КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 14-25-00160

НазваниеКлеточные источники «патогенного» интерлейкина-6 при заболеваниях: сравнение результатов генетических подходов и антицитокиновой терапии нового типа.

РуководительНедоспасов Сергей Артурович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2014 г. - 2016 г.

, продлен на 2017 - 2018. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№2 - Конкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований коллективами существующих научных лабораторий (кафедр)».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-108 - Иммунология

Ключевые словацитокины, рак, аутоиммунитет, ИЛ-6, антицитокиновая терапия, мышиные модели

Код ГРНТИ62.00.00

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Интерлейкин-6 – один из главных провоспалительных цитокинов, который обладает широким спектром иммунорегуляторных свойств, а также является медиатором образования опухолей различной природы. Системная терапевтическая блокировка ИЛ-6 используется для лечения нескольких аутоиммунных заболеваний (например, ревматоидного артрита), а также некоторых видов неоплазий. ИЛ-6 продуцируется многими типами клеток. Основная гипотеза, которую мы предлагаем проверить экспериментально, состоит в том, что в каждом конкретном случае только некоторые типы клеток продуцируют ИЛ-6, оказывающий патогенный эффект при данном заболевании. Эта гипотеза будет проверена методами обратной генетики на мышиных моделях – с помощью панели кондиционных нокаутов по гену ИЛ-6, а также фармакологически – с помощью новых биспецифических рекомбинантных антител, препятствующих секреции ИЛ-6 конкретными типами клеток. В качестве экспериментальных моделей болезней будут выбраны два аутоиммунных заболевания, два типа неоплазий и одна инфекция. Предполагается, что в части этих заболеваний удастся выявить главный источник «патогенного» ИЛ-6, а в некоторых случаях – источники и патогенного, и протективного цитокина. Большинство экспериментальных моделей хорошо знакомо лаборатории заявителя, и по ним имеются научные публикации в высокорейтинговых журналах. Необходимый опыт получения и поддержания сложной панели мышей с кондиционными нокаутами геном цитокинов накоплен лабораторией заявителя за последние 10 лет. У заявителя также имеется опыт биоинженерии антител, в том числе рекомбинантных антител, содержащих фрагменты однодоменных антител из верблюдовых. Кроме того, создан первый прототип блокатора, предотвращающий выход провоспалительного цитокина из клетки. В связи с недавними успехами терапевтической блокировки ИЛ-6 при некоторых заболеваниях, и необходимости продолжения клинических исследований, проект крайне актуален, так как может открыть путь к новым стратегиям антицитокиновой терапии. Предлагаемые исследования новы, а некоторые компоненты его высоко оригинальны. Подобных исследований в других лабораториях в настоящий момент не проводится.

Ожидаемые результаты
В результате предлагаемого исследования впервые будут соотнесены функции тканеспецифической продукции важнейшего провоспалительного и иммунорегуляторного цитокина, ИЛ-6, в аутоиммунных заболеваниях и при развитии опухолей. Ожидается, что по крайней мере в некоторых из модельных заболеваний болезнетворный, «патогенный» ИЛ-6 будет происходить из очень ограниченного числа типов клеток, а возможно – из единственного типа клеток. Такой результат будет иметь фундаментальное значение для биологии и медицины, и откроет дорогу стратегиям более тонкой, более специфической нейтрализации ИЛ-6 только из «патогенных» источников; вопрос о клеточных источниках протективного, «полезного» ИЛ-6 также представляет большой интерес. Параллельно будет создана и апробирована на животных моделях принципиально новая, основанная на рекомбинантных бифункциональных антителах стратегия нейтрализации ИЛ-6, производимого определенным типом клеток. В этом исследовании впервые для нашей страны будут отработаны конкретные модели заболеваний, позволяющие в будущем проводить предклинические исследования. Терапевтическая блокировка ИЛ-6 при некоторых болезнях уже доказала перспективность, и рынок биоинженерных блокаторов в ближайшее время достигнет миллиардов долларов. Несомненно, эта терапия будет расширена и на другие заболевания, в том числе и на раковые. В России, где имеется около миллиона страдающих одним только ревматизмом, очень небольшая часть пациентов (3%) получает анти-цитокиновую терапию (блокаторы ФНО), а блокатора ИЛ-6 пока не доступны. С другой стороны, поскольку полная системная блокировка важной иммунорегуляторной молекулы не может не иметь нежелательных последствий, успех проекта откроет путь к более специфичной биотерапии со сниженным числом побочных эффектов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2014 году
В ходе успешной иммунизации экспериментальных животных (верблюда и ламы) получены библиотеки последовательностей, кодирующих однодоменные антитела, специфически узнающих рекомбинантные белки F4/80 и IL-6. Проведен их скрининг и проверка в различных тест-системах, в том числе показана правильность принципа – возможность осуществлять блокировку воспалительного цитокина на поверхности секретирующей его клетки с помощью биспецифичесого антитела. Для дальнейшего изучения бифункционального антитела отработана in vitro модель активации первичных макрофагов из костного мозга мыши и оценки продукции IL-6 активированными клетками методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). В качестве специфического теста на IL-6 человека отработан протокол по оценке параметров роста клеточной линии Baf/3 gp130+hIL-6R+, зависимой от IL-6 человека. Проведен анализ экспрессии il6 в перевиваемых опухолевых линиях, а также в образцах В-клеточных лимфом и образцах кожи после индукции воспаления. Отработаны протоколы нескольких экспериментальных моделей заболеваний на мышах для изучения биологии IL-6 in vivo. Инициирована работа по выведению мышей с тканеспецифической инактивацией IL-6 в макрофагах для дальнейшего изучения в рамках проекта.

