КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер проекта 17-74-10172

НазваниеФизико-химические детерминанты селективного действия блокаторов калиевых каналов из яда скорпионов

Руководитель Табакмахер Валентин Михайлович, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №23 - Конкурс 2017 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова блокаторы калиевых каналов, потенциал-чувствительные калиевые каналы, яд скорпионов, белок-белковые взаимодействия, молекулярная поверхность, молекулярное моделирование, молекулярная динамика, метод белковой топографии, биоинженерия, электрофизиологические измерения, метод двухэлектродной фиксации потенциала, рациональное конструирование высокоактивных пептидов

Код ГРНТИ34.15.15

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Потенциал-чувствительные калиевые каналы (Kv) – семейство трансмембранных белков, формирующих поры в цитоплазматической мембране, которые специфичны к ионам калия и чувствительны к изменениям мембранного потенциала клетки. Члены этого семейства присутствуют в мембранах практически всех типов электровозбудимых клеток и участвуют в различных физиологических процессах, включая реполяризацию мембраны при потенциале действия и развитие гиперполяризации, передачу нервного сигнала, клеточную пролиферацию и миграцию, кальциевый сигналинг [1,2]; а также вовлечены в развитие патологических состояний: болевых [3], аутоиммунных, неврологических [4] и онкологических [5]. Направленная регуляция активности Kv не только поможет пролить свет на молекулярные основы функционирования этих сложных биологических систем, но и эффективно решать проблемы, возникающие при его нарушении. В связи с этим, Kv привлекают исследовательский интерес как перспективные мишени в направленной терапии разнообразных заболеваний, а их лиганды – модуляторы, активаторы и блокаторы, – рассматриваются (и зачастую уже используются) как специфические регуляторы активности этих белков (например, ретигабин – активатор Kv7 – противоэпилептический препарат) [6–10]. Целью данного проекта является установление на молекулярном уровне детерминант селективного действия блокаторов потенциал-чувствительных калиевых каналов из яда скорпионов с применением методов компьютерного моделирования, подходов белковой биоинженерии и молекулярной электрофизиологии. Для решения поставленных задач будет использован недавно разработанный в ИБХ РАН перспективный компьютерный метод анализа физических свойств и структуры белков – белковая топография [11], – который уже показал свою эффективность при исследовании механизмов селективности белковых нейротоксинов [12] и дизайне высокоаффинных пептидных лигандов нейрональных рецепторов [13,14]. Кроме того, планируется применение нового вычислительного подхода, основанного на анализе специфических и неспецифических контактов в молекулярных комплексах [15]. Представляемый проект является частью и логическим продолжением совместного исследования структуры и функций нейротоксинов из яда скорпионов, проводимых группой молекулярных инструментов для нейробиологии и лабораторией моделирования биомолекулярных систем ИБХ РАН. Многолетнее плодотворное сотрудничество этих подразделений позволило достичь значительных успехов на стыке компьютерного и экспериментального подходов к решению задач структурной биологии и молекулярной нейробиологии. Одним из результатов этого сотрудничества стала исчерпывающая база структурных и функциональных данных о блокаторах калиевых каналов из ядов скорпионов Kalium (http://kaliumdb.org/) [16]. Для изучения взаимосвязи физико-химических и структурных характеристик исследуемых биомолекул с их активностью на основании данных Kalium и данных сайт-направленного мутагенеза KTx и Kv будет составлена выборка токсинов, имеющих различную специфичность/аффинность взаимодействия с Kv млекопитающих. Конкретными мишенями выступят подтипы Kv1.1 – Kv1.6, поскольку: (а) для них получены наиболее полные данные о структуре и механизмах функционирования, (б) эти изоформы представляют особый интерес с точки зрения фармакологии и (в) известна кристаллическая структура «вестибюля» поры канала Kv1.2 [17], что предоставляет уникальные возможности для исследования межмолекулярных взаимодействий методами компьютерного моделирования и молекулярной динамики. Для выбранных токсинов будут получены модели пространственных структур с помощью моделирования по гомологии с родственными KTx, для которых пространственная структура изучена экспериментально. Для всех изучаемых молекул будут проведены расчеты молекулярной динамики (МД) в явно заданном водном окружении длительностью порядка 10-7с с использованием программного пакета GROMACS [18]. Это позволит изучить конформационную подвижность токсинов и учесть их динамику при анализе структурных и физико-химических особенностей. В водном растворе изучаемые пептиды представляют собой компактные глобулы, что позволяет в первом приближении рассматривать их как сферические объекты. Планируется использовать предложенный ранее метод белковой топографии для описания свойств этих молекул в терминах сферических карт-разверток, позволяющих наглядно и детально описать распределение гидрофобных (и/или электростатических) свойств и рельеф молекулярной поверхности. Метод белковой топографии основан на построении молекулярной поверхности и расчете в их точках различных физико-химических и геометрических свойств. Примерами рассчитываемых параметров являются электростатический потенциал, гидрофобные свойства (согласно формализму молекулярного гидрофобного потенциала, МГП), рельеф, локальная кривизна поверхности и другие. С использованием этого метода ранее удалось выявить базовые принципы селективного действия млеко- и инсектотоксинов из яда скорпионов, воздействующих на натриевые каналы [12], расширить понимание молекулярных механизмов работы