикации - 2017).

10. Бобровский А, Мочалов К, Олейников В, Соловьева Д, Шибаев В, Хамплова В, Кашпар М, Бубунов А. Photoinduced Changes of Surface Topography in Amorphous, Liquid-Crystalline, and Crystalline Films of Bent-Core Azobenzene-Containing Substance The Journal of Physical Chemistry B, 120 (22) 5073-5082 (год публикации - 2016).

11. Бобровский А, Шибаев В, Абрамчук С, Еляшевич Г, Самохвалов П, Олейников В, Мочалов К. Quantum dot–polymer composites based on nanoporous polypropylene films with different draw ratios European Polymer Journal, 82, 92-101 (год публикации - 2016).

12. Богданов И.В., Шенкарев З.О., Финкина Е.И., Мельникова Д.Н., Румынский Е.И., Арсеньев А.С., Овчинникова Т.В. A novel lipid transfer protein from the pea Pisum sativum: isolation, recombinant expression, solution structure, antifungal activity, lipid binding, and allergenic properties BMC Plant Biology, 16 (1)107:1-17 (год публикации - 2016).

13. Бочаров Э.В. Альтернативная димеризация рецепторных тирозинкиназ при передаче сигнала через мембрану клетки. "БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ", - (год публикации - 2017).

14. Васильченко А.С., Смирнов А.Н., Завриев С.К., Гришин Е.В., Васильченко А.В., Рогожин Е.А. Novel thionins from black seed (Nigella sativa L.) demonstrate antimicrobial activity International Journal of Peptide Research and Therapeutics, - (год публикации - 2016).

15. Васильченко А.С., Юрьев М., Рязанцев Д.Ю., Завриев С.К., Феофанов А.В., Гришин Е.В., Рогожин Е.А. Studying of Cellular Interaction of Hairpin-Like Peptide EcAMP1 From Barnyard Grass (Echinochloa crusgalli L.) Seeds With Plant Pathogenic Fungus Fusarium solani Using Microscopy Techniques Scanning, 9999:1-8 (год публикации - 2016).

16. Вильямс Э, Барр К, Корчагина Е, Тузиков А, Генри С, Бовин Н Ultra-fast glyco-coating of non-biological surfaces Intenational Journal of Molecular Science, 17(1) № 18 (год публикации - 2016).

17. Головин А.В., Смирнов И.В., Степанова А.В., Пономаренко Н.А., Белогуров А.А., Золотарева О.И., Кнорре В.Д., Хурс Е.Н., Чатзифимиоу С., Вильманс М., Блэкберн М., чл.-корр. РАН Хомутов Р.М., академик Габибов А.Г. Эволюция каталитических центров антител путем виртуального скрининга широкого репертуара мутантов на суперкомпьютере. Доклады Академии Наук, - (год публикации - 2017).

18. Дейгин В.И., Ксенофонтова О.Б, Хрущев А.Ю., Яцкин О.Н, Горячева А.С, Иванов В.Т. Chemical Platform for Preparation of Synthetic Orally Active Peptidomimetics with Hemoregulating Activity ChemMedChem, 11:1974-1977 (год публикации - 2016).

19. Ерошкин Ф.М., Мартынова Н.Ю., Байрамов А.В., Ермакова Г.В., Иванова А.С., Короткова Д.Д., Зарайский А.Г. Взаимодействие секретируемого фактора AGR 2 с его потенциальными рецепторами из семейства трехпетельных белков Биоорганическая химия, - (год публикации - 2017).

20. Есипов Р.С., Абрамчик Ю.А., Фатеев И.В., Муравьева Т.И., Артемова К.Г., Константинова И.Д., Куранова И.П., Мирошников А.И. Recombinant phosphoribosyl pyrophosphate synthetases from Thermus thermophilus HB27: Isolation and properties Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Volume 42, Issue 5, 1 September 2016, Pages 512-521 (год публикации - 2016).

21. Зиганшин Р.Х., Иванова О.М., Ломакин Я.А., Белогуров А.А., Ковальчук С.И., Азаркин И.В., Арапиди Г.П., Аниканов Н.А., Шендер В.О., Пирадов М.А., Супонева Н.А., Воробьева А.А., Габибов А.Г., Иванов В.Т., Говорун В.М. The Pathogenesis of the Demyelinating Form of Guillain-Barre Syndrome (GBS): Proteo-peptidomic and Immunological Profiling of Physiological Fluids Molecular & cellular proteomics, 15(7):2366-2378 (год публикации - 2016).

22. Зиновьева М.В., Костина М.Б., Чернов И.П., Кондратьева Л.Г., Свердлов Е.Д. KLF5, a New Player and New Target in the Permanently Changing Set of Pancreatic Cancer Molecular Drivers. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 42, 6: 606–61 (год публикации - 2016).

23. Зиновьева М.В., Кузьмич А.И., Монастырская Г.С., Свердлов Е.Д. Роль факторов подсемейства FOXA в эмбриональном развитии и онкогенезе поджелудочной железы. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 3: 98-103 (год публикации - 2016).

24. Кабальеро ГГ, Кальтнер Х, Михалак М, Шилова Н, Егрес М, Андре С, Людвиг АК, Маннинг ЙС, Шмидт С, Шнёльцер М, Бовин НВ, Рёйш Д, Копиц Й, Габиус Х-Й Chicken GRIFIN: A homodimeric member of the galectin network with canonical properties and a unique expression profile Biochimie, 128-129, 34-47 (2016). (год публикации - 2016).

25. Кабальеро ГГ, Флорес-Ибарра А, Михалак М, Хасбиуллина НР, Бовин НВ, Андре С, Маннинг ДжС, Вертези С, Руис ФМ, Кальтнер Х, Копиц Й, Ромеро А, Габиус Х-Й. Galectin-related protein: an integral member of the network of chicken galectins 1. From strong sequence conservation of the gene confined to vertebrates to biochemical characteristics of the chicken protein and its crystal structure Biochim Biophys Acta General Subjects, 1860 (10), pp. 2285-2297 (год публикации - 2016).

26. Каськова (Осипова) З.М., Царькова А.С., Ямпольский И.В. 1001 lights: luciferins, luciferases, their mechanisms of action and applications in chemical analysis, biology and medicine Chemical Society Rewiews, Chem. Soc. Rev., 2016, 45, 6048 (год публикации - 2016).

27. Кашкин К.Н., Свердлов Е.Д. Properties, functions, and therapeutic prospects of enhancer RNAs Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 42, 5: 473–478. (год публикации - 2016).

28. Кондратьева Л.Г., Свешникова А.А., Гранкина Е.В., Чернов И.П., Копанцева М.Р., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. Downregulation of expression of mater genes SOX9, FOXA2, and GATA4 in pancreatic cancer cells stimulated with TGF beta 1 epithelial-mesenchymal transition. Doklady Biochemistry and Biophysics, 469: 257–259 (год публикации - 2016).

29. Котельникова О.В., Зинченко А.А., Вихров А.А., Аллилуев А.П., Серова О.В., Гордеева Е.А., Жигис Л.С., Зуева В.С., Разгуляева О.А., Мелихова Т.Д., Нокель Е.А., Дрожжина Е.Ю., Румш Л.Д. Cерологическая оценка иммуногенных свойств рекомбинантных белков на основе IgA1 протеазы менингококка Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, т.161, №3, 369-372 (год публикации - 2016).

30. Куджаев А.М., Андрианова А.Г., Дубовцева Е.С., Серова О.В., Ротанова Т.В. Роль инсерционного α-спирализованного домена АТР-зависимой Lon-протеазы из E. coli в функционировании фермента Acta Naturae, - (год публикации - 2017).

31. Ламан А.Г., Лэйз Р., Шепеляковская А.О., Гарцева А., Бровко Ф.А., Гурьянова С.В., Алексеева Л.Г., Мещерякова Е.А., Иванов В.Т. Muramyl peptides activate innate immunity conjointly via YB1 and NOD2 Innate Immunity, 22(8):666-673 (год публикации - 2016).

32. Маерле АВ, Воронина ДВ, Доброчаева КЛ, Галанина ОЕ, Алексеев ЛР, Бовин НВ, Завриев СК, Рязанцев ДЮ. Immuno-PCR technology for detection of natural human antibodies to Lec disaccharide Glycoconjugate Journal, - (год публикации - 2016).

33. Надеждин К.Д., Гарсио-Карпио И., Гончарук С.А., Минеев К.С., Арсеньев А.С., Вилар М. Structural Basis of p75 Transmembrane Domain Dimerization JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, № 23, т. 291, с. 12346-12357 (год публикации - 2016).

34. Овчинникова Т.В. АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ КАК КОМПОНЕНТЫ СИСТЕМЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА Актуальная биотехнология, №3(18):26-27 (год публикации - 2016).

35. Олейников ВА Modern nanotools for medicine and biology. International Journal on Immunorehabilitation, 18(8), p. 46 (год публикации - 2016).

36. Олейников ВА, Мочалов КЕ, Соловьева ДО, Чистяков АА, Лукашев ЕП, Набиев ИР. The effect of silver nanoparticles on the photocycle of bacteriorhodopsin of purple membranes of Halobacterium salinarum Optics and Spectroscopy, 121(2), 210-219 (год публикации - 2016).

37. Осипова ЗМ СИНТЕТИЧЕСКИЙ АНАЛОГ ЛЮЦИФЕРИНА FRIDERICIA С УЛУЧШЕННЫМИ СПЕКТРАЛЬНЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, - (год публикации - 2017).

38. Пазынина ГВ, Цыганкова СВ, Саблина МА, Парамонов АС, Тузмков АБ, Бовин НВ. Stereo- and regioselective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides Mendeleev Communications, 26, 380-382 (год публикации - 2016).

39. Пантелеев П.В., Мышкин М.Ю., Шенкарев З.О., Овчинникова Т.В. Dimerization of the antimicrobial peptide arenicin plays a key role in the cytotoxicity but not in the antibacterial activity Biochemical and Biophysical Research Communications, - (год публикации - 2016).

40. Пахомов А.А., Черткова Р.В., Деев И. Е., Петренко А. Г., Мартынов В.И. СОЗДАНИЕ ФОТОАКТИВИРУЕМОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА НА ОСНОВЕ ФОТОКОНВЕРТИРУЕМОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА Биоорганическая химия, - (год публикации - 2017).

41. Плешкан В.В., Алексеенко И.В., Тюлькина Д.В., Кузьмич А.И., Зиновьева М.В., Свердлов Е.Д. Белок активации фибробластов FAP как возможная мишень в противоопухолевой стратегии. Молекулярная генетика, микробиология и вирусологи, 3: 90-97 (год публикации - 2016).

42. Почечуева Т, Чинарев А, Шёцау А, Федье А, Бовин Н, Хакер НФ, Якоб Ф, Хайнцельман-Шварц В. Blood plasma-derived anti-glycan antibodies to sialylated and sulfated glycans identify ovarian cancer patients PLOS One, 11(10) №e0164230 (год публикации - 2016).

43. Рыжов ИМ, Корчагина ЕЮ, Попова ИС, Тыртыш ТВ, Парамонов АС, Бовин НВ. Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system Carbohydrate Research, 430, 59-71 (год публикации - 2016).