Публикации

1. Астраханцева И.В., Ефимов Г.А., Друцкая М.С., Круглов А.А., Недоспасов С.А. Современная антицитокиновая терапия аутоиммунных заболеваний. Биохимия, 79(12): 1607–1618 (год публикации - 2014) https://doi.org/10.1134/S0006297914120049

2. Ефимов Г.А., Круглов А.А., Шварев Д.С., Друцкая М.С., Недоспасов С.А. Новые тенденции в антицитокиновой терапии. Российский иммунологический журнал, 8(17), 3: 706-710 (год публикации - 2014)

3. Миткин Н.А., Муратова А.М., Шварц А.М., Купраш Д.В. Role of p53 homologues p63 and p73 in CXCR5 gene regulation in human breast carcinoma cells under genotoxic stress. FEBS Journal, vol. 281 (Suppl. 1), p. 502 (год публикации - 2014) https://doi.org/10.1111/febs.12919

4. Путляева Л., Шварц А.М., Корнеев К., Ковик М., Купраш Д. Regulation of slamf1 gene encoding co-stimulatory receptor CD150 in human B cell lines. FEBS Journal, vol. 281 (Suppl. 1), p. 688 (год публикации - 2014) https://doi.org/10.1111/febs.12919

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Проект посвящён изучению иммунорегуляторных и патофизиологических свойств провоспалительного цитокина IL-6 и соотнесению этих свойств с типом продуцирующих IL-6 клеток организма. Основная гипотеза, лежащая в основе исследования, состоит в том, что при аутоиммунных заболеваниях и неоплазиях «патогенная» роль IL-6 связана с ограниченным типом клеток-продуцентов. Наша задача - связать известные иммунорегуляторные, защитные и «патогенные» функции IL-6 с конкретными клеточными источниками этого цитокина и предложить новые стратегии анти-IL6 терапии. За отчетный период были продолжены работы по созданию заявленных мышиных моделей, график которых по объективным причинам несколько отстает от заявленного оптимистического плана. С другой стороны, протоколы экспериментальных заболеваний, в которых будут изучены функции IL- in vivo, были успешно отработаны в соответствии с планом исследования. Эти заболевания включают мышиные модели ревматоидного артрита, рака, рассеянного склероза и ишемии. В модели экспериментального артрита, индуцированного пассивным переносом артритогенных антител, установлено, что у мышей, подверженных системной анти-TNF терапии не наблюдается различий в системной продукции IL-6 между контрольной и экспериментальными группами. При этом, получены первые указания на возможную патогенную роль IL-6, производимого миелоидными клетками в очаге поражения. В 2016 году эти исследования будут продолжены на мышах с тканеспецифической инактивацией IL-6. За отчетный период была показана индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) у мышей линии C57Bl/6. Эта модель рассеянного склероза представляет значительный интерес с точки зрения исследования иммунорегуляторных и патофизиологических свойств IL-6, т.к. ранее была продемонстрирована устойчивость мышей, дефицитных по IL-6, к развитию этого заболевания. За отчетный период получены мыши с инактивацией IL-6 в миелоидных и других клетках, что поможет установить клеточный источник патогенного цитокина в 2016 году в ЭАЭ. Анализ экспрессии цитокинов в модели острого воспаления кожи показал значительное снижение уровня экспрессии IL-6 у мышей, чувствительных к развитию папиллом при химически-индуцированном раке кожи. Роль воспаления в активации миелоидных клеток с супрессорными функциями была исследована в модели с перевиваемой опухолевой линией. Показано, что опухолевый рост в этой экспериментальной модели сопряжен со значительным накоплением незрелых миелоидных клеток как в самом сайте опухолевого роста, так и на периферии. Эти клетки характеризуются супрессорными свойствами и, в частности, способны подавлять пролиферацию Т-клеток in vitro. Установлено, что при культивировании клеток костного мозга в присутствии IL-6 происходило накопление Ly6G(low) незрелых миелоидных клеток в культуре. Изучен механизм IL-6-опосредованного воспаления с участием макрофагов при активации различными по своей структуре молекулами ЛПС. Разрабатывается новый подход к экспериментальной анти-цитокиновой терапии, основанный на бифункциональных антителах (одна часть молекулы распознает и связывает IL-6, а другая – связывает поверхностный маркер на выбранном типе клеток). За отчетный период получены и охарактеризованы рекомбинантные однодоменные антитела (VHH), специфически связывающие IL-6 человека и рекомбинантные антитела к маркеру мышиных макрофагов F4/80. Разработан дизайн биспецифических антител, связывающих как IL-6, так и F4/80, и планируется, что первые образцы такого белка будут получены и протестированы в начале 2016 г. В целом, работы по проекту развиваются успешно, и с получением мышиных моделей для in vivo экспериментов в 2016 г., заявленные цели проекта будут достигнуты. Полученные за отчетный период результаты были представлены участниками проекта на международных и отечественных конференциях, некоторые из них уже частично опубликованы или подготовлены к публикации.