конотоксинов, селективно действующих на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, и создать новые высокоактивные лиганды этих рецепторов [13,14]. Преимущество метода заключается в возможности не только проводить анализ структуры и свойств отдельных молекул, но и выявлять общее и различное у представителей целых групп гомологичных белков, включающих десятки соединений. Предполагается, что развитие метода позволит выявлять физико-химические детерминанты селективного действия самых разнообразных биологически активных пептидов и белков, и, в первую очередь, блокаторов калиевых каналов – основных объектов исследования в данном проекте. Кроме того, будут построены модели молекулярных комплексов конкретных токсинов (из пула отобранных молекул) с отдельными изоформами Kv, и проведен расчет траекторий молекулярной динамики в водно-липидном окружении, имитирующем цитоплазматическую мембрану. На этом этапе работы для выявления структурно-функциональных взаимосвязей планируется применить новый комплекс подходов, основанный на учете и анализе специфических и неспецифических межмолекулярных контактов в комплексах KTx-Kv, успешно использованный нами ранее при решении задач, подобных сформулированным в настоящем проекте [15]. Результаты разных типов компьютерного анализа (описанных выше) будут обобщены, соотнесены с конкретными элементами структуры токсинов и сопоставлены с экспериментальными данными по их активности. Полученные результаты будут использованы для направленной инженерии KTx. Во-первых, будет предложен один или несколько вариантов аналогов природных KTx с заданной специфичностью; во-вторых, будет предложен набор точечных изменений структуры пептидов, исходно не обладающих блокирующей активностью в отношении Kv, которые приведут к ее появлению. Пептиды с рационально измененной структурой будут получены в бактериальной системе экспрессии с использованием подхода, зарекомендовавшего себя при выполнении подобных работ по получению дисульфид-богатых пептидов [19]. Искомые KTx будут продуцированы в специальных штаммах Escherichia coli (Origami, Shuffle) в виде химер с белком-помошником тиоредоксином, который будет затем отделен с помощью селективного протеолиза. Активность рекомбинантных KTx будет оценена в отношении целевых Kv с помощью современных методов электрофизиологии. Гены каналов будут экспрессированы в ооцитах шпорцевой лягушки, после чего влияние KTx на токи через соответствующие Kv будет измерено с использованием метода двухэлектродной фиксации потенциала (voltage clamp), что является общепринятой практикой [20]. Литература 1. Kodirov S.A. et al. [Superfamily of voltage dependent K+ channels: structure, functions and pathology]. // Tsitologiia. 2010. Vol. 52, № 9. P. 697–714. 2. Zhu S. et al. Molecular diversity and functional evolution of scorpion potassium channel toxins. // Mol. Cell. Proteomics. 2011. Vol. 10, № 2. P. M110.002832. 3. Ocaña M. et al. Potassium channels and pain: present realities and future opportunities. // Eur. J. Pharmacol. 2004. Vol. 500, № 1–3. P. 203–219. 4. Wulff H., Zhorov B.S. K+ channel modulators for the treatment of neurological disorders and autoimmune diseases. // Chem. Rev. 2008. Vol. 108, № 5. P. 1744–1773. 5. Pardo L.A., Stühmer W. The roles of K(+) channels in cancer. // Nat. Rev. Cancer. 2014. Vol. 14, № 1. P. 39–48. 6. Kale V.P., Amin S.G., Pandey M.K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 2015. Vol. 1848, № 10. P. 2747–2755. 7. Zhao Y. et al. Toxins Targeting the KV1.3 Channel: Potential Immunomodulators for Autoimmune Diseases // Toxins (Basel). 2015. Vol. 7, № 5. P. 1749–1764. 8. Breland A.E., Currier R.D. Scorpion venom and multiple sclerosis. // Lancet (London, England). 1983. Vol. 2, № 8357. P. 1021. 9. Lewis R.J., Garcia M.L. Therapeutic potential of venom peptides. // Nat. Rev. Drug Discov. 2003. Vol. 2, № 10. P. 790–802. 10. Wulff H., Castle N.A., Pardo L.A. Voltage-gated potassium channels as therapeutic targets. // Nat. Rev. Drug Discov. 2009. Vol. 8, № 12. P. 982–1001. 11. Koromyslova A.D., Chugunov A.O., Efremov R.G. Deciphering fine molecular details of proteins’ structure and function with a Protein Surface Topography (PST) method. // J. Chem. Inf. Model. 2014. Vol. 54, № 4. P. 1189–1199. 12. Chugunov A.O. et al. Modular organization of α-toxins from scorpion venom mirrors domain structure of their targets, sodium channels. // J. Biol. Chem. 2013. Vol. 288, № 26. P. 19014–19027. 13. Kasheverov I.E. et al. High-Affinity α-Conotoxin PnIA Analogs Designed on the Basis of the Protein Surface Topography Method // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 6, № October. P. 36848. 14. Kasheverov I.E. et al. Rational design of new ligands for nicotinic receptors on the basis of α-conotoxin PnIA. // Dokl. Biochem. Biophys. 2015. Vol. 461. P. 106–109. 15. Kuzmenkov A.I. et al. C-Terminal residues in small potassium channel blockers OdK1 and OSK3 from scorpion venom fine-tune the selectivity // Biochim. Biophys. Acta - Proteins Proteomics. 2017. 16. Kuzmenkov A.I. et al. Kalium: A database of potassium channel toxins from scorpion venom // Database. 2016. Vol. 2016. 17. Banerjee A. et al. Structure of a pore-blocking toxin in complex with a eukaryotic voltage-dependent K(+) channel. // Elife. 2013. Vol. 2. P. e00594. 18. Abraham M.J. et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers // SoftwareX. 2015. Vol. 1. P. 19–25. 19. Pluzhnikov K. et al. omega-Lsp-IA, a novel modulator of P-type Ca2+ channels. // Toxicon. 2007. Vol. 50, № 7. P. 993–1004. 20. Kuzmenkov A.I. et al. Variability of Potassium Channel Blockers in Mesobuthus eupeus Scorpion Venom with Focus on Kv1.1: AN INTEGRATED TRANSCRIPTOMIC AND PROTEOMIC STUDY. // J. Biol. Chem. 2015. Vol. 290, № 19. P. 12195–12209.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---