44. Рыжов ИМ, Тузиков АБ, Корчагина ЕЮ, Попова ИС, Тыртыш ТВ, Пазынина ГВ, Генри С, Бовин НВ. Function-Spacer-Lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies Carbohydrate Research, 435, 83-96 (год публикации - 2016).

45. Сай-Гонг Игнатиус О., Шрок А. Б., Бочаров Э.В., Клемпер С. Д., Хаддат К. К., Джонсон М., Гитлиц Б. Д., Чанг Д., Кампрегер П., Росс Д. С., Стэфанс Ф. Д., Миллер В. А., Сух Д. Х., Али С. М., Велчети В. HER2 transmembrane mutations (V659/G660) that stabilize homo- and hetero-dimerization are rare oncogenic drivers in lung adenocarcinoma that respond to afatinib Journal of Thoracic Oncology, - (год публикации - 2017).

46. Свердлов Е.Д. Multidimensional Complexity of Cancer. Simple Solutions Are Needed. Biochemistry (Mosc), 81(7):731-8 (год публикации - 2016).

47. Сизова С, Генералова А, Третьяк М, Мочалов К, Самохвалов П, Набиев И, Олейников В. Submicron QDs-containing particles as nano-thermosensors Materials Today: Proceedings, 3(2), 617-621 (год публикации - 2016).

48. Султанов Р.И., Арапиди Г.П., Виноградова С.В., Говорун В.М., Ластер Д.Г., Игнатов А. Н. Comprehensive analysis of draft genomes of two closely related pseudomonas syringae phylogroup 2b strains infecting mono- and dicotyledon host plants BMC Genomics, - (год публикации - 2017).

49. Тюлькина Д.В., Плешкан В.В., Алексеенко И.В., Копанцева М.Р., Свердлов Е.Д. Expression of the FAP Gene in Non-Fibroblast Human Cell Lines.Development of Tumor-Associated Fibroblast Models. Doklady Biochemistry and Biophysics, 470, 1: 319–321 (год публикации - 2016).

50. Фесенко И.А., Середина А.В., Арапиди Г.П., Птушенко В., Урбан А., Ковальчук С.И., Бутенко И., Бабалян К., Хазигалеева Р.А., Пушкова Е.Н., Аниканов Н., Иванов В.Т., Говорун В.М. The Physcomitrella patens chloroplast proteome changes in response to protoplastation Frontiers in Plant Science, Frontiers in plant science, 7 (год публикации - 2016).

51. Фесенко И.А., Хазигалеева Р.А., Говорун В.М., Иванов В.Т. Analysis of endogenous peptide pools of Physcomitrella patens moss Methods in Molecular Biology, - (год публикации - 2017).

52. Финкина Е.И., Мельникова Д.Н., Богданов И.В., Овчинникова Т.В. Plant pathogenesis-related proteins PR-10 and PR-14 as components of innate immunity system and ubiquitous allergens Current Medicinal Chemistry, - (год публикации - 2017).

53. Хазигалеева Р.А., Фесенко И.А. Биологически-активные пептиды кодируемые короткими открытыми рамками считывания sORFs Биоорганическая химия, - (год публикации - 2017).