Публикации

1. Корнеев К.В., Арбатский Н.П., Молинаро А., Пальмигиано А., Шайхутдинов Р.З., Шнейдер М.М., Пьер Г.Б., Кондакова А.Н., Свиряева Е.Н., Стуриале Л., Гароззо Д., Круглов А.А., Недоспасов С.А., Друцкая М.С., Книрель Ю.А., Купраш Д.В. Structural relationship of the lipid A acyl groups to activation of murine Toll-like receptor 4 by lipopolysaccharides from pathogenic strains of Burkholderia mallei, Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa. Frontiers in Immunology, 6:595 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.3389/fimmu.2015.00595

2. Тиллиб С.В., Ефимов Г.А., Губернаторова Е.О., Горяйнова О.С., Иванова Т.И., Бочаров А.А., Гончаров А.Г., Розе-Ион Штефан, Круглов А.А., Друцкая М.С., Недоспасов С.А. Получение и характеристика рекомбинантных однодоменных антител из ламы, специфически связывающихся с интерлейкином-6 человека. Российский иммунологический журнал, 9(18), 4: 400–409 (год публикации - 2015)

3. Боголюбова А.В., Ефимов Г.А., Друцкая М.С., Недоспасов С.А. Иммунотерапия опухолей, основанная на блокировке иммунологических контрольных «точек» («чекпойнтов»). Медицинская иммунология, 17(5):395-406. (год публикации - 2015) https://doi.org/10.15789/1563-0625-2015-5-395-406

4. Друцкая М.С., Носенко М.А., Атретханы К-С.Н., Ефимов Г.А., Недоспасов С.А. Интерлейкин-6 – от молекулярных механизмов передачи сигнала к физиологическим функциям и терапевтическим мишеням. Молекулярная биология, 49(6):1–7 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1134/S0026893315060060

5. Носенко М.А., Бочаров А.А., Друцкая М.С., Купраш Д. В., Недоспасов С.А. Свойства некоторых цитокинов семейства интерлейкина-6 и их значение для медицины. Российский иммунологический журнал, 10(19),1:25-37 (год публикации - 2015)

6. Атретханы К.-С., Зварцев Р.В., Носенко М.А., Круглов А.А., Кин З., Друтская М.С., Недоспасов С.А. Experimental model to target tumor necrosis factor and myeloid-derived suppressor cells for tumor therapy. Molecular biology, 49(5):783 (год публикации - 2015)

