Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Первичная последовательность белка CD45-AP была проанализирована с помощью биоинформационных ресурсов. Было определено, что в молекуле CD45-AP можно выделить до 13 потенциальных сайтов фосфорилирования. С помощью направленного мутагенеза были получены экспрессионные плазмиды, кодирующие белок CD45-AP в котором отмеченные сайты фосфорилирования были мутированы на алинин. Влияние отдельных точечных мутаций на уровень фосфорилирования определяли при временной трансфекции полученных плазмид в клетки HEK293T. Только мутация Ser153Ala приводила к падению уровня фосфорилирования молекулы CD45-AP. Для того чтобы определить особенности фосфорилирования белка CD45-AP в лимфоидных клетках были получены стабильные трансфектомы, экспрессирующие мутантные формы молекулы CD45-AP. В качестве родительской линии при получении стабильных трансфектом была использована Т-клеточная линия CCRF-CEM. Для того чтобы избежать интерференции эндогенного и экзогенного белка CD45-AP предварительно была получена сублиния клеток CEM нокаутная по белку CD45-AP. Нокаутирование осуществляли по технологии CRISPR-Cas9. В экспериментах на стабильных трансфектомах было показано, что Ser99 в молекуле CD45-AP подвергается фоосфорилированию. Участие этих и других сайтов в фосфорилировании молекулы CD45-AP было подтверждено в независимых экспериментах с применением масс-спектрометрии. Было показано, что фосфорилирование по Ser99 значительно снижается при активации лимфоцитов. Полученные данные помогут в установлении функции белка CD45-AP, которая до сих пор остается неизвестной.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Основной задачей 2015 года было определение статуса фофсорилирования молекулы CD45-AP в норме и при активации. С помощью метода дифференциального гель-электрофореза (2D-DIGE) было показано, что белок CD45-AP существует в виде 7 протеоформ. Из них 6 протеоформ являются фосфоформами, а седьмая представляет собой нефосфорилированный белок. Обнаруженные фосфоформы соответствуют моно-, ди- и три-фосфорилированным формам белка CD45-AP. Анализ интенсивностей пятен показал, что наиболее представленными являлись моно- и ди-фосфорилированные формы белка, которые составляли 40% и 24% от общего содержания белка CD45-AP соответственно. Отмеченные протеоформы были характерны для лимфоидных клеток различного происхождения: Т-клетки (CEM, Jurkat и HUT78), В-клетки (Raji и Ramos), NK-клетки (YT) и миелоидные клетки (KG1a) (Filatov et al., Clinical & Translational Immunology, 2015, v. 4, e44; doi:10.1038/cti.2015.22.2015). Это показывает, что киназы и фосфатазы, ассоциированные с CD45-AP, являются общими для всех лимфоидных клеток. Для того чтобы обеспечить обнаруженное многообразие фосфоформ, необходимо допустить существование по крайней мере четырех сайтов фосфорилирования. Обилие сайтов фосфорилирования для такого маленького белка как CD45-AP предполагает, что этот белок является регулятором в процессах активации клетки. Активация клеток с помощью форболмиристатацетата приводила к изменению набора пятен белка CD45-AP на двумерных гелях. Это показывает, что при активации клетки происходит дефосфорилирование одних сайтов и фосфорилирование других сайтов, характерных для активированного состояния клетки. В тесте фосфорилирования рекомбинантного белка CD45-AP in vitro нами были протестированы 229 различных Ser/Thr киназ. Большая часть киназ была неактивна в отношении белка CD45-AP. Слабую активность проявляла киназа легкой цепи миозина (MYLK2) и кальмодулин зависимая протеин киназа 2-ого типа (CAMK2A). Высокую активность демонстрировало семейство протеин киназ С (PKC), при этом наибольшей активностью обладали изоформы альфа и бета1. Две изоформы (mu и nu), принадлежащие к семейству «новых» PKC, были не активны в отношении CD45-AP. Эксперименты с сублинией Jurkat, дефицитной по киназе Lck, показали, что ни сама киназа Lck, ни другие киназы, лежащие в сигнальных путях ниже Lck, не участвует в фосфорилировании белка CD45-AP. Таким образом белок CD45-AP является динамично фосфорилируемой молекулой, функция которой будет установлена после определения киназ и фосфатаз контролирующих статус фосфорилирования этой молекулы.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Основной задачей 2016 года была идентификация сайтов фосфорилирования молекулы CD45-AP при экспрессии белка в лимфоидных клетках. Эта задача решалась с помощью трех независимых методов: направленного мутагенеза, масс-спектрометрического анализа и путем создания фосфо-специфических антител. На основе Т-клеточной линии CEM, нокаутной по гену CD45-AP, была получена серия стабильных трансфектантов, экспрессирующих различные мутантные варианты молекулы CD45-AP. Были определены точечные и делеционные мутации, приводящие к потере тех или иных фосфоформ белка CD45-AP. Было установлено, что в покоящихся Т-клетках молекула CD45-AP фосфорилирована по Ser-99, Ser-153 и Ser-172. Тройной мутант S99A/S153A/S172A существовал только в полностью нефосфорилированной форме. Обнаруженные сайты фосфорилирования были подтверждены масс-спектрометрическим анализом белка CD45-AP, а также с помощью полученных нами фосфо-специфических поликлональных антител. При стимуляции Т-лимфоцитов с помощью форболмиристата (PMA), который является активатором протеин-киназы С, наблюдалось дефосфорилирование модифицированных остатков Ser-99 и Ser172, но не Ser-153. Наряду с этим отмечалось фосфорилирование остатка Ser-163, который в покоящемся состоянии остается дефосфорилированным. Дефосфорилирование Ser-99 и Ser-172 развивалось в течении 5 мин после стимуляции, а фосфорилирование Ser-163 происходило в течении 30 мин. Быстрая кинетика фосфорилирования/дефосфорилирования молекулы CD45-AP совпадает с временными характеристиками фосфорилирования сигнальных молекул из Ras-зависимого пути активации. Все это указывает на возможное участие CD45-AP в сигналинге клетки. Двумерные электрофореграммы белка CD45-AP для первичных лимфоцитов и клеток линии CEM совпадали. Это позволяет утверждать, что сайты фосфорилирования идентифицированные для клеток линии CEM соответствуют таковым для периферических лимфоцитов. Был проведен анализ мотивов, в которые входят идентифицированные сайты фосфорилирования. Этот анализ показал, что в процессах фосфорилирования молекулы CD45-AP могут принимать участие такие ферменты как казеин киназы I и II типа, а также митоген-активируемые протеин киназы (MAPK). Мы предполагаем, что процессы обратимого фосфорилирования/дефосфорилирования молекулы CD45-AP могут сопровождать такие физиологические процессы, как например активацию Т-лимфоцитов при антиген-специфической стимуляции через TCR рецептор. Мы надеемся, что изучение путей фосфорилирования CD45-AP в конечном счете приведет к установлению функциональной роли этой молекулы.