54. Юичи Оба, Кассиус Стевани, Андерсон Оливейра, Царькова А.С., Чепурных Т.В., Ямпольский И.В. Selected least studied but not forgotten bioluminescent systems Photochemistry and Photobiology, - (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Результаты работы по проекту опубликованы на сайте ИБХ РАН: http://www.ibch.ru/press/news/science/2273 РЕЦЕПТОРНЫЕ И СИГНАЛЬНЫЕ БЕЛКИ. АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ На основе данных гетероядерной ЯМР-спектроскопии и молекулярного моделирования конформационных перестроек и межмолекулярных взаимодействий описаны молекулярные механизмы активации рецепторов эпидермальных факторов роста (EGFR) и рецепторов факторов роста фибробластов (FGFR3) из организма человека с учетом роли липидного окружения, как одного из главных компонентов самосогласованной сигнальной системы. В рамках разработанного липид-опосредованного механизма передачи сигнала через мембрану клетки предложены альтернативные последовательности структурных перестановок, наблюдаемых при активации рецептора FGFR3 при связывании кислого fgf1 и основного fgf2 лигандов с существенно различными электрическими зарядами. Продолжены работы по изучению структуры и механизма активации рецепторной тирозинкиназы ИРР, являющейся клеточным рН-сенсором при помощи криоэлектронной микроскопии и малоуглового рентгеновского рассеяния. Определены изменения конформации эктодомена ИРР при повышении рН среды. Параллельно разрабатывалась методика экспрессии и выделения полноразмерного таггированного рецептора ИРР для следующего этапа анализа механизма рН-зависимой активации данной тирозинкиназы в нанодисках. В ходе работы по проекту различными методами подтверждено взаимодействие белка Noggin4 с секретируемым белком - Wnt11. Показано, что данное взаимодействие необходимо для регенерации у модельного объекта - шпорцевой лягушки. Методом ЯМР проведено исследование структуры рецептора Tfp4. С использованием данных транскриптомного секвенирования изучены сигнальные каскады, регулируемые белком Ag1 и его роль в раннем развитии мозга и при регенерации. Аналогично, сравнительный анализ масштабного секвенирования транскриптомов почек мышей дикого типа и нокаутных по гену ИРР было использовано для выявления учaстников сигнальных путей данной рецепторной тирозинкиназы. Также изучены сигнальные каскады эндогенного рецептора ИРР в клетках инсулиномы, способных секретировать инсулин. Подобран оптимальный флуоресцентный рН- чувствительный белок для экспериментов in vivo. Получена конструкция и начаты эксперименты по получению трансгенных животных, экспрессирующих данный рН рН-сенсор на поверхности клеток. МАСТЕР-РЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ И ГЕНЫ РАЗВИТИЯ И КАНЦЕРОГЕНЕЗА НА ПРИМЕРЕ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Рак часто рассматривают как проблему биологии развития. Эмбриональное развитие человека - это строго регулируемый процесс образования упорядоченных структур – тканей и органов. А рак, напротив, - это процесс дерегуляции, ведущий к разрушению этих структур. Нашей лабораторией и другими авторами неоднократно отмечалось, что при развитии раковой опухоли наблюдается реактивация некоторых эмбриональных генов, и наоборот, ряд генов, характерных для взрослого организма, теряют свою активность. Мы выдвинули гипотезу, что ключевые для эмбрионального развития того или иного органа гены, так называемые мастер гены, являются также ключевыми для возникновения и развития раковой опухоли этого органа и последующего возникновения метастазов в других органах». Исследование таких мастер генов, их подавление или активация, могло бы открыть возможность возвращения раковых клеток к нормальному исходному состоянию, или найти связанные с ними другие гены, которые можно использовать как мишени терапевтического воздействия. Наши исследования посвящены молекулярно-генетическим особенностям аденокарциномы поджелудочной железы (АПЖ), одной из самых трудно поддающихся лечению опухолей человека. В структуре смертности от онкологических заболеваний АПЖ занимает четвертое место и существует острая потребность в новых подходах к ее терапии. Однако поджелудочная железа очень сложна по своему строению и, хотя ее изучению и изучению ее патологий посвящены горы научной литературы, пока точно не известны мастер-регулирующие гены и белки, которые являются ключевыми для ее развития и для развития АПЖ и могли бы быть мишенью при терапии. Нашей задачей является выявление таких мастер-регуляторных генов, исследование этих генов в норме и их изменений в процессе канцерогенеза, а также исследование возможностей их использования в качестве мишеней для терапии АПЖ. В прошлом году мы получили, на мой взгляд, значимый фундаментальный результат – мы идентифицировали группу мастер регуляторов развития поджелудочной железы, которые координированно выключаются в клетках АПЖ. В этом году эти исследования продолжались. Мы двигались по двум принципиальным направлениям. Во-первых, исследовали вопрос, что произойдет с клетками АПЖ, если в них ввести и заставить работать идентифицированные мастер гены, которые выключились при образовании опухоли, и наоборот, что будет, если подавить работу генов которые включились при ее образовании. Для этих целей мы создали специальные генетические конструкции, которые, при введении в раковую клетку выполняют вышеуказанные задачи, ввели их в раковые клетки и в настоящее время анализируем, как изменяются их различные свойства. При этом мы сделали важный принципиальный шаг. До недавних пор все усилия исследователей, стремящихся найти способы лечения рака, были направлены на собственно раковые клетки. Однако, в последние годы стало отчетливо ясно, что раковые клетки успешно развиваются только благодаря своему окружению, так называемой строме. При этом раковые клетки очень пластичны и могут превращаться в компоненты стромы, подвергаясь так называемому эпителиально-мезенхимальномы переходу. Думают, что этот переход важен для способности метастазировать - рассеивать опухоль по организму. В этом переходе также участвуют мастер гены. Мы в нашей работе исследуем способы воздействия на мастер гены, работающие как в раковых так и в стромальных клетках. Сегодня мы еще далеки от окончательных заключений, но уже ясно, что подавление или, наоборот, активация определенных мастер генов и в раковых клетках и в строме существенно меняет работу целого ряда других генов, каким то образом влияя на их регуляцию. Мы даже попробовали посмотреть, какие элементы генома ответственны за это изменение и выявили ряд таких регуляторов – энхансеров и промоторов. Полученные результаты создают базу для обоснованного перехода на другой более высокий уровень исследований. Если до этого вся работа выполнялась на клетках, то далее она будет развиваться на модельных организмах - мышах. При этом будут анализироваться те гены, которые мы идентифицировали на уровне клеток. ПЕПТИДОМИКА. ПЕПТИДНЫЕ ФАКТОРЫ СИСТЕМЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА Исследованы цитотоксические свойства аналогов пептида мечехвоста Tachypleus tridentatus, обладающих высокой селективностью антибактериального действия в отношении нормальных клеток человека – астроцитов и фибробластов. Показано, что аналоги TachY8S и TachI11S обладают сравнительно невысокой цитотоксичностью при концентрациях вплоть до 50 мкМ, что позволяет рассматривать их как перспективные соединения для разработки антибиотиков с широким спектром действия. Исследована способность ряда антимикробных пептидов, относящихся к различным структурным классам (ареницина-2, апидецина 1b, TachI, PRP7(1-22), PRP7(1-16), ChBac3.4, тритрптицина), к ингибированию процесса бактериальной трансляции. Показано отсутствие данного типа активности у ареницина-2, TachI и тритрптицина. Пептид PRP7(1-22), продемонстрировавший высокую эффективность ингибирования рибосомального биосинтеза белка, был подвергнут сканированию аланином, что позволило выявить ключевые аминокислотные остатки, необходимые для осуществления биологической функции пептида. Получены лабораторные образцы липид-транспортирующих белков гороха посевного Pisum sativum Ps-LTP1, меченного стабильными изотопами 13C, 15N, и амброзии полынолистной Ambrosia artemisiifolia Amb a 6. Для этого были выбраны родительские штаммы E. coli и получены штаммы-продуценты. Проведена оптимизация условий для экспрессии гибридных белков в клетках E. coli. Целевые рекомбинантные 13C,15N-Ps-LTP1 и Amb a 6 были получены с использованием аффинной хроматографии, реакции расщепления гибридных белков бромцианом и ОФ-ВЭЖХ. Полученные 13C,15N-Ps-LTP1 и Amb a 6 были охарактеризованы методами SDS-электрофореза в ПААГ, времяпролётной масс-спектрометрии МАЛДИ, КД-спектроскопии и автоматического N-концевого микросеквенирования по методу Эдмана. Степень включения изотопных меток 13C и 15N в структуру молекулы Ps-LTP1 гороха была установлена методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии. Проведен пептидомный анализ сорного злака – ежовника обыкновенного Echinochloa crusgalli L. Идентифицированы новые молекулы, гомологичные антимикробным пептидам альфа-харпининам с уникальным 4-цистеиновым мотивом, установлены их молекулярные массы и частичные аминокислотные последовательности. Оптимизирована и упрощена методика выделения и очистки комплекса защитных полипептидов из семян ежовника, включающая в себя две основных стадии фракционирования методами жидкостной хроматографии высокого и среднего давления. Получены количественные данные об усилении антимикробной активности при действии комплекса альфа-харпининов семян ежовника из группы EcAMP, что выражалось в подавлении роста мицелия грибов. Кровь является соединительной тканью, состав которой изменяется в зависимости от процессов, происходящих в организме. Благодаря своему сравнительно небольшому размеру пептиды легче белков преодолевают клеточные мембраны и эпителиальные барьеры. Среди пептидов, обнаруживаемых в крови, есть как фрагменты секретируемых различными тканями белков, выполняющие свои функции в плазме, так и лиганды рецепторов: гормоны, цитокины и медиаторы клеточного ответа. В небольших количествах в крови могут присутствовать пептидные маркеры различных заболеваний (к примеру, онкомаркеры) и даже чужеродные пептиды, относящиеся к патогенным организмам и инфекционным агентам. Чтобы получить представление о составе пептидома крови в норме, мы провели LC-MS/MS анализ 20 образцов сыворотки и плазмы крови здоровых доноров на масс-спектрометре TripleTOF 5600+. Образцы были подготовлены по ранее разработанным нами протоколам десорбции пептидов с поверхности представленных белков плазмы крови с последующими стадиями хроматографической очистки. Геномы содержат миллионы коротких (<100 кодонов) открытых рамок чтения (sORF), которые обычно отбрасываются при аннотации генов. Тем не менее, пептиды, кодируемые sORFS, могут играть важную биологическую роль, и их влияние на клеточные процессы недооценено. Функциональный анализ одного из таких пептидов, кодируемого длинной некодирующей РНК, показал, что он участвует в регуляции роста и дифференциации мха. Высокая эволюционная скорость и распространённость sORFs позволяют предположить, что они могут служить резервом потенциально активных пептидов и играть важную роль в эволюции генов. Помимо пептидов, кодируемых sORFs, растительная клетка содержит большое количество фрагментов белков, образующихся при протеолитической деградации, но до сих пор не известно, являются ли эти пептиды побочными продуктами деградации белка или важными биологически активными компонентами клетки. В нашем исследовании мы получили доказательства активной регуляции как внутриклеточными, так и внеклеточными пептидными пулами, влиянии на эти процессы фитогормонов и продемонстрировали биологическую активность ряда пептидов. БЕЛОК И ГЛИКАН-ОПОСРЕДОВАННЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ДИНАМИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ Изучено взаимодействие антител (IgM) к антигену группы крови А, иммобилизованных на SPR-чипе, с А-эритроцитами (которые имеют в своем составе как гликолипиды, так и гликопротеины с А-антигенностью), а также «упрощенными» эритроцитами, содержащими только один из этих компонентов. Первые получали путем встраивания гликолипида GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAc-spacer-DOPE в эритроциты группы крови О, а вторые – путем ковалентного присоединения тетрасахарида к периферическим белкам гликокаликса. Такой подход позволил изучить не только кинетику взаимодействия эритроцитов с поверхностью в динамических условиях, но и перенос гликолипидов с клетки на поверхность. Проведено молекулярно-динамическое симулирование природного гликолипида Gb3 и его синтетического аналога Pk-DOPE в составе плоского мембранного бислоя и в мицелле, априори имеющей высокую кривизну. Предполагалось, что благодаря кривизне, в мицелле будет более доступным для узнавания естественными анти-Pk антителами внутренняя часть трисахарида, которая принципиальна для узнавания антигена этими антителами (они узнают синтетический аналог, но не взаимодействуют с природным гликолипиом). Эксперимент показал, что внутренний остаток Glcβ в мицеллярных кластерах действительно становится более доступным для растворителя, и, соответственно, для взаимодействия с антителами. Синтезированы удобные для иммобилизации на SPR-чипе сиалоолигосахариды: Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc (рецептор для человеческих вирусов) и Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc (рецептор для птичьих вирусов), последний в качестве отрицательного контроля для экспериментов с человеческими вирусами гриппа. Их взаимодействие с сиалорецептором на чипе происходит независимо от скорости потока, более того, оно оказывается необратимым – вирус не удается элюировать с чипа даже в жестких условиях; причина необратимости будет выясняться. Моделирование углевод-белкового взаимодействия в гликокаликсе клетки проводилось таким образом: в мембрану эритроцитов встраивались синтетические гликолипиды, имеющие в качестве полярной «головы» тетрасахарид GalNAcα1-3(Fucα1-2)Galβ1-4GlcNAc, всего пять вариантов, отличающиеся расстоянием между липидом и гликаном, а также архитектурой гликолипида. Взаимодействие с антителами против данного гликана выявили следующую закономерность: только те варианты, которые не заглублены в гликокаликс, способны связывать антитела (IgG) к гликану, независимо от скорости потока жидкости, в которой находятся антитела, и от времени инкубации. Проводилось измерение кинетики переноса гликолипида в следующих трёх системах: клетка HUVEC → бактерия; бактерия → клетка HUVEC; бактерия→бактерия. Первый процесс является очень медленным и малоэффективным. Перенос с бактерии на бактерию является самым быстрым. Перенос с клетки млекопитающих на бактерию идет медленнее - заметно проходит уже за минуты, а на максимум выходит за десятки минут. Мы объясняем однонаправленность переноса в системе клетка-бактерия наличием у клетки HUVEC мощного гликокаликса, который «выпускает» наружу гликолипиды в виде отдельных молекул или небольших везикул, но не «впускает» внешние липиды внутрь. В дальнейшем предполагается повторить эксперименты на эритроцитах, у которых толщина гликокаликса на порядок ниже, чем у HUVEC, изучить зависимость процесса переноса от скорости потока одного объекта относительно другого. Синтетический липид biot-CMG2-DOPE был изучен методами AFM, TEM, динамического светорассеяния и малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) в сочетании с молекулярно-динамической симуляцией. Оказалось, что на ровной поверхности он формирует монослой, где почти все молекулы имеют одну и ту же стабильную конформацию, в которой полярный фрагмент CMG2 сложен пополам в своей шарнирной средней части, а остаток биотина утоплен в неполярном монослое DOPE. Несмотря на маскированность биотина, монослой без каких-либо затруднений взаимодействовал со стрептавидином. Молекулярно-динамическая симуляция показала, что события «выхода» остатков биотина на поверхность монослоя имеют низкую, но конечную вероятность. Таким образом, процесс взаимодействия монослоя со стрептавидином является белок-индуцированным. По-видимому, аналогичные явления происходят и в природе, на клеточной мембране; изученный нами монослой является удобной экспериментальной системой для их моделирования. Разрабатывался микрочипный вариант иммуно-ПЦР на основе 3D-технологии ИМБ РАН, с тем расчетом, чтобы можно было отделять от стеклянной основы гелевые микроэлементы и каждый из них подвергать обычной процедуре иммуно-ПЦР в пробирке. При такой постановке чувствительность метода не превышала чувствительности флуоресцентного метода детекции тех же антител без стадии ПЦР (а методически была значительно сложнее). В 2018 г. будет апробирован вариант, основанный на 2D-чипе в сочетании с иной ПЦР-технологией. БЕЛКИ БИОКАТАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ Биолюминесценция, или способность тысячи видов морских и наземных живых организмов излучать видимый свет, - одно из самых удивительных явлений природы. В рамках выполнения проекта были установлены структуры люциферинов еще двух совершенно новых биолюминесцентных систем – почвенного червя Fridericia heliota и высших грибов. Плюс, развивая данный проект, был установлен точный химический механизм биолюминесценции Fridericia heliota, который, как это ни удивительно, очень схож с механизмом функционирования обычного светлячка. Работы по программе гранта позволили определить структуры ряда природных аналогов люциферина, выделенных из червей, – это приоткрыло завесу на пути к изучению биосинтеза молекулы. Люциферин Fridericia уникален – он нетоксичен, прост в получении, и при этом в отличие от всех остальных люциферинов исключительно стабилен – месяцами может храниться в сухом виде и в растворе. Одной из главных задач проекта мы считаем создание новых катализаторов на основе существующих ферментов. Таким ферментом, например, является бутирилхолинэстераза. Биологические антидоты на ее основе способны нейтрализовать широкий спектр фосфорорганических токсинов (ФОТ). В рамках проекта РНФ удалось создать новый каталитический антидот. В рамках выполнения этапа была создана оптимизированная библиотека генов, содержащая до 1 миллиона различных вариантов фермента. Далее, применяя оригинальную, не имеющую аналогов в мире, технологию поиска биокаталитической активности мы провели отбор только тех вариантов фермента, которые были устойчивы к ингибированию флуоресцентными аналогами пестицида параоксон и боевого отравляющего вещества зомана. Были выбраны варианты фермента, обладающие устойчивостью к ингибированию соответствующими ФОТ, два из них гидролизовали пестицид параоксон. Таким образом, был сделан шаг к созданию эффективных каталитических антидотов на основе БуХЭ против отравлений ФОТ. В направлении поиска новых ферментов-протеаз терапевтического и биотехнологического назначения был разработан новый метод позитивной селекции протеолитической активности ферментов на поверхности дрожжевых клеток. Метод успешно квалицирован на примере биотехнологического фермента – энтерокиназа. Изучены иммуногенность и протективность двух рекомбинантных белков, фрагментов IgA1 протеазы N. meningitidis, способных обеспечить защиту животных при заражении менингококками серогрупп А, В и С. В опытах по пассивной защите мышей с использованием сыворотки животных, иммунизированных этими белками, и с помощью адаптивного переноса лимфоцитов этих мышей интактным мышам-реципиентам показана важная роль клеточного и гуморального факторов в формировании иммунитета к менингококку серогруппы В. Продолжены работы по исследованию мультиферментного каскада превращения D-пентоз в пуриновые нуклеотиды в «одной колбе» с применением рибокиназы, фосфорибозилпирофосфатсинтетазы и аденинфосфорибозилтрансферазы. На основании сравнения со структурами гомологичных белков (APRT термофильного штамма Thermus thermophilus HB8 и Homo sapiens APRT) локализовано положение активного центра фермента и ряда функционально важных аминокислотных остатков.

 

Публикации

1. Абжалимов И.Р., Зиновьева М.В., Николаев Л.Г., Копанцева М.Р., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. Expression of transcription factor genes in cell lines corresponding to different stages of pancreatic cancer progression Doklady Biochemistry and Biophysics, 475, 1: 267–270 (год публикации - 2017).

2. Акимов С.А., Волынский П.Е., Галимзянов Т.Р., Кузьмин П.И., Павлов К.В., Батищев О.В. Pore formation in lipid membrane II: Energy landscape under external stress Scientific Reports, 2017 Oct 2;7(1):12509 (год публикации - 2017).