7. Атреханы К-С.Н., Носенко М.А. Зварцев Р.В., Хозер Д., Вильямский Г., Бланкештейн Т., Недоспасов С.А., Друцкая М.С. Изучение экспрессии генов IL-6, TNF и LTA в модели спонтанной B-клеточной лимфомы. Медицинская Иммунология. Специальный выпуск (Материалы XV Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе Дни иммунологии в Санкт-Петербурге), 17:156 (год публикации - 2015)

8. Друцкая М.С., Зварцев Р.В., Чащина А.А., Недоспасов С.А. The role of cytokines in chemically-induced skin cancer as studied in mice. Molecular Biology, 49(5):765 (год публикации - 2015)

9. Корнеев К.В., Свиряева Е.Н., Кондакова А.Н., Арбатский Н.П., Анисимов А.П., Молинаро А., Пальмигиано А., Стуриале Л., Гароззо Д., Круглов А.А., Друцкая М.С., Недоспасов С.А., Книрель Ю.А., Купраш Д.В. Novel aspects of the contribution by the lipid A acyl groups to Toll-like receptor 4 activation by lipopolysaccharide FEBS Journal, 282(Suppl.1):238 (год публикации - 2015)

10. Недоспасов С.А. Cellular sources of proinflammatory cytokines in disease and cell type-restricted cytokine targeting. Inflammation research. Book of abstracts,12th World Congress on Inflammation Boston, Massachusetts, August 8 – 12, 2015., 64(Suppl.2): S93-94 (год публикации - 2015)

11. Тиллиб С.В., Недоспасов С.А., Ефимов Г.А., Друцкая М.С., Круглов А.А., Горяйнова О.С., Иванова Т.И. Рекомбинантные однодоменные антитела, специфически связывающие интерлейкин-6 человека, способ их получения и использования для детекции этого белка. -, 2015145831 (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В течение последнего года работы по проекту мы установили физиологическую и патогенную функции важного иммунорегуляторного и про-воспалительного цитокина, Интерлейкина-6, в трех модельных заболеваниях на мышах, которые моделируют ревматоидный артрит, рассеянный склероз и астму. В двух из этих трех заболеваний патогенез обусловлен IL-6 из миелоидных клеток, в третьем заболевании (астме) для окончательного утверждения необходимы дополнительные эксперименты. Во всех случаях мы сравнили эффекты генетической деплеции IL-6 с фармакологической блокировкой этого цитокина. С помощью технологии обратной генетики мы получили мышей с тамоксифен-зависимым индуцибельным нокаутом IL-6 в миелоидных клетках. В качестве комплементарного подхода мы создали две модели трансгенной, Cre-опосредованной, сверхэкспрессии IL-6 человека или мыши определенными типами клеток. В совокупности эти эксперименты позволили установить патогенную роль IL-6, продуцируемого миелоидными клетками. Наконец, мы создали и охарактеризовали панель новых биспецифических антител для избирательного воздействия на IL-6, продуцируемого миелоидными клетками, in vitro и in vivo. Тем самым, нами обоснован новый подход к анти-цитокиновой терапии этих заболеваний с помощью блокировки IL-6 только на миелоидных клетках биспецифическими антителами. Полученные в ходе проекта результаты были представлены на нескольких престижных международных конференциях, часть из них уже опубликованы. Все заявленные работы в плане на 2016 г. выполнены в полном объеме, а количество публикаций по проекту удовлетворяет требованиям конкурса.

Публикации

1. Архипова А.Ю., Носенко M.A., Малюченко Н.В., Зварцев Р.В., Мойсенович А.М., Жданова А.С., Васильева Т.В., Горшкова Е.А., Агапов И.И., Друцкая М.С., Недоспасов С.А., Мойсенович М.М. Влияние фиброиновых микроносителей на воспаление и регенерацию полнослойных ран кожи у мышей. Биохимия, 81(11): 1494-1504 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1134/S0006297916110031

2. Атретханы К-СН, Друцкая МС, Недоспасов СА, Гривенников СИ, Купраш ДВ. Chemokines, cytokines and exosomes help tumors to shape inflammatory microenvironment Pharmacology and therapeutics, 168: 98–112 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1016/j.pharmthera.2016.09.011

3. Атретханы К-СН, Носенко МА, Гоголева ВС, Зварцев РВ, Цин З, Недоспасов СА, Друцкая МС. TNF neutralization results in the Delay of Transplantable Tumor growth and reduced MDsc accumulation. Frontiers in Immunology, 7:147 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.3389/fimmu.2016.00147

4. Горшкова Е.А, Недоспасов С.А., Шилов Е.С. Эволюционная пластичность цитокинов семейства IL-6 Молекулярная биология, 50(6): 1-10 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.7868/S0026898416060069

