КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 14-14-00696
НазваниеСистемный анализ секрета слюнных желез медицинских пиявок различных видов (Hirudo medicinalis, H. verbаna, H.orientalis) для направленного поиска новых антимикробных белков и пептидов.
РуководительЛазарев Василий Николаевич, Доктор биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства", г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 2014 г. - 2016 г. |
Конкурс№1 - Конкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков
Ключевые словаАнтимикробные белки, антимикробные пептиды, медицинская пиявка, Hirudo medicinalis, H. verbаna, H.orientalis, секрет слюнных желез, библиотека кДНК, транскриптомика, протеомика, масс-спектрометрия
Код ГРНТИ31.23.27
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Первое упоминание о лечении пиявками относится к X в. до н.э. Несмотря на это, секрет слюнных желез медицинской пиявки, являющийся настоящей «природной аптекой», только сегодня начинает детально изучаться. Секрет слюнных желез (ССЖ) пиявки содержит биологически активные соединения, способные оказывать антикоагулянтное, противовоспалительное, антимикробное, фибринолитическое, противосклеротическое, гипотензивное, анальгезирующее, иммуномодулирующее и другие действия. И, если ингибиторы протеолитических ферментов, входящие в состав ССЖ, довольно активно исследуются на протяжении последних двадцати лет, то антимикробные компоненты секрета белковой природы остаются сегодня практически неизвестными. Тем не менее, сегодня антимикробные белки и пептиды являются одними из самых перспективных антиинфекционных агентов. Сложилась парадоксальная ситуация – после нескольких десятилетий бурного развития химии антибиотиков, мы опять возвращаемся к древнейшим биологическим соединениям – антимикробным белкам и пептидам. Движущей силой поиска новых антимикробных соединений, безусловно, является катастрофический рост случаев резистентности микроорганизмов к используемым сейчас антибиотикам. Фармацевтические компании непрерывно модифицируют существующие антибиотики и создают новые. К сожалению, сейчас уже можно признать, что скорость синтеза новых антибиотиков ниже скорости появления резистентных, а в ряде случаев, и мультирезистентных штаммов микроорганизмов. В этом смысле, ССЖ пиявки может служить перспективным источником новых высокоэффективных антимикробных соединений белковой природы. Несомненным преимуществом объекта исследования, который представляет собой уникальный сбалансированный набор природных высоко-специфических биологически активных соединений, является их эволюционная адаптированность к крови теплокровных животных и человека, что, возможно, позволит синтезировать современные антимикробные препараты с минимальными побочными эффектами. Проект направлен на системный анализ секрета слюнных желез медицинской пиявки как основы для направленного поиска и изучения физико-химических и биологических свойств новых антимикробных белков и пептидов.
Научная новизна проекта заключается в применении комплексного подхода к поиску, детальному изучению и валидации антимикробных белков и пептидов ССЖ. Комплексный подход подразумевает проведение транскриптомных исследований слюнных желез медицинской пиявки, протеомного анализа ССЖ с последующим детальным биоинформатическим анализом, изучением биологической функции обнаруженных соединений in vitro и in vivo, химическим и биотехнологическим синтезом перспективных белков и пептидов, изучением и/или моделированием их пространственной структуры. В ходе выполнения проекта, помимо поиска новых антимикробных соединений белковой природы, планируется изучить фундаментальные принципы формирования компонентного состава ССЖ.
Ожидаемые результаты
На современном этапе развития биологии поиск таргетных биологически активных соединений и изучение фундаментальных механизмов их действия невозможны без использования системного анализа изучаемого объекта. В ходе выполнения проекта для поиска новых антимикробных соединений белковой природы в ССЖ медицинских пиявок планируется применение комплексного подхода, сочетающего в себе новейшие «омиксные» технологии с детальным изучением биологической активности найденных соединений на биомоделях различного уровня, что позволит получить результаты, соответствующие международному уровню научных работ в данной области.
С использованием технологии лазерной микродиссекции впервые будет разработан прецизионный метод изоляции слюнных желез трех видов медицинских пиявок: Hirudo medicinalis, H.verbаna и H.orientalis. Метод лазерной микродиссекции позволит выделить с высокой точностью определенные фрагменты ткани, отдельные клетки, что обеспечит достаточную чистоту стартового материала для последующего системного анализа.
Впервые будет проведен исчерпывающий транскриптомный анализ слюнных желез трех видов медицинских пиявок с использованием двух подходов: i) конструирование репрезентативных нормализованных библиотек кДНК, обогащенных полноразмерными последовательностями на основе РНК, выделенной из слюнных желез медицинской пиявки с последующим высокопроизводительным секвенированием; ii) прямое глубокое транскриптомное профилирование тотальной РНК, выделенной из слюнных желез медицинской пиявки. Оба подхода будут реализованы с использованием секвенаторов второго поколения.