3. Алам Ф., Ануграхам М., Хуан Е.-Л., Колер Р.С., Винкельбах К., Гретхер Я., Лопес М.Н., Хасбиуллина Н., Бовин Н.В., Шлотербек Г., Якоб Ф. Altered (neo-) lacto series glycolipid biosynthesis impairs α2-6 sialylation on N-glycoproteins in ovarian cancer cells Scientific Reports, 7-45367 (год публикации - 2017).

4. Байрамов А.В., Ермакова Г.В., Ерошкин Ф.М., Кучерявый А.В., Мартынова Н.Ю., Зарайский А.Г. Presence of homeobox gene of Anf class in Pacific lamprey Lethenteron camtschaticum confirms the hypothesis about the importance of emergence of Anf genes for the origin of telencephalon in vertebrate evolution RUSSIAN JOURNAL OF DEVELOPMENTAL BIOLOGY, Том 48, Выпуск 4, Страницы 241-251 (год публикации - 2017).

5. Белло-Хиль Д., Хасбиуллина Н., Шилова Н., Маньес Р. Repertoire of BALB/c Mice Natural Anti-Carbohydrate Antibodies: Mice vs. Humans Difference, and Otherness of Individual Animals Frontiers in Immunology, 8-1449 (год публикации - 2017).

6. Бенедетти Е., Пучич-Бакович М., Кесер Т., Валь А., Хассинен А., Ян Ж.-Е., Лю Л., ...Овчинникова Т., Бовин Н., Келлокумпу С., Теис Ф.Ж., Лауч Г., Крумзиек Я. Network inference from glycoproteomics data reveals new reactions in the IgG glycosylation pathway Nature Communications, 8-1483 (год публикации - 2017).

7. Бобик Т.В., Костин Н.Н., Кнорре В.Д., Габибов А.Г. и Смирнов И.В. Получение протеолитических биокатализаторов высокой специфичности с помощью скрининговых технологий (Generation of high specificity proteolytic biocatalysts via screening technologies) Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, - (год публикации - 2018).

8. Бочаров Е.В., Брагин К.В., Павлов К.В., Бочарова О.В., Минеев К.С., Полянский А.А., Волынский П.Е., Ефремов Р.Г., Арсеньев А.С. The Conformation of the Epidermal Growth Factor Receptor Transmembrane Domain Dimer Dynamically Adapts to the Local Membrane Environment BIOCHEMISTRY, том 56, выпуск 12, стр.1697-1705 (год публикации - 2017).

9. Бочаров Э.В., Шаронов Г.В., Бочарова О.В., Павлов К.В. Conformational transitions and interactions underlying the function of membrane embedded receptor protein kinases BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-BIOMEMBRANES, Том: 1859, Выпуск: 9, Стр.: 1417-1429. (год публикации - 2017).

10. Виноградова Т.В., Свердлов Е.Д. PDX1: A unique pancreatic master regulator constantly changes its functions during embryonic development and progression of pancreatic cancer Biochemistry (Moscow), 82 (8): 887-893 (год публикации - 2017).

11. Волынский П.Е., Ефремов Р.Г., Михалев И., Доброчаева К.Л., Тузиков А.Б., Корчагина Е.Ю., Обухова П., Рапопорт Е.М., Бовин Н.В. Why human anti-Galα1–4Galβ1-4Glc natural antibodies do not recognize the trisaccharide on erythrocyte membrane. Molecular dynamics and immunochemical investigation Molecular Immunology, 90, 87-97 (год публикации - 2017).

12. Гнатенко Д.А., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. The Role of the Signaling Pathway FGF/FGFR in Pancreatic Cancer Biochemistry (Moscow), Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 11, 2: 101–110 (год публикации - 2017).

13. Гнатенко Д.А., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. Fibrolast Growth Factors and Pancreas Organogenesis Biochemistry (Moscow), Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 11, 4: 346–353 (год публикации - 2017).

14. Гугля Е.Б., Котлобай А.А., Секретова Е.К., Волкова П.В., Ямпольский И.В. Возможна ли биолюминесценция у растений? (Bioluminescence: is it possible for a plant?) Вестник РГМУ (Bulletin of RSMU), 02.2017 Март-Апрель, стр. 61-71 (год публикации - 2017).

15. Деев И.Е., Попова Н.В., Серова О.В., Женило С.В., Реголи М., Бертелли Е., Петрено А.Г. Alkaline pH induces IRR-mediated phosphorylation of IRS-1 and actin cytoskeleton remodeling in a pancreatic beta cell line BIOCHIMIE, том 138,стр. 62-69 (год публикации - 2017).

16. Деев И.Е., Шаяхметова Д.М., Женило С.В., Радионов Н.В., Петренко А.Г. ПРОФИЛЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ПОЧКАХ МЫШЕЙ, НОКАУТНЫХ ПО ГЕНУ insrr (Analysis of the Expression Profile of Genes in the Kidneys of Mice Lacking the insrr Gene) Биоорганическая химия (RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY), - (год публикации - 2017).

17. Дубовский П.В., Дубинный М.А., Волынский П.Е., Пустовалова Я.И., Коншина А.Г., Уткин Я.Н., Арсеньев А.С., Ефремов Р.Г. Impact of Membrane Partitioning on the Spatial Structure of an S-type Cobra Cytotoxin Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, - (год публикации - 2017).

18. Захарова М.Ю., Кузнецова А.А., Калиберда Е.Н., Дронина М.А., Колесников А.В., Козырь А.В., Смирнов И.В., Румш Л.Д., Федорова О.С., Кнорре Д.Г., Габибов А.Г., Кузнецов Н.А. Evolution of inhibitor-resistant natural mutant forms of HIV-1 protease probed by pre-steady state kinetic analysis Biochimie, - (год публикации - 2017).

19. Зиганшин Р.Х., Рябинин В.В., Азаркин И.В., Иванов В.Т. Оптимизация условий пептидомного анализа плазмы крови (Optimization of conditions of peptidome analysis of blood plasma) БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ (RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY), - (год публикации - 2018).

20. Зинченко А.А., Котельникова О.В., Гордеева Е.А., Прокопенко Ю.А., Разгуляева О.А., Серова О.В., Мелихова Т.Д., Нокель Е.А., Жигис Л.С., Зуева В.С., Аллилуев А.П., Румш Л.Д. Immunogenic and Protective Properties of Neisseria meningitidis IgA1 Protease and of Its Fragments Russian Journal of Bioorganic Chemistry, - (год публикации - 2018).

21. Калмыкова С.Д., Арапиди Г.П., Урбан А.C., Осетрова М.С., Иванов В.Т., Говорун В.М. In silico анализ потенциальных биологических функций пептидов (In silico analysis of peptides potential biological functions) БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ (RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY), - (год публикации - 2018).

22. Кашкин К.Н., Чернов И.П., Дидыч Д.А., Свердлов Е.Д. Construction of a combinatorial library of chimeric tumor-specific promoters BioTechniques, 63, 3:107-116 (год публикации - 2017).

23. Кондратьева Л. Г., Чернов И. П., Зиновьева М. В., Копанцев Е. П., Свердлов Е. Д. Expression of master regulatory genes of embryonic development in pancreatic tumors Doklady Biochemistry and Biophysics, 475, 1: 250–252 (год публикации - 2017).

24. Кондратьева Л.Г., Дидыч Д.А., Чернов И.П., Копанцев Е.П., Стукачева Е.А., Виноградова Т.В., Свердлов Е.Д. Dependence of expression of regulatory master genes of embryonic development in pancreatic cancer cells on the intracellular concentration of the master regulator PDX1 Doklady Biochemistry and Biophysics, 475, 1: 250–252 (год публикации - 2017).

25. Кондратьева. Л.Г., Кашкин К.Н., Чернов И.П., Стукачева Е.А., Дидыч Д.А., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. PCNA: конститутивный промотор человека для экспрессии генов в целях их функционального и генно-терапевтического использования.(PCNA: constitutive human promoter for expression of genes for their function al and therapeutic use) Молекулярная генетика, микробиология и вирусология (Molecular genetics, microbiology and virology), 35, 3: 89-92 (год публикации - 2017).

26. Коншина А.Г., Крылов Н.А., Ефремов Р.Г. Cardiotoxins: functional role of local conformational changes Journal of Chemical Information and Modeling, - (год публикации - 2017).

27. Копанцев Е.П., Гранкина Е.В. Копанцева М. Р., Свердлов Е.Д. IGF-I/IGF-IR сигнальная система и рак поджелудочной железы (IGF-I/IGF-IR signalling system and pancreatic cancer) Молекулярная генетика, микробиология и вирусология (Molecular genetics, microbiology and virology), 35, 3:83-88 (год публикации - 2017).

28. Кузьмин Д.В., Емельянова А.А., Калашникова М.Б., Пантелеев П.В., Баландин С.В., Серебровская Е.О., Белогурова-Овчинникова О.Ю., Овчинникова Т.В. Comparative in vitro study on cytotoxicity of recombinant β-hairpin peptides CHEMICAL BIOLOGY AND DRUG DESIGN, Volume 90 , Pages1-10 (год публикации - 2017).

29. Логвина Н.А., Шендер В.О., Арапиди Г.П., Холина Т.Д. Роль везикулярной передачи межклеточных сигналов в развитии злокачественных новообразований (The role of extracellular vesicles mediating intercellular signal transfer in cancer development) БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ (RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY), - (год публикации - 2018).

30. Людвиг А.-К., Михалак М., Шилова Н., Кальтнер Г., Бовин Н., Копитц Ю., Габиус Х.-Й. Studying structural significance of galectin design by playing modular puzzle: homodimer generation for tandem-repeat-type galectin-8 by domain swapping Molecules, 22(9)-1572 (год публикации - 2017).

31. Михайлова А.Г., Ракитина Т.В., Тимофеев В.И., Карлинский Д.М., Корженевский Д.А., Агапова Ю.К., Власкина А.В., Овчинникова М.В., Горленко В.А., Румш Л.Д. Activity modulation of the oligopeptidase B from Serratia proteamaculans by site-directed mutagenesis of amino acid residues surrounding catalytic triad histidine Biochimie, V. 139, p. 125-136 (год публикации - 2017).

32. Оба Ю., Сузуки Ю., Мартинс Г.Н.Р., Карвалью Р.П., Перейра Т.А., Вальденмаер Г.Е., Кани С., Наито М.,Оливеира А.Г., Дорр Ф.А., Пинто Е., Ямпольский И.В., Стефани С.В. Identification of hispidin as a bioluminescent active compound and its recycling biosynthesis in the luminous fungal fruiting body Photochemical & Photobiological Sciences, 16(9):1435-1440 (год публикации - 2017).

33. Пантелеев П.В., Баландин С.В., Иванов В.Т., Овчинникова Т.В. A Therapeutic Potential of Animal β-hairpin Antimicrobial Peptides CURRENT MEDICINAL CHEMISTRY, Volume 24, Issue 17, Pages 1724-1746 (год публикации - 2017).