5. Горшкова Е.А., Шилов Е.С. Возможные механизмы приобретения вирокинов герпесвирусами Биохимия, 81(11): 1604-1613 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1134/S0006297916110122

6. Друцкая М.С., Горшкова Е.А., Жданова А.А., Атретханы К.С., Гоголева В.С., Зварцев Р.В., Круглов А.А., Недоспасов С.А. Роль интерлейкина-6 в экспериментальном артрите, вызванным переносом артритогенных антител. Медицинская иммунология, 18(6): 573-580 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.15789/1563-0625-2016-6-569-574

7. Друцкая МС, Ефимов ГА, Астраханцева ИА, Круглов АА, Недоспасов СА. Making anti-cytokine therapy more selective: studies in mice Cytokine, - (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1016/j.cyto.2016.08.022

8. Корнеев К.В., Свиряева Е.Н., Друцкая М.С., Купраш Д.В. и Недоспасов С.А. Разработка системы для индуцируемой Cre-зависимой продукции интерлейкина-6 человека в клетках мыши и человека. Российский иммунологический журнал, 10(19), 2: 188–192 (год публикации - 2016)

9. Корнеев КВ, Атретханы К-СН, Друцкая МС, Гривенников СИ, Купраш ДВ, Недоспасов СА TLR-signaling and proinflammatory cytokines as drivers of tumorigenesis Cytokine, - (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1016/j.cyto.2016.01.021

10. Круглов А.А., Недоспасов С.А. Cytokine neutralization at specific cellular source: A new therapeutic paradigm? Zeitschrift für Rheumatologie, - (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1007/s00393-016-0215-y

11. Мохонов В.В., Шилов Е.С., Корнеев К.В., Атретханы К-С.Н., Горшкова Е.А., Жданова А.А., Василенко Е.В., Горяйнова О.С., Купраш Д.В.,Тиллиб С.В., Друцкая М.С., Ефимов Г.А., Недоспасов С.А. Новые биспецифические белки, связывающие цитокины и поверхностные маркеры миелоидных клеток. Российский иммунологический журнал, - (год публикации - 2016)

12. Свиряева Е.Н., Корнеев К.В., Друцкая М.С., Недоспасов С.А., Купраш Д.В. Моделирование вирусно-бактериальных коинфекций на молекулярном уровне с использованием агонистов рецепторов врожденного иммунитета Доклады Академии Наук, 471(1): 1-4 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.7868/S0869565216310297

13. Атретханы К.С., Друцкая М.С. Миелоидные супрессорные клетки и провоспалительные цитокины как мишени терапии рака. Биохимия, 81(11):1520 – 1529 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1134/S0006297916110055

14. Дмитриева О.С., Шиловский И.П., Хаитов М.Р., Гривенников С.И. ИЛ-1 и ИЛ-6 – главные медиаторы воспаления при развитии рака Биохимия., 81(2):166-178 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1134/S0006297916020024

15. Атретханы К-С.Н, Носенко М.А,Зварцев Р.В., Хозер Д., Вильямский Г., Бланкенштайн Т., Недоспасов С.А., Друцкая М.С. IL-6 и другие провоспалительные цитокины в модели спонтанной B-клеточной лимфомы Успехи молекулярной онкологии, (2) 4:59-60 (год публикации - 2015)

16. Атретханы К-С.Н., Носенко M.A., Зварцев Р.В., Круглов А.А., Ефимов Г.А., Недоспасов С.А., Друцкая М.С. Провоспалительные цитокины и миелоидные супрессорные клетки как мишени терапии рака Успехи молекулярной онкологии, (2) 4: 59 (год публикации - 2015)

17. Ефимов Г., Розов Ф., Мохонов В., Друцкая М., Круглов А., Тиллиб С., Недоспасов С.А. Targeted inhibition of proinflammatory cytokines produced by myeloid cells Journal of Immunology, 196:70.10 (год публикации - 2016)

18. Корнеев К., Свиряева Е., Кондакова А., Круглов А., Друцкая М., Недоспасов С., Книрель Ю., Купраш Д. Lipopolysaccharides with different lipid A acylation status from Vibrio cholerae and Campylobacter jejuni contribute differently to IL6 production by bone marrow-derived macrophages FEBS Journal, 283 (S. 1): 150 (год публикации - 2016)

Возможность практического использования результатов
не указано