Будет проведено полномасштабное протеомное профилирование цельного ССЖ пиявки, включающее идентификацию белковых и пептидных компонентов. Использование в проекте новейших тандемных хромато-масс-спектрометров последнего поколения позволит: i) получить полную количественную информацию о белковом и пептидном составе образца; ii) проводить количественный анализ с высоким уровнем селективности и разрешения при работе со сложными смесями; iii) иметь высокую степень надежности идентификации компонентов ССЖ.
После интеграции транскриптомных и протеомных данных будет проведен детальный биоинформатический анализ, заключающийся в выявлении ранее неизвестных компонентов белковой и пептидной природы ССЖ пиявки, а также в предсказании их возможных биологических активностей.
Кандидатные антимикробные пептиды будут синтезированы химически, антимикробные белки будут получены путем гомологичной и гетерологичной экспрессии кодирующих их генов в бактериальных, дрожжевых и эукариотических системах. Проверка биологической активности будет проводиться на бактериальных тест-штаммах и культурах клеток (в случае внутриклеточных бактерий).
В ходе выполнения проекта планируется провести секвенирование не менее 20 000 индивидуальных последовательностей из полученных библиотек кДНК, идентифицировать не менее 50 пептидов и 20 белков, предположительно обладающих антибактериальной активностью, синтезировать не менее 10 потенциальных антимикробных пептидов и получить путем экспрессии в гомологичных и гетерологичных системах не менее 3 потенциальных антимикробных белков.
После широкомасштабного секвенирования полученных библиотек кДНК планируется депонировать эти нуклеотидные последовательности в международных базах данных. По результатам выполнения проекта планируется опубликование не менее 4 статей в зарубежных рецензируемых научных изданиях.
Таким образом, системный анализ секрета слюнных желез различных видов медицинских пиявок, помимо решения фундаментальной проблемы исследования многообразия ССЖ и изучения физико-химических свойств отдельных его компонентов, послужит для создания антимикробных препаратов нового поколения.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Проект направлен на поиск и изучение физико-химических свойств новых антимикробных белков и пептидов в секрете слюнных желез трех видов медицинских пиявок: Hirudo medicinalis, H.verbаna и H.orientalis. Для решения этой задачи планируется провести полное транскриптомное профилирование изолированных слюнных желез медицинских пиявок трех видов и исчерпывающий протеомный анализ цельного секрета с последующим биоинформатическим анализом. Отобранные кандидатные пептиды и белки будут синтезированы химически или получены биотехнологическим способом для дальнейшего изучения с целью создания современных эффективных антимикробных средств.
В отчетном 2014 году был создан банк биологического материала: слюнные железы и клетки мышечной ткани медицинских пиявок трех видов (H. medicinalis, H.verbаna и H.orientalis), изолированные с помощью технологии лазерной микродиссекции для транскриптомного профилирования и цельный секрет слюнных желез для протеомного анализа. Для каждого вида пиявки было собрано по 20 образцов указанного биологического материала.
Были сконструированы как ненормализованные, так и нормализованные библиотеки кДНК изолированных слюнных желез и клеток мышечной ткани медицинских пиявок трех видов. С использованием секвенаторов второго поколения для трех видов медицинских пиявок достоверно было определено около 65 млн. нуклеотидов, которые составили 60 667 индивидуальных фрагментов (контигов).
Проведен первичный биоинформатический анализ полученных нуклеотидных последовательностей и создана локальная база транскриптов слюнных желез и клеток мышечной ткани H. medicinalis, H.verbаna и H.orientalis. Отобраны кандидатные последовательности кДНК для углубленного биоинформатического анализа. Полученные данные депонируются в организованной базе данных «Hirudo» BioProject NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/256119).
Публикации
Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Проект направлен на поиск и изучение физико-химических свойств новых антимикробных белков и пептидов в секрете слюнных желез (ССЖ) трех видов медицинских пиявок: Hirudo medicinalis, H.verbаna и H.orientalis. Для решения этой задачи планируется провести полное транскриптомное профилирование изолированных клеток слюнных желез медицинских пиявок трех видов и исчерпывающий протеомный анализ цельного секрета с последующим биоинформатическим анализом. Отобранные кандидатные пептиды и белки будут синтезированы химически или получены биотехнологическим способом для дальнейшего изучения с целью создания современных эффективных антимикробных средств.
В отчетном 2015 году проведен исчерпывающий протеомный и пептидомный анализ цельного секрета слюнных желез медицинских пиявок трех видов (H.medicinalis, H.verbana, H.orientalis). Для этого разработана методика выделения пептидов и белков из цельного ССЖ медицинских пиявок из банка биоматериала, а также разработан протокол комбинации пробоподготовки и хромато-масс-спектрометрического анализа пептидных и белковых фракций ССЖ.