34. Пахомов А.А., Мартынов В.И., Орса А.Н., Бондаренко А.А., Черткова Р.В., Лукьянов К.А., Петренко А.Г., Деев И.Е. Fluorescent protein Dendra2 as a ratiometric genetically encoded pH-sensor BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, Том: 493 Выпуск: 4 Стр.: 1518-1521 (год публикации - 2017).

35. Подшивалов Д.Д., Сидоров-Бирюков Д.Д., Тимофеев В.И., Литунов А.А., Костромина М.А., Синицына К.В., Муравьева Т.И., Есипов Р.С. Моделирование комплекса фосфорибозилпирофосфат синтетазы из T. thermophilus с АТФ и рибозо-5-фосфатом (Modeling of complex of recombinant phosphoribosylpyrophosphate synthetase from Thermus thermophilus HB27 with ATP and riboso-5-phosphate) Кристаллография (Crystallography Reports), - (год публикации - 2018).

36. Рогожин Е.А., Кисиль О.В., Черетаев И.В., Завриев С.К. Характеристика белково-пептидного экстракта семян мари белой Chenopodium album L.: изучение компонентного состава, антимикробных и анальгетических свойств (Characterization of protein and peptide extract from much weed Chenopodium album L.) АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ (ANTIBIOTIKI I KHIMIOTERAPIYA), - (год публикации - 2017).

37. Синицына Е.В., Тимофеев В.И., Тузова Е.С., Костромина М.А., Муравьева Т.И., Есипов Р.С., Куранова И.П. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of recombinant adenine phosphoribosyltransferase from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus strain HB27 Crystallography Reports, Volume 62, Issue 4, 1 July 2017, Pages 580-583 (год публикации - 2017).

38. Сычев С.В., Пантелеев П.В., Овчинникова Т.В. Structural Study of the β-Hairpin Marine Antimicrobial Peptide Arenicin-2 in PC/PG Lipid Bilayers by Fourier Transform Infrared Spectroscopy RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY, Volume 43, Issue 5, Pages 502-508 (год публикации - 2017).

39. Сычев С.В., Суханов С.В., Пантелеев П.В., Шенкарев З.О., Овчинникова Т.В. Marine antimicrobial peptide arenicin adopts a monomeric twisted β-hairpin structure and forms low conductivity pores in zwitterionic lipid bilayers BIOPOLYMERS, Biopolymers. 2017;e23093 (год публикации - 2017).

40. Тимофеев В.И., Синицына Е.В., Костромина М.А., Муравьева Т.И., Макаров Д.А., Михеева О.О., Куранова И.П., Есипов Р.С. Crystal structure of recombinant phosphoribosylpyrophosphate synthetase 2 from Thermus thermophilus HB27 complexed with ADP and sulfate ions Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, Volume 73, Part 6, Pages 369-375 (год публикации - 2017).

41. Тыртыш Т.В., Корчагина Е.Ю., Рыжов И.М., Бовин Н.В. Gram scale synthesis of A (type 2) and B (type 2) blood group tetrasaccharides through 1,6-anhydro-N-acetyl-β-D-glucosamine CARBOHYDRATE RESEARCH, 449, 65-84 (год публикации - 2017).

42. Фесенко И., Хазигалеева Р., Киров И., Князев А., Глушенко О., Бабалян К., Арапиди Г., Шашкова Т., Бутенко И., Згода В., Ануфриева К., Середина А., Филиппова А., Говорун В. Alternative splicing shapes transcriptome but not proteome diversity in Physcomitrella patens SCIENTIFIC REPORTS, Volume 7, Entry number 2698, Pages 1-14 (год публикации - 2017).

43. Чен С., Луи В., Баранов М.С., Балеева Н.С., Ямпольский И.В., Чжу Л., Ванг Ю., Шамир А., Солнцев К.М., Фанг С. Unveiling Structural Motions of a Highly Fluorescent Superphotoacid by Locking and Fluorinating the GFP Chromophore in Solution Journal of Physical Chemistry Letters, 22:5921-5928 (год публикации - 2017).

44. Шендер В.О., Арапиди Г.П., Шнайдер П.В., Ануфриева К.С., Павлюков М.С., Степанов Г.А., Говорун В.М. Роль межклеточной коммуникации в прогрессии онкологических заболеваний (The role of intercellular communication in cancer progression) БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ (RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY), - (год публикации - 2018).

