Разработка новых подходов к получению клеток с нокаутом и индуцированным нокдауном генов, кодирующих внутриклеточные или секретируемые белки

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 18-14-00333

НазваниеРазработка новых подходов к получению клеток с нокаутом и индуцированным нокдауном генов, кодирующих внутриклеточные или секретируемые белки

Руководитель Мазуров Дмитрий Вячеславович, Кандидат медицинских наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук , г Москва

Конкурс №28 - Конкурс 2018 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-210 - Молекулярная генетика

Ключевые слова CRISPR/Cas, нокаут, нокин, жизненно важные гены, клеточная сортировка, GPI-заякоренные белки, эпитопные маркеры

Код ГРНТИ34.15.27

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
С появлением технологии CRISPR/Cas9 получение нокаутов стало простым и надежным способом изучения функции гена. Ранее мы показали, что, в отличие от клонов, клетки с редактированным геномом, выделенные как поликлональная популяция, являются более пригодными для последующих функциональных тестов (Zotova et al., Viruses 2017). Клетки с нокаутом гена, кодирующим поверхностный белок, легко выделить методом негативной сортировки после окраски соответствующим антителом. Для получения же нокаутов по внутриклеточным или секретируемым белкам используют клонирование, пригодное не для всех типов клеток, или конструирование донорского вектора, которое требует много времени и может быть непростым. Цель нашего проекта - разработать принципиально новый подход к селекции клеточных нокаутов и нокдаунов, лишенный вышеперечисленных недостатков. В основе концепции лежит создание короткой генетической конструкции, которая при интеграции в целевой ген, т.е. нокин, обеспечивала бы инактивацию/модификацию гена с одновременной экспрессией маркерного эпитопа на поверхности клетки, по которому эти клетки можно отсортировать. Малая длина конструкции позволит использовать короткие (~100 нуклеотидов) плечи гомологии в составе праймеров и генерировать донорскую ДНК методом ПЦР, при этом сохраняя нокин на уровне, достаточном для сортировки позитивных клеток. Экспрессия маркерного эпитопа будет реализована за счет мутации старт-кодона целевого гена и использования короткого транскрипционного терминатора в составе донора. Для доставки эпитопов (Flag и HA) на поверхность клетки будут тестированы короткие нативные и химерные GPI-заякоренные белки человека, ряд трансмембранных доменов. Также будет изучена возможность использования тетрацистеинового тага. Реализуемость предложенной концепции подтверждена предварительными экспериментами по изоляции полных нокаутов с использованием конструкций на основе гена CD52. Кроме того, будут разработаны генетические конструкции для селекции клеток, в которых целевой ген не инактивирован, а слит с последовательностью ауксин-индуцируемого дегрона. Это позволит изучать функцию жизненно важных белков после их временной протеасомной деградации. Разрабатываемый метод обещает быть универсальным, легким в дизайне для каждого отдельного гена, применим для изучения большинства клеточных белков, позволит дополнительно мониторить активность промотора целевого гена и может потенциально использоваться в клинике для селекции, например, Т-лимфоцитов, «вылеченных» от провирусной ДНК ВИЧ-1 или резистентных к ВИЧ-1 вследствие нокаута гена LEDGF/p75, или для редактирования генома индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Атемасова А. А., Лопатухина Е. В., Зотова А. А., Мазуров Д. В. Functional characteristics of knockout cells generated via knockin of GPI-anchored epitope tags Genes & Cells, №2-2,Том XIII, стр.24 (год публикации - 2018)

2. Мазуров Д.В. A novel method of gene-edited cell selection via knockin of short GPI-anchored epitope tags Genes & Cells, №2-2, Том XIII, стр.42-43 (год публикации - 2018)

3. Зотова А.А., Пичугин А.В., Атемасова А.А., Княжанская Е., Лопатухина Е.В., Митькин Н., Холмухамедов Э., Готтих М.Б., Купраш Д.В., Филатов А.В., Мазуров Д.В. Isolation of gene-edited cells via knock-in of short glycophosphatidylinositolanchored epitope tags Scientific Reports, Feb 28;9(1):3132 (год публикации - 2019)
10.1038/s41598-019-40219-z

4. Зотова А.А., Атемасова А.А., Пичугин А.В., Филатов А.В., Мазуров Д.В. Distinct Requirements for HIV-1 Accessory Proteins during Cell Coculture and Cell-Free Infection Viruses, Apr 26;11(5). pii: E390 (год публикации - 2019)
10.3390/v11050390

5. Княжанская Е., Анисенко А., Шадрина О., Калинина А., Зацепин Т., Залевский А., Мазуров Д., Готтих М. NHEJ pathway is involved in post-integrational DNA repair due to Ku70 binding to HIV-1 integrase Retrovirology, Nov 6;16(1):30 (год публикации - 2019)
10.1186/s12977-019-0492-z

6. Мазуров Д.В., Масленникова А.Ю., Зотова А.А. Конструирование ВИЧ-1-эффекторных и ВИЧ-1-резистентных Т клеток человека с помощью модифицированного метода SORTS Acta Naturae, Том 2, спецвыпуск, стр. 12-13 (год публикации - 2019)

7. Мазуров Д.В., Зотова А.А., Масленникова А.Ю., Комков Д.С. Application of SORTS, a Novel Gene-Edited Cell Selection Method for HIV Study and Therapy Viruses (год публикации - 2020)

8. Мазуров Д.В. Селекция редактированных клеток методом SORTS Методы редактирования генов и геномов, Новосибирск, Издательство Сибирского отделения РАН, 2020 (год публикации - 2020)

Публикации