Определены белковые и пептидные профили трех видов медицинских пиявок. Суммарно было идентифицировано 490 нативных и триптических индивидуальных пептидов H.medicinalis, H.verbana, H.orientalis. Используя транскриптомные данные, полученные на первом этапе выполнения проекта, была создана референсная база белковых последовательностей. В полученных масс-спектрах производился поиск соответствия белковых масс пептидов относительно этой референсной базы данных. На основе этих данных была выявлена видовая вариация в белковом составе ССЖ и выделен основной и дополнительный пулы белков и пептидов цельного ССЖ. В итоге сформирован список потенциальных антимикробных пептидов и белков для их дальшейшего химического или биотехнологического синтеза и изучения физико-химических свойств. В ходе выполнения второго этапа проекта создана технологическая платформа для гомологичной и гетерологичной экспрессии антимикробных белков и пептидов, а также впервые получены три изоформы одного из основных антимикробных белков CCЖ - дестабилазы-лизоцима в виде рекомбинантных белков в E.coli, дрожжах Pichia pastoris и клетках человека Expi293. В международных научных журналах опубликовано 3 статьи по теме проекта.
Публикации
1. Kurdyumov A.S., Manuvera V.A., Baskova I.P., Lazarev V.N. A comparison of the enzymatic properties of three recombinant isoforms of thrombolytic and antibacterial protein-Destabilase-Lysozyme from medicinal leech BMC Biochemistry, V.16:27 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1186/s12858-015-0056-3
2. Manuvera V.A., Kurdyumov A.S., Filonova K.A., Lazarev V.N. Generation of recombinant destabilase-lysozyme from medicinal leeches in three different expression systems Protein Expression and Purification, V.116. P.50–58 (год публикации - 2015) https://doi.org/10.1016/j.pep.2015.08.012
3. Podgorny O.V., Polina N.F., Babenko V.V., Karpova I.Y., Kostryukova E.S., Govorun V.M., Lazarev V.N. Isolation of single Chlamydia-infected cells using laser microdissection Journal of Microbiological Methods, V.109. (2015). P.123–128 (год публикации - 2014) https://doi.org/10.1016/j.mimet.2014.12.018
Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Проект направлен на поиск и изучение физико-химических свойств новых антимикробных белков и пептидов в секрете слюнных желез (ССЖ) трех видов медицинских пиявок: Hirudo medicinalis, H.verbаna и H.orientalis. Для решения этой задачи планируется провести полное транскриптомное профилирование изолированных клеток слюнных желез медицинских пиявок трех видов и исчерпывающий протеомный анализ цельного секрета с последующим биоинформатическим анализом. Отобранные кандидатные пептиды и белки будут синтезированы химически или получены биотехнологическим способом для дальнейшего изучения с целью создания современных эффективных антимикробных средств.
В отчетном 2016 году сконструирована серия плазмидных векторов для экспрессии генов выбранных антимикробных пептидов и белков в клетках E.coli и клетках человека. Получены штаммы-продуценты E.coli и линии клеток человека Expi293 (клетки эмбриональной почки человека), а также разработана методика выделения и очистки антимикробных пептидов и белков. Таким образом, в ходе выполнения третьего этапа проекта создана технологическая платформа для гетерологичной экспрессии антимикробных белков и пептидов медицинской пиявки. Кроме того, с использованием твердофазного метода химически синтезирована серия потенциальных антимикробных пептидов. Полученные пептиды были очищены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
На заключительном этапе выполнения работы была определена антимикробная активность химически синтезированных пептидов, а также пептидов и белков, полученных в E.coli и клетках человека в отношении Грам-положительных и Грам-отрицательных бактерий, а также в отношении облигатных внутриклеточных паразитов Chlamydia trachomatis. Таким образом, в ходе выполнения проекта было получено три белка и пять пептидов, обладающих антимикробной активностью. Эти белки и пептиды могут стать кандидатами для разработки антимикробных лекарственных средств нового поколения.
В международных научных журналах опубликовано 2 статьи по теме проекта.
Публикации
1. Бабенко В.В. и др. Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches BMC Genomics, - (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1186/s12864-020-6748-0
2. Графская Е.Н., Надеждин К.Д., Талызина И.А., Полина Н.Ф., Подгорный О.В., Павлова Е.Р., Башкиров П.В., Харлампиева Д.Д., Бобровский П.А., Лацис И.А., Манувера В.А., Бабенко В.В., Трухан В.М., Арсеньев А.С., Клинов Д.В., Лазарев В.Н. Medicinal leech antimicrobial peptides lacking toxicity represent a promising alternative strategy to combat antibiotic-resistant pathogens European Journal of Medicinal Chemistry, - (год публикации - 2019)
3. Никитина А.C., Бабенко В.В., Акопиан Т.А., Широков Д.А., Манувера В.А., Курдюмов А.С., Кострюкова Е.С., Лазарев В.Н. Draft mitochondrial genomes of Hirudo medicinalis and Hirudo verbana (Annelida, Hirudinea) Mitochondrial DNA Part B, V.1.P.254-256 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1080/23802359.2016.1157774
4. Подгорный О.В., Лазарев В.Н. Laser microdissection: A promising tool for exploring microorganisms and their interactions with hosts Journal of Microbiological Methods, - (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1016/j.mimet.2016.01.001
Возможность практического использования результатов
не указано