Разработка новых молекулярных инструментов ферментативного и флуорогенного флуоресцентного мечения для прижизненной визуализации в живых системах.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 18-73-10105

НазваниеРазработка новых молекулярных инструментов ферментативного и флуорогенного флуоресцентного мечения для прижизненной визуализации в живых системах.

Руководитель Баранов Михаил Сергеевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №30 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах; 03-103 - Синтез, строение и свойства природных и физиологически активных веществ; медицинская химия и прогнозирование различных видов биоактивности

Ключевые слова Флуоресценция, флуоресцентные красители, флуорогенные красители, флуороген-активирующие белки, гетероциклические соединения, системы мечения, флуоресцентная микроскопия, имидазолоны, GFP, Y-FAST, NanoLuc, липоевая кислота, лигаза, перекись водорода, сольватохромизм.

Код ГРНТИ31.21.27

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Технологии современной флуоресцентной микроскопии позволили достичь беспрецедентного уровня понимания многих биологических процессов и вошли в арсенал ключевых инструментов современной биологии и молекулярной медицины. Использование подобных технологий невозможно без введения в исследуемые объекты различных меток, в роли которых могут выступать флуоресцентные белки, а также синтетические флуорофоры. К сожалению, все существующие подходы не лишены недостатков, поэтому создание новых эффективных методов флуоресцентного мечения живых систем является актуальной и важной задачей. В связи с этим, целью настоящего исследования является разработка новых молекулярных инструментов визуализации процессов, протекающих в живых системах. В рамках поставленной цели в проекте планируется реализовать три ключевых направления: 1) Расширение палитры красителей, пригодных для использования в системе флуоресцентного мечения с использованием мутантных форм лигазы липоевой кислоты. В природе эта лигаза катализирует ковалентное связывание липоевой кислоты с определенным пептидным фрагментом. Синтетические мутанты этого фермента могут аналогичным образом катализировать реакцию с флуоресцентными красителями, что может быть использовано для пострансляционного мечения белков, если в них добавлена нужная последовательность аминокислот. К сожалению, на данный момент создано лишь две мутантные формы этой лигазы, которые позволяют вводить синюю и красную флуоресцентные метки. В нашей работе мы планируем расширить этот набор за счет создания новых красителей с похожей структурой и тестирования их против масштабной библиотеки мутантных форм лигазы с измененным сусбтрат-связывающим «карманом». 2) Создание новых пар флуороген/флуороген-активирующий белок на основе хромофоров флуоресцентных белков и белков NanoLuc и Y-FAST. Помимо традиционных подходов к мечению, в которых используются объекты, имеющие постоянную флуоресценцию, недавно был разработан ряд методов основанных на использовании веществ–флуорогенов, которые не имеют выраженной флуоресценции сами по себе, однако приобретают ее при связывании с целевыми белками. Одной из перспективных групп веществ-флуорогенов являются производные хромофоров флуоресцентных белков, характеризующиеся колоссальным химическим разнообразием и широчайшей палитрой цветов. В настоящем проекте мы планируем протестировать возможность активации флуоресценции этих веществ белками NanoLuc и Y-FAST, чьи субстраты имеют очень похожее строение. Использование комбинаторной библиотеки веществ и проведение нескольких итерационных шагов тестирование-анализ-синтез-тестирование позволят добиться нужного результата. 3) Создание новых специфических низкомолекулярных сенсоров, обладающих выраженной флуорогенностью. Третьей частью настоящего проекта станет создание генетически не кодируемых меток. В роли подобных меток чаще всего используются различные сенсоры – флуорофоры, в структуре которых содержится группа чувствительная к определнному аналиту. Основной проблемой, которая возникает при использовании подобных веществ, является нецелевое мечение и наличие фонового сигнала. В настоящей работе мы предлагаем видоизменить этот подход и использовать в роли сенсоров вещетсва с выраженной флуорогенностью – упомянутые производные хромофоров флуоресцентных белков. Такие сенсоры не будут флуоресцентны в воде, а будут флуоресцировать лишь в менее полярных средах. Подобное свойство не позволит наблюдать мгновенного отклика на появление аналитов в водной среде, однако позволит избежать размывания и позволит детектировать аналиты в мембранах. Более того, эти вещества смогут стать отличными красителями, селективными в отношении отдельных органелл клеток, богатых определенными аналитами (окислителями, кислотами, тиолами и т.п.), так как накопление флуоресцентного сигнала будет происходить строго в мембранах подобных органелл. Таким образом, реализация настоящего проекта позволит предложить новые подходы к визуализации процессов, протекающих в живых системах, с помощью генетически кодируемых и некодируемых технологий флуоресцентного мечения с использованием новых флуоресцентных и флуорогенных соединений. Подобные результаты позволят достигнуть прорыва в решении задач многоцветного флуоресцентного мечения, а также визуализации быстродеградирующих белков и других актуальных направлениях, что является важной задачей, не только в фундаментальном, но и в прикладном плане.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Балеева Н.С., Зайцева С.О., Минеев К.С., Хаврошечкина А.В., Загудайлова М.Б., Баранов М.С. Enamine-azide [2+3]-cycloaddition as a method to introduce functional groups into fluorescent dyes Tetrahedron Letters, Том: 60 Выпуск: 5 Стр.: 456-459 (год публикации - 2019)
10.1016/j.tetlet.2019.01.007