45. Шенкарев З.О., Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Суханов С.В., Болдырев И.А., Гизатулина А.К., Минеев К.С., Арсеньев А.С., Овчинникова Т.В. Ligand-binding properties of the lentil lipid transfer protein: molecular insight into the possible mechanism of lipid uptake BIOCHEMISTRY, Volume 56, Issue 12, Pages 1785-1796 (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Результаты работ по проекту в 2018 году опубликованы на сайте ИБХ по адресу: http://www.ibch.ru/press/news/science/2674 РЕЦЕПТОРНЫЕ И СИГНАЛЬНЫЕ БЕЛКИ. АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ Проведено изучение рецепторных белков как ключевых компонентов сенсорных систем организма и участников межклеточных сигнальных взаимодействий, их структурно-функциональных особенностей и способов регуляции. На основе разработанных в ходе выполнения проекта новых технологиях и полученных фундаментальных знаниях о взаимосвязи структуры, динамики и функции разработаны молекулярные модели функционирования рецепторных тирозинкиназ, в том числе членов семейств эпидермальных факторов роста, факторов роста фибробластов и гормона роста соматотропина при взаимодействии с лигандами и адапторными белками в сигнальных платформах. Получены и охарактеризованы моноклональные антитела к внеклеточной части рецепторной тирозинкиназы ИРР, сенсора слабощелочной среды и регулятора кислотно-щелочного равновесия. Данные антитела представляют собой хороший инструмент для дальнейших структурно-функциональных исследований рецептора, а также потенциально могут буть использованы для создания лекарств, регулирующих функции почек, желудка и поджелудочной железы. Проведен сравнительный анализ транскриптомов почек мышей дикого типа и нокаутных по ИРР в условиях до и после щелочной нагрузки. Одним из генов, функционально связанных с ИРР явлется kcnk5, кодирующий рН-зависимый калиевый канал TASK-2, который является одним из главных медиаторов респираторной хемочувствительности. Проанализированы сигнальные каскады, регулируемые белком Ag1 при регенерации и в раннем развитии мозга лягушки. В результате был определен спектр генов-мишеней регуляторного Ag1-зависимого сигнального каскада. Было установлено, что в ходе нейруляции в зачатке головного мозга ген Ag1 ингибирует экспрессию генов группы POU, участвующих в регуляции клеточного цикла. Изучено взаимодействие не известного ранее трансмембранного белка с-Answer, ген которого исчез в эволюции у теплокровных, в том числе у человека, с рецепторами FGFR4 и P2Y1. c-Answer усиливает действие FGFR4 на активацию сигнального пути, связанного с киназой Erk., а также усиливает активацию пуринэргического рецептора P2Y1. Проведен анализ белок-белковых взаимодействий CLN3, изменения в первичной структуре которого приводят к развитию болезни Баттена и предложены способы лечения этой болезни. Показано, что пептидные фрагменты RAGE (рецептора участвующего в патогенезе болезни Альцгеймера) обладают нейропротекторными свойствами. МАСТЕР-РЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ И ГЕНЫ РАЗВИТИЯ И КАНЦЕРОГЕНЕЗА НА ПРИМЕРЕ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Самым опасным свойством рака ПЖ является раннее метастазирование, которое часто происходит до выявления первичной опухоли. Рак ПЖ не поддается новейшим методам иммунотерапии, удостоенным Нобелевской премии 2018 г. и успешно работающим в других видах рака. В процессе развития рака включение и выключение ключевых генов часто происходит в порядке обратном тому, что наблюдается при эмбриогенезе. Это явление называется рекапитуляцией. Мы пытались применить этот принцип к раку ПЖ. Проведены исследования экспрессии генов в хирургических образцах рака ПЖ и фетального материала и открыли отсутствие рекапитуляции при раке ПЖ, за исключением нескольких генов. Это совпало с появившимися литературными данными, что ПАПЖ (протоковая аденома ПЖ) может представлять многочисленные болезни с одинаковым внешним видом. Мы обратили также внимание, что в большинстве хирургических образцов понижено содержание одного из ключевых факторов эмбрионального развития – мастер регулятора PDX1. Самые плохие прогнозы имеют пациенты с низким уровнем этого регулятора в опухоли. Предполагалось, что мастер ген PDX1 возможно на последних этапах развития ПАПЖ может быть ингибитором метастазирования. Для проверки такой возможности мы привлекли коллег из ИМГ РАН с моделью рыбой зебра. Небольшие размеры, короткий жизненный цикл и иммунная система эмбрионов Danio, толерантная к чужеродным антигенам, позволяет использовать для анализа клетки человека. Мы сконструировали клетки ПАПЖ, экспрессирующие PDX1, вводили их в эмбрионы Danio и с помощью флуоресцентной метки показали, что экспрессия PDX1 действительно ингибирует миграцию клеток по телу рыбки. Таким образом, открылось новое поле для борьбы с ПАПЖ, которое мы собираемся развивать уже после завершения проекта, но которое является его порождением. Другим результатом является разработка альтернативной концепции терапии рака, особенно такого, как ПАПЖ. В отличие от стандартных подходов, рассчитанных на уничтожение собственно раковых клеток, эта концепция указывает на предпочтительность использования в качестве терапевтических мишеней контакты раковых клеток и окружающей стромы. Исследовались функциональные внутриклеточные взаимосвязи двух важнейших мастер генов - PDX1 и важного, гена SOX9. Для этой цели в случае SOX9, которого много в клетках ПАПЖ, мы применяли специфическое подавление транскрипции гена и затем анализировали реакции других генов на это снижение концентрации. В результате нам удалось добавить к известным участникам сети взаимодействий SOX9 еще несколько дополнительных. В случае PDX1, которого в клетках ПАПЖ мало, наоборот, мы вводили в эти клетки экспрессирующийся ген. При этом реагировали только уже известные своими взаимосвязями с PDX1 гены. Был завершен анализ экспрессии для пяти потенциальных мастер генов (PDX1, PTF1a, SOX9, HNF1-beta, GATA4), ключевых для эмбриогенеза поджелудочной железы и гена ZEB1, важного для процесса метастазирования. Наконец, проводили анализ эпигенетического состояния промоторов отобранных мастер генов, главным образом упомянутого SOX9, поскольку известна большая роль эпигенетических процессов в регуляции их экспрессии в опухолевых и эмбриональных тканях ПЖ. Наибольшие изменения наблюдались для промоторов генов ZEB1, MDC1, SOX9 и GATA4, что указывает на вовлеченность этих промоторов в функционирование генов. ПЕПТИДОМИКА. ПЕПТИДНЫЕ ФАКТОРЫ СИСТЕМЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА Методом проточной цитофлуориметрии исследовано действие пептида мечехвоста Tach, а также его модифицированных аналогов TachY8S и TachI11S в отношении штаммов бактерий Escherichia coli ML-35p и Staphylococcus aureus 209P и линии клеток человека HEK293. Показано, что точечные замены гидрофобных остатков на остаток серина в структуре пептида позволяют свести к минимуму его цитотоксичность при сохранении мембранотропного механизма действия и высокой антибактериальной активности. Проведены исследования антимикробного действия двух пептидов – катионного защитного АМП мечехвоста (Tach) и пролин-богатого пептида PRP7(1-22) – совместно с шестью различными конвенциальными антибиотиками, относящимися к различным структурным классам и обладающими разными механизмами действия. Синергический эффект наблюдался для пептида Tach при совместном действии с эритромицином или рифампицином в отношении культуры E. coli и ванкомицином в отношении культуры S. aureus. Пептид PRP7(1-22) проявил синергический эффект совместно с рифампицином или эритромицином при действии в отношении культуры E. coli, и совместно с ампициллином, полимиксином B, ванкомицином, эритромицином или рифамицином при действии в отношении культуры S.aureus. Наиболее ярко синергизм проявлялся в паре PRP7(1-22) / рифапмицин. При этом в данном сочетании не наблюдалось усиление гемолитического эффекта. Проведен биоинформатический анализ транскрибируемых генов, кодирующих гомологи металл-ассоциированных протеаз из класса фунгализинов, синтезируемых и секретируемых наиболее экономически значимыми для сельского хозяйства грибами рода Fusarium. Отобрана структура, полученная путем трансляции нуклеотидной последовательности в аминокислотную, из вида F. graminearum, наиболее гомологичная охарактеризованному ранее ферменту фунгализину из вида F. verticillioides. Разработан способ получения рекомбинантного аналога фермента путем гетерологической экспрессии в эукариотической системе, подтверждено наличие целевой вставки и траскрипционная активность. Разработаны и оптимизированы схемы для экспрессии двух структурных типов хитиназ культурных злаков в прокариотической системе. Подтверждено наличие внутриклеточного биосинтеза целевого белка путем определения уровня хитиназной активности спетрофотометрическим методом. Проведен скрининг пула защитных пептидов растений из семейства альфа-харпининов с целью выявления ингибиторов протеолитической активности. Установлено наличие свойств ингибиторов трипсиноподобных протеаз у двух новых молекул, выделенных из зерна культурного и дикорастущего злака. Проведено сравнительное изучение роли различных растительных LTP в развитии аллергических реакций. Сыворотки пациентов с различными аллергическими реакциями на растительные пищевые продукты и пыльцу растений были исследованы методом твердофазного иммуноферментного анализа с целью обнаружения в них специфических антител класса IgE к Pru p 3 персика – главному сенсибилизатору иммунной системы человека к аллергенам класса LTP. На основании содержания специфических антител IgE к Pru p 3 были отобраны 9 сывороток пациентов, сенсибилизованных к LTP. Было определено суммарное количество иммуноглобулинов класса IgE в сыворотках. Перекрёстная реактивность антител класса IgE в сыворотках пациентов с аллергическими реакциями на Pru p 3 персика и Len с 3 чечевицы, а также на Pis s 3 гороха (липид-транспортирующий белок гороха Pisum sativum – Ps-LTP1) была оценена с помощью метода иммуноферментного анализа. Методом иммуноблоттинга подтверждено присутствие специфических IgE к указанным аллергенам в сыворотках пациентов. Полученные данные свидетельствуют о клинически значимой роли аллергенов класса LTP в сенсибилизации пациентов из московского региона. Показана способность липид-транспортирующих белков из чечевицы (Lc-LTP2), укропа (Ag-LTP) и гороха (Ps-LTP1) переносить липиды in vitro. С помощью флуоресцентной спектроскопии детектировали перенос липидов между донорными липосомами из1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (РОРС), в состав которых были включены флуоресцентный зонд тетраметил-BODIPY-меченный фосфотидилхолин (TMB-PC) и гаситель флуоресценции (бис-циклогексил)-BODIPY-меченный фосфотидилхолин (BCHB-PC), и акцепторными липосомами из 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (DMPG) или 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DMPC). Показано, что анализируемые белки Lc-LTP2 из чечевицы, Ag-LTP из укропа и Ps-LTP1 из гороха способны переносить липидные молекулы между липосомами in vitro. Все три белка эффективнее переносят отрицательно заряженные DMPG по сравнению с DMPC. При этом эффективность переноса DMPG для Ps-LTP1 выше, чем для Lc-LTP2 и Ag-LTP. Вместе с тем, липид-транспортирующий белок из укропа Ag-LTP эффективнее других белков переносил DMPC. Чтобы получить представление о составе пептидома крови при раке, проведен LC-MS/MS анализ образцов плазмы и сыворотки крови 10 пациентов с колоректальным раком и 10 пациенток с раком яичников на масс-спектрометре TripleTOF 5600+. Образцы были подготовлены по ранее разработанным нами протоколам десорбции пептидов с поверхности основных белков плазмы крови с последующими стадиями хроматографической очистки. В результате сравнения представленности и вариабельности пептидов крови при раке и в норме обнаружено, что в образцах плазмы и сыворотки крови пациентов с колоректальным раком идентифицировано 536 уникальных пептидов, а в образцах от пациенток с раком яичников – 790 уникальных пептидов. Проведено исследование изменения пулов эндогенных пептидов мха Physcomitrella patens в ответ на воздействие стрессовых факторов. Выявлен ряд потенциально биологически активных пептидов, и для отдельных из них активность доказана экспериментально. Показано, что эндогенные пептиды могут быть как эффекторами, так и модуляторами ответа мха P. patens на стресс. Обнаружено, что стрессовые фитогормоны (метилжасмонат и салициловая кислота) индуцирую образование новых эндогенных пептидов как в клетке, так и в секретоме. Показано, что в этих же условиях происходит активация убиквитин-протеасомной системы деградации белков в клетке, что может являться одним из путей биосинтеза обнаруженных пептидов. Выявленные изменения в доле посттрансляционно модифицированных пептидов, в частности, снижение количества пептидов, гидроксилированных по аминокислотному остатку пролина, могут также влиять на биологическую активность пептидома. БЕЛОК И ГЛИКАН-ОПОСРЕДОВАННЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ДИНАМИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ Предложен метод деликатного биотинилирования живых клеток с помощью встраивания в них молекул biot-CMG-DOPE, тот же реагент в течение секунд биотинилирует практически любую поверхность. Чтобы лучше контролировать процессы биотинилирования, мы детально изучили супрамолекулярную структуру biot-CMG-DOPE. В случае адсорбции на поверхности обнаружилось следующее: остаток биотина нормально спрятан в слое, однако выходит на его поверхность под действием Str. Монослой бып изучен с помощью АСМ, найденная толщина слоя 14 нм соответствует той МД модели, в которой биотин полностью утоплен. Результаты метода grazing incidence (разновидность рентгеновского малоуглового рассеяния ) не противоречили АСМ. МД симуляция показывает, что молекула biot-CMG-DOPE в слое принимает сложенную конформацию, и только ~1% этих молекул динамически принимает развернутую конформацию с дотупным остатком биотина. Разработана методология изучения гликокаликса клетки с помощью набора синтетических гликолипидов, которые отличаются природой липидной части, природой гликанов (кроме гликанов, это могут быть пептиды, фрагменты ДНК и др.), а также спейсерной группой. Спейсер сконструирован из карбоксиметилглицина, обладающего вытянутой конформацией и тем самым обеспечивает необходимое расстояние между мембраной и гликаном. Кроме того, этот спейсер благодаря отрицательному заряду не взаимодействует с белками и клетками крови, что важно для исследований ин виво. Мы также разработали метод химической модификации гликокаликса гликанами – исключительно по его поверхности, с возможностью вводить в него необходимое количество гликана. Сочетание физической (с помощью гликолипидов) и химической модификации эритроцитов дало возможность вводить гликан целенаправленно, в разные части гликокалиуса. С помощью этой методологии изучено взаимодействие антител к гликанам системы АВН с модифицированными эритроцитами, и было показано, что взаимодействие происходит преимущественно с периферийно локализованными гликанами, хотя антитела (даже IgM) способны проникать на самый нижний «этаж» гликокаликса. Показано, что гликолипид, встроенный в эндотелиальные клетки, способен в течение 1-ч контакта с монослоем переноситься на бактерии E.coli. Перенос осуществляется только на <10% популяцию бактерий; причина избирательного переноса будет изучена в дальнейшем. Проведение аналогичных экспериментов в динамике (в потоке) почти не влияло на результат. Исследовано взаимодействие целых вирионов вируса гриппа с гликановыми лигандами в составе гликочипа (400 гликанов, около 50 из которых сиалированы) с целью понять причины необратимости связывания вирионов с клеточной поверхностью, несмотря на ожидаемое их высвобождение из-за разрушения сиало-рецептора нейраминидазой вируса. Предлагаемый подход позволяет избавиться от неспецифических взаимодействий даже при длительном контакте вирионов с сиало-поверхностью. Данная методология выявила взаимодействие вирусов гриппа с гликанами, не имеющими в своем составе остатков сиаловой кислоты. Таким образом, у вируса гриппа есть потенциальные дополнительные клеточные лиганды, нерасщепляемые вирусной нейраминидазой, что объясняет необратимость связывания вириона с клеткой. БЕЛКИ БИОКАТАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ В 2018 году рентгеноструктурным анализом определена структура фрагмента АТР-зависимой Lon-протеазы из E. coli (Ес-Lon(235-584), PDB ID 6N2I). Это позволило Ес-Lon-протеазе стать первым представителем подсемейства LonА, для которого доступны структурные данные фрагментов, покрывающих полную последовательность фермента. Получено подтверждение справедливости гипотезы о том, что LonA-протеазы представляют особый подкласс AAA+-белков, содержащих наряду с классическим АТР-азным модулем часть гипотетического второго АТР-азного модуля. Получены четыре новых рекомбинантных белка, содержащих фрагменты из различных участков фермента IgA-протеазы. Исследованы их иммуногенные и протективные свойства в отношении менингококков основных эпидемических серогрупп. Показано формирование долгосрочного иммунного ответа и эффективной защиты от менингококков серогрупп А, В и С в модельных животных. Получены кристаллы каталитически неактивного мутанта олигопептидазы В из Serratia proteamaculans (PSP) PSP – S532A в комплексе с низкомолекулярным субстратом ВАРNA и с пептидным субстратом Z-Arg-Arg-рNA. Усовершенствован метод молекулярного моделирования в приложении к описанию кинетического механизма взаимодействия бутирилхолинэстеразы с экотиофатом. При помощи методов молекулярного моделирования мы обнаружили, что существует две возможных конкурирующих конформации экотиофата в активном центре бутирилхолинэстеразы. Существование первой, реакционноспособной, было предсказано ранее (run11_16). Вторая - близкая по режиму связывания к субстратам холиновой группы и обладающая лучшей оценкой энергии связывания, является ингибирующей (run6_2). Учет наличия обоих состояний позволил уточнить кинетическую схему для реакции экотиофата с бутирилхолинэстеразой, что было использовано при дизайне вариантов бутирилхолинэстеразы с фосфатазной активностью. В результате выполнения этапа проекта был выделен максимально очищенный функционально активный препарат ранее неописанного фермента - люциферазы F.heliota, а также предложены и обоснованы заключения о комплексном строении данного фермента. Люцифераза червей F. heliota является не одним полипептидом, а белковым комплексом. Данный комплекс имеет ряд посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование по нескольким сайтам, что подтверждается данными ИЭФ, указывающими на наличие нескольких изоформ с различным зарядом у комплекса люциферазы червей F. heliota. Разработан мультиферментативный каскад синтеза модифицированных нуклеотидов. Для расширения перечня доступных для синтеза нуклеотидов de novo был получен новый термофильный рекомбинантный фермент ‒ гипоксантинфосфорибозилтрансфераза HPRT из Thermus Thermophilus HB27 и исследована его субстратная специфичность. Проведен синтез новых модифицированных нуклеотидов (2-хлораденозинмонофосфата и аллопуринол-монофосфата) и исследована их структура физико-химическими методами.

 

Публикации

1. Алексеенко И. В., Виноградова Т. В.,. Свердлов Е. Д Genetic regulatory mechanisms of evolution and embryogenesis in a distorting mirror of carcinogenesis Genetika, 54, 2, 145-156 (год публикации - 2018).

2. Алексеенко И. В., Монастырская Г. С., Свердлов Е. Д. Emerging Potential of Cancer Therapy - Binary Direct Interactions of Cancer and Stromal Cells Russian Journal of Genetics, 54, 12, 1397–1410 (год публикации - 2018).

3. Ануфриева К.С., Шендер В.О., Арапиди Г.П., Павлюков М.С., Шахпаронов М.И., Шнайдер П.В., Бутенко И.О., Лагарькова М.А., Говорун В.М. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells GENOME MEDICINE, Volume 10, Issue 1, Номер статьи 49 (год публикации - 2018).

4. Арапиди Г., Осетрова М., Иванова О., Бутенко И., Савельева Т., Павлович П., Аниканов Н., Иванов В., Говорун В. Peptidomics dataset: Blood plasma and serum samples of healthy donors fractionated on a set of chromatography sorbents DATA IN BRIEF, Volume 18, June 2018, Pages 1204-1211 (год публикации - 2018).

5. Бабалян К., Султанов Р., Генерозов Э., Шарова Е., Кострюкова Е., Ларин А., Каныгина А., Говорун В., Арапиди Г. LogLoss-BERAF: an ensemble-based machine learning model for constructing highly accurate diagnostic sets of methylation sites accounting for heterogeneity in prostate cancer PLOS ONE, 13(11):1–19 (год публикации - 2018).

6. Байрамов А.В., Ермакова Г.В., Кучерявый А.В., Зарайский А.Г. МИНОГИ – «ЖИВЫЕ ИСКОПАЕМЫЕ» В ИССЛЕДОВАНИЯХ РАННЕГО РАЗВИТИЯ И РЕГЕНЕРАЦИИ ПОЗВОНОЧНЫХ онтогенез, н.5, т.49, с.s3-s14 (год публикации - 2018).

7. Барбе Л., ЛеМуйак-Вайдье Б., Эшассерио К., Бернардо К., Картон Т., Бовин Н., Нордгрен Й., Свенссон Л., Рувоэн-Клуе Н., Ле Пендю Ж. Histo-blood group antigen-binding specificities of human rotaviruses are associated with gastroenteritis but not with in vitro infection Scientific Reports, 8 12951 (2018) (год публикации - 2018).

8. Богданов И.В., Финкина Е.И., Мельникова Д.Н., Тагаев А.А., Овчинникова Т.В. Анализ профиля цитокинов в сыворотках пациентов с аллергией открывает путь к персонализированной аллерготерапии (Cytokine profile analysis of allergic patient sera opens a gate to personalized allergy treatments) БЮЛЛЕТЕНЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ (BULLETIN OF EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE), Том 166, № 12, С. 736-740 (год публикации - 2018).

9. Бочаров Э.В., Лесовой Д.М., Бочарова О.В., Урбан А.С.,Павлов К.В.,Волынский П.Е., Ефремов Р.Г., Арсеньев А.С. Structural basis of the signal transduction via transmembrane domain of the human growth hormone receptor Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects, v.1862, i.6, p. 1410-1420. (год публикации - 2018).

10. Вагиану К.Д., Штур-Хансен Н., Молл К., Бовин Н., Вальгрен М., Бликст У. ABO blood group antigen-decorated giant unilamellar vesicles exhibit distinct interactions with Plasmodium falciparum-infected red blood cells ACS CHEMICAL BIOLOGY, 13(9) 2421-2426 (год публикации - 2018).

11. Васкан И.С., Соловьева Д.О., Чистяков А.А., Ефремов Р.Г., Волынский П.Е., Штыкова Э.В., Мочалов К.Е., Бовин Н.В., Олейников В.А. Neoglycolipids Micelle-like Structures as a Basis for Drug Delivery Systems KnE Energy & Physics The 2nd International Symposium "Physics, Engineering and Technologies for Biomedicine", KnE Energy & Physics The 2nd International Symposium "Physics, Engineering and Technologies for Biomedicine", p.519-527 (год публикации - 2018).

12. Винтерс Р.А., Неттенстрём Л.М., Лопез Д.Г., Вилленбург К.И, Вишвант Р., Бовин Н.В., Миллер Д. Д. Effect of sorting boar spermatozoa by sex chromosomes on oviduct cell binding Theriogenology, 108, 22-28 (год публикации - 2018).

13. Генри С., Вильямс Э., Барр К., Корчагина Е., Тузиков А., Ильюшина Н., Абайзид С.А., Уэбб К.Ф., Бовин Н. Rapid one-step biotinylation of biological and non-biological surfaces. Scientific Reports, 8(1), 2845 (год публикации - 2018).

14. Генри С.М., Бовин Н.В. Kode Technology a Universal Cell Surface Glycan Modification Technology Journal of the Royal Society of New Zealand (TNZR), - (год публикации - 2018).

15. Гнатенко Д.А., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. Variable effects of growth factors on developmental gene expression in pancreatic cancer cells Doklady Biochemistry and biophysics, 481, 217–218 (год публикации - 2018).

16. Дарин Т. Шульц, Алексей А. Котлобай, Рустам Зиганшин, Артем Банников, Надежда М. Маркина, Татьяна В. Чепурных, Екатерина С. Шахова, Ксения Палкина, Стивен Хаддок, Илья В. Ямпольский, Юичи Оба Luciferase of the Japanese syllid polychaete Odontosyllis umdecimdonta Biochemical and Biophysical Research Communications, Biochem Biophys Res Commun. 2018, 502(3):318-323 (год публикации - 2018).

17. Дей К., Пэйтон А., Харви Р., Хартли-Тассел Л., Сейб К., Тиралонго Д., Бовин Н., Савино С., Масньяни В., Пэйтон Д., Дженингс М. Lectin activity of the pneumococcal pilin proteins. Scientific Reports, 7, 17784 (год публикации - 2017).

18. Дубовский П.В., Игнатова А.А., Волынский П.Е., Иванов И.А., Жмак М.Н., Феофанов А.В., Ефремов Р.Г. Improving therapeutic potential of antibacterial spider venom peptides: coarse-grain molecular dynamics guided approach Future medicinal chemistry, v.10, i. 19, р. 2309-2322 (год публикации - 2018).

19. Емельянова А.А., Кузьмин Д.В., Пантелеев П.В., Сорокин М.И., Буздин А.А., Овчинникова Т.В. Anticancer activity of the goat antimicrobial peptide ChMAP-28 FRONTIERS IN PHARMACOLOGY, - (год публикации - 2019).

20. Ермакова Ю.Г., Пак В.В., Богданова Ю.А., Котлобай А.А., Ямпольский И.В., Шохина А.Г., Панова А.С., Марыгин Р.А., Староверов Д.Б., Билан Д.С., Сеис Х., Белоусов В.В. SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range Chemical Communications, Chem.Commun., 2018, 54, 2898-2901 (год публикации - 2018).

21. Есипов Р. С., Тимофеев В. И., Синицына Е. В., Тузова Е. С., Есипова Л. В., Костромина М. А., Куранова И. П., Мирошников А. И. Three-Dimensional Structure of Recombinant Adenine Phosphoribosyltransferase from Thermophilic Bacterial Strain Thermus thermophilus HB27 Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Volume 44, Issue 5, pp 504–510 (год публикации - 2018).

22. Захарова М., Кузнецова А., Калиберда Е., Дронина М., Колесников А., Козырь А., Смирнов И., Румш Л., Федорова О., Кнорре Д., Габибов А., Кузнецов Н. Evolution of inhibitor-resistant variants of HIV protease analyzed by pre-steady state kinetic analysis FEBS Open Bio, Том: 8 Приложение: 1 Стр.: 290-291 (год публикации - 2018).

23. Заяц E.A., Тимофеев В.И., Костромина М.А., Есипов Р.С. An explanation for the narrow carbohydrate substrate specificity of adenine phosphoribosyltransferase from Thermus thermophilus from the model of the enzyme, substrate and magnesium cation co-factor complex Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, - (год публикации - 2018).

24. Зиновьева М.В., Николаев Л.Г., Кондратьева Л.Г., Виноградова Т.В., Свердлов Е.Д. Correlation between expression of KLF5 and ZEB1 transcription factor genes in pancreatic cancer Doklady Biochemistry and Biophysics, 481, 219–221 (год публикации - 2018).

25. Злобин А. С., Залевский А. О., Мокрушина Ю.А., Карцева О.В., Головин А.В., Смирнов И. В. Предпочтительная конформация связывания канонических субстратов бутирилхолинэстеразы непродуктивна для экотиофата ACTA NATURAE, ТОМ 11, № 4 (39) (год публикации - 2018).

26. Иванова А.С., Короткова Д.Д., Мартынова Н.Ю., Аверьянова О.В., Зарайский А.Г., Терешина М.В. Methods of In Vivo Gene-Specific Knockdown Using Morpholino and Vivo-Morpholino Oligonucleotides RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY, v. 44, i. 3, p. 358-361 (год публикации - 2018).

27. Иванова А.С.,Короткова Д.Д.,Ермакова Г.В.,Мартынова Н.Ю.,Зарайский А.Г.,Терешина М.В. Ras-dva small GTPases lost during evolution of amniotes regulate regeneration in anamniotes Scientific Reports, v.8, а.n.13035 (год публикации - 2018).

28. Камынина А.В., Эстерас Н., Короев Д.О., Бобкова Н.В., Баласанянц С.М., Симонян Р.А., Аветисян А.В., Абрамов А.Ю., Вольпина О.М. Synthetic Fragments of Receptor for Advanced Glycation End Products Bind Beta-Amyloid 1–40 and Protect Primary Brain Cells From Beta-Amyloid Toxicity Frontiers in Neuroscience., v.12 i.681 (год публикации - 2018).

29. Кондратьева Л.Г., Чернов И.П., Зиновьева М.В., Егоров В.И., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. Heterogeneous expression of embryonal development master regulator SOX9 in patients with pancreatic cancer Doklady Biochemistry and Biophysics, 481, 208–211 (год публикации - 2018).

30. Котельникова О.В., Аллилуев А.П., Зинченко А.А., Прокопенко Ю.А., Жигис Л.С., Зуева В.С., Разгуляева О.А., Гордеева Е.А., Мелихова Т.Д., Нокель Е.А., Румш Л.Д. Особенности формирования иммунитета к менингококковой инфекции у мышей, иммунизированных фрагментами IgA1 протеазы N. meningitides Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Том: 165 Выпуск: 6 Стр.: 763-766 (год публикации - 2018).