2. Чен Ч., Баранов М.С., Зу Л., Балеева Н.С., Смирнов А.Ю., Зайцева С.О., Ямполский И.В., Солнцев К.М., Фанг Ч. Designing redder and brighter fluorophores by synergistic tuning of ground and excited states CHEMICAL COMMUNICATIONS, 2019,55, 2537-2540 (год публикации - 2019)
10.1039/c8cc10007a

3. Чен Ч., Зу Л., Баранов М.С., Танг Л., Балеева Н.С., Смирнов А.Ю., Ямпольский И.В., Солнцев К.М., Фанг Ч. Photoinduced Proton Transfer of GFP-Inspired Fluorescent Superphotoacids: Principles and Design The Journal of Physical Chemistry B, 123, 17, 3804-3821 (год публикации - 2019)
10.1021/acs.jpcb.9b03201

4. Ермакова Ю.Г., Богданова Ю.А., Балеева Н.С., Зайцева С.О., Гугля Е.Б., Смирнов А.Ю., Загудайлова М.Б., Баранов М.С. Pyridine analogue of fluorescent protein chromophore: Fluorogenic dye suitable for mitochondria staining DYES AND PIGMENTS, 170, 107550 (год публикации - 2019)
10.1016/j.dyepig.2019.107550

5. Поварова Н.В., Зайцева С.О., Балеева Н.С., Смирнов А.Ю., Мяснянко И.В., Загудайлова М.Б., Божанова Н.Г., Горбачев Д.А., Малышевская К.А., Гавриков А.С., Мишин А.С., Баранов М.С. Red-Shifted Substrates for FAST Fluorogen-Activating Protein Based on the GFP-Like Chromophores CHEMISTRY-A EUROPEAN JOURNAL, Том: 25 Выпуск: 41 Стр.: 9592-9596 (год публикации - 2019)
10.1002/chem.201901151

6. Чен Ч, Зу Л, Болангер С.А., Балеева Н.С., Мяснянко И.Н., Баранов М.С., Фанг Ч. Ultrafast excited-state proton transfer dynamics in dihalogenated non-fluorescent and fluorescent GFP chromophores JOURNAL OF CHEMICAL PHYSICS, 12.2019 (год публикации - 2020)
10.1063/1.5138666

7. А.И.Соколов, И.Н. Мяснянко, Н.С. Балеева, М.С. Баранов Styrene Derivatives of Indole and Pyranone as Fluorogenic Substrates for FAST Protein Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Vol. 47, No. 1, pp. 316–319 (год публикации - 2021)
10.1134/S1068162021010234

8. Минеев К.С. и др. полный список авторов превышает допустимый размер поля NanoFAST: structure-based design of a small fluorogen-activating protein with only 98 amino acids CHEMICAL SCIENCE (год публикации - 2021)
10.1039/D1SC01454D

Публикации