31. Куджаев А.М.,Дубовцева Е.С., Серова О.В., Андрианова А.Г., Ротанова Т.В. Effect of the Deletion of the (173-280) Fragment of the Inserted -Helical Domain on the Functional Properties of АТР-Dependent Lon Protease from E-coli Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Том: 44 Выпуск: 5 Стр.: 518-527 (год публикации - 2018).

32. Кузин А.И., Тагаев А.А., Овчинникова Т.В., Кузнецова Н.И., Николаенко М.А., Морозова О.А., Азизбекян Р. Р. Изучение штамма Bacillus pumilus В-13176, метаболиты которого обладают фунгицидной и антибактериальной активностью в отношении Aspergillus niger и Staphylococcus aureus (MRSA) БИОТЕХНОЛОГИЯ (BIOTECHNOLOGY), 34(3):23-32 (год публикации - 2018).

33. Кузьмин Д.В., Емельянова А.А., Калашникова М.Б., Пантелеев П.В., Овчинникова Т.В. In vitro study of antitumor effect of antimicrobial peptide tachyplesin I in combination with cisplatin BULLETIN OF EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE, 165(2):220-224 (год публикации - 2018).

34. Кузьмич А.И., Зиновьева М.В., Потапов В.К., Костина М.Б., Свердлов Е.Д. CRISPR/CAS targeted in vivo genome modification for studying functional role of genomic regulatory elements in health and carcinogenesis Molecular Genetics, Microbiology and Virology, 33, 1, 1–7 (год публикации - 2018).

35. Ли Н., Халенков А.М., Луговцев В.Ю., Ирленд Д., Самсонова А.П., Бовин Н.В., Доннели Р.П., Илюшина Н.А. The use of plant lectins to regulate H1N1 influenza A virus receptor binding activity. PLOS One, 9;13(4):e0195525 (год публикации - 2018).

36. Лопес А.М, Брейман А., Лора М., ЛеМуйяк-Вайдье Б., Галанина О., Нюстрём К., Маршандо С., Ле Галь-Рекуль Г., Страйв Т., Нейманис А., Бовин Н.В., Ривоэн-Клуэ Н., Эстевес П., Абрантес Й., Ле Пендю Ж. Host-Specific Glycans Are Correlated with Susceptibility to Infection by Lagoviruses, but Not with Their Virulence J of Virology, 92 (4) UNSP e01759-17 (год публикации - 2018).

37. Манджиева Ю.Б., Сидоров-Бирюков Д.Д., Подшивалов Д.Д., Костромина М.А., Тимофеев В.И., Куранова И.П., Есипов Р.С. Поиск селективных ингибиторов пуринуклеозидфосфорилазы из Escherichia coli методом виртуального скрининга Биофармацевтический Журнал, Том 10, № 4, стр. 23 - 27 (год публикации - 2017).

38. Маргграф М.Б., Пантелеев П.В., Емельянова А.А., Сорокин М.И., Болосов И.А., Буздин А.А., Кузьмин Д.В., Овчинникова Т.В. Cytotoxic potential of the novel horseshoe crab peptide polyphemusin III MARINE DRUGS, Mar. Drugs 2018, 16, 466; doi:10.3390/md16120466 (год публикации - 2018).

39. Мартынов В.И.,Пахомов А.А.,Деев И.Е.,Петренко А.Г. Genetically encoded fluorescent indicators for live cell pH imaging BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-GENERAL SUBJECTS, v. 1862, i.12, p.2924-2939 (год публикации - 2018).

40. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Богданов И.В., Овчинникова Т.В. Plant Pathogenesis-Related Proteins Binding Lipids and Other Hydrophobic Ligands RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY, 44(6):573-581 (год публикации - 2018).

41. Можаев А.А.,Орса А.Н., Деев И.Е.,Швец В.И.,Петренко А.Г. ОПТИМИЗАЦИЯ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ ЭКТОДОМЕНА РЕЦЕПТОРНОЙ ТИРОЗИНКИНАЗЫ IRR ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, - (год публикации - 2019).

42. Наваковский М., Шилова Н., Хасбиуллина Н., Феофанов А., Пудова Е., Чен К., Бликст У., Бовин Н. Improved spot morphology for printed glycan arrays. BioTechniques, 64(3) 110-116 (год публикации - 2018).

43. Овчинникова М.В., Михайлова А.Г., Карлинский Д.М., Горленко В.А., Румш Л.Д. Обратимая циклическая термоинактивация олигопептидазы В из Serratia proteamaculans Acta Naturae, Том: 10 Номер: 2 (37) Страницы: 65-70 (год публикации - 2018).

44. Павлов К.В., Бочаров Э.В. Липид-опосредованный механизм в функционировании белков Цитология,ФГУП Академический научно-издательский, производственно-полиграфический и книгораспространительский центр Наука, н. 7, т. 60, с. 510–518 (год публикации - 2018).

45. Пазынина Г.В., Цыганкова С.В., Рыжов И.М., Парамонов А.С., Бовин Н.В. Synthesis of H(type 4) trisaccharide, key structural fragment of globo-H and fucosyl-GM1 cancer-associated antigens. Mendeleev Communications, 28, 421–422 (год публикации - 2018).

46. Пантелеев П.В., Болосов И.А., Калашников А.А., Кокряков В.Н., Шамова О.В., Емельянова А.А., Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Combined antibacterial effects of goat cathelicidins with different mechanisms of action FRONTIERS IN MICROBIOLOGY, Front. Microbiol. 2018; doi: 10.3389/fmicb.2018.02983 (год публикации - 2018).

47. Пантелеев П.В., Царёв А.В., Болосов И.А., Парамонов А.С., Маргграф М.Б., Сычёв С.В., Шенкарёв З.О., Овчинникова Т.В. Novel antimicrobial peptides from the Arctic polychaeta Nicomache minor provide new molecular insight into biological role of the BRICHOS domain MARINE DRUGS, Mar. Drugs 2018, 16, 401; doi:10.3390/md16110401 (год публикации - 2018).

48. Поварова Н.В., Баринов Н.А., Баранов М.С., Маркина Н.М., Варижук А.М., Позмогова Г.Е., Клинов Д.В., Кожемяко В.Б., Лукьянов К.А. Efficient silica synthesis from tetra(glycerol)orthosilicate with cathepsin- and silicatein-like proteins Scientific reports, Sci Rep. 2018 Nov 13;8(1):16759. doi: 10.1038/s41598-018-34965-9 (год публикации - 2018).

49. Рогожин Е.А., Рязанцев Д.Ю., Смирнов А.Н., Завриев С.К. Primary structure analysis of antifungal peptides from cultivated and wild cereals PLANTS, Plants 2018, 7, 74; doi:10.3390/plants7030074 (год публикации - 2018).

50. Рыжов И.М., Тузиков А.Б, Перри Х., Корчагина Е.Ю., Бовин Н.В. Blood Group O→A Transformation by Chemical Ligation of Erythrocytes ChemBioChem, - (год публикации - 2018).

51. Рязанцев Д.Ю., Рогожин Е.А., Цветков В.О., Яруллина Л.Г., Смирнов А.Н., Завриев С.К. Разнообразие харпино-подобных защитных пептидов в семенах ежовника (Echinochloa Crusgalli L.) (Diversity of hairpin-like defense peptides from barnyard grass (Echinochloa Crusgalli L.) seeds) ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК (Биохимия, биофизика, молекулярная биология) (DOKLADY BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS), - (год публикации - 2019).

52. Свердлов Е.Д. Unsolvable problems of biology: it is impossible to create two identical organisms, to defeat cancer, or to map organisms onto their genomes Biochemistry (Moscow), 83, 4, 370-380 (год публикации - 2018).

53. Свердлов Е.Д. Missed druggable cancer hallmark: cancer–stroma symbiotic crosstalk as paradigm and hypothesis for cancer therapy BIOESSAYS, 40(11):e1800079 (год публикации - 2018).

54. Синицына Е.В., Тимофеев В.И., Тузова Е.С., Костромина М.А., Муравьева Т.И., Есипов Р.С., Куранова И.П. Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction Study of Purine Nucleoside Phosphorylase from the Thermophilic Bacterium Thermus thermophilus Strain HB27 Crystallography Reports, Volume 63, Issue 5, pp 761–764 (год публикации - 2018).

55. Терехов С.С., Остерман И.А., Смирнов И.В. Высокопроизводительный скрининг природного биоразнообразия с целью поиска новых антибиотиков ACTA NATURAE, ТОМ 10, № 3 (38), 24-30 (год публикации - 2018).

56. Тиралонго Дж., Купер О., Ян Я., Кинг Р., Чжань Й., Чжао Х., Хартли-Тассел Л.Е., Литфин Т., Бовин Н., Дэй К.Д., Чжоу Я. YesU from Bacillus subtilis preferentially binds fucosylated glycans Scientific Reports, 8(1), 13139 (год публикации - 2018).

57. Умнякова Е.С., Горбунов Н.П., Жахов А.В., Кренев И.А., Овчинникова Т.В., Кокряков В.Н., Берлов М.Н. Modulation of Human Complement System by Antimicrobial Peptide Arenicin-1 from Arenicola marina MARINE DRUGS, Mar. Drugs 2018, 16, 480; doi:10.3390/md16120480 (год публикации - 2018).

58. Фатеев И.В., Синицына Е.В., Биканасова А.У., Костромина М.А., Тузова Е.С., Есипова Л.В., Муравьева Т.И., Каюшин А.Л., Константинова И.Д., Есипов Р.С. Thermophilic Phosphoribosyltransferases Thermus thermophilus HB27 in Nucleotide Synthesis Beilstein Journal of Organic Chemistry, - (год публикации - 2018).

59. Филиппова А., Ляпина И., Киров И., Згода В., Белогуров А., Кудряева А., Иванов В., Фесенко И. Salicylic acid influences the protease activity and posttranslation modifications of the secreted peptides in the moss Physcomitrella patens JOURNAL OF PEPTIDE SCIENCE, - (год публикации - 2018).

60. Финкина Е.И., Мельникова Д.Н., Богданов И.В., Овчинникова Т.В. Пептиды системы врождённого иммунитета растений. Часть I. Структура, биологическая активность и механизмы действия (Peptides of plant innate immune system part I. Structure, biological activity and mechanisms of action) БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ (RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY), 45(1): 1–14 (год публикации - 2019).

61. Финкина Е.И., Мельникова Д.Н., Богданов И.В., Овчинникова Т.В. Пептиды системы врождённого иммунитета растений. Часть II. Биосинтез, функции в растении и возможное практическое применение (Peptides of plant innate immune system part II. Biosynthesis, biologiocal functions and possible practical application) БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ (RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY), - (год публикации - 2019).

62. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Plant Defensins: Structure, Functions, Biosynthesis, and the Role in the Immune Response RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY, 44(3):261-278 (год публикации - 2018).

63. Хасбиуллина Н.Р., Шилова Н.В., Наваковский М.Е., Нокель А.Ю, Книрель Ю.А., Бликст У, Бовин Н.В. Repertoire of Abs primed by bacteria in gnotobiotic mice. Innate Immunity, 24,180-187 (год публикации - 2018).

64. Шематорова Е.К., Шпаковский Д.Г., Чернышева А.Д., Шпаковский Г.В. Molecular mechanisms of the juvenile form of Batten disease: important role of MAPK signaling pathways (ERK1/ERK2, JNK and p38) Biology Direct, v. 13, a.n. 19 (год публикации